程禹，邵輝，劉春艷，楊云艷，楊麗靜，閆琳，林宏芳，郭永澤

天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(天津)，天津 300381

農(nóng)藥在減少病蟲害、保證農(nóng)業(yè)豐產(chǎn)豐收等方面發(fā)揮著重要作用，已成為當(dāng)今農(nóng)業(yè)不可或缺的重要生產(chǎn)資料。據(jù)統(tǒng)計(jì)，使用農(nóng)藥可使糧食損失減少約30%[1]。2020年中央一號(hào)文件中，對(duì)標(biāo)全面建成小康社會(huì)，提出治理農(nóng)村生態(tài)環(huán)境突出問(wèn)題，深入開(kāi)展農(nóng)藥化肥減量行動(dòng)。近幾年來(lái)，農(nóng)藥使用帶來(lái)的環(huán)境安全問(wèn)題引起了人們的廣泛關(guān)注。因此，研究“高效、低風(fēng)險(xiǎn)”的農(nóng)藥，對(duì)安全合理使用農(nóng)藥，推進(jìn)綠色發(fā)展意義重大。

近些年，在我國(guó)的許多地區(qū)，尤其是廣西省和福建省，柑橘潰瘍病的發(fā)病率較高，且發(fā)病程度也較重。潰瘍病直接影響柑橘的產(chǎn)量[2]。隨著柑橘種植面積的擴(kuò)大，果實(shí)品質(zhì)差異較大，其中柑橘潰瘍病是影響果實(shí)品質(zhì)的主要因素之一[3]。柑橘潰瘍病的“火山口”的病斑癥狀可以說(shuō)早已深入人心。危害嚴(yán)重時(shí)造成樹(shù)勢(shì)衰弱，落葉、枯梢、落果，病害上果后嚴(yán)重影響果實(shí)外觀品質(zhì)。而且，柑橘潰瘍病傳播途徑廣、傳染迅速、病菌生存能力強(qiáng)，目前仍無(wú)有效途徑完全根治，因此也被世界上各大柑橘主產(chǎn)國(guó)列入檢疫性病害名單[4]。

當(dāng)前防治柑橘潰瘍病的有效藥劑主要是銅制劑及農(nóng)用抗生素[5]。氫氧化銅水分散粒劑是一種銅基殺菌劑，對(duì)預(yù)防保護(hù)柑橘潰瘍病，有著良好的效果[6]。它的殺菌作用主要靠銅離子，銅離子被萌發(fā)的孢子吸收，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，就可以殺死孢子細(xì)胞，從而起到殺菌作用。從而有效防治作物的細(xì)菌及真菌性病害，對(duì)柑橘潰瘍病、黃瓜角斑病尤其高效。微量的Cu對(duì)植物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。一般植物葉片的正常Cu含量為5～30 mg·kg-1，高于30 mg·kg-1時(shí)則可能引起中毒[7]。

目前，Cu2+對(duì)陸生生物毒性的研究報(bào)道為數(shù)不多，氫氧化銅原藥對(duì)小白鼠急性經(jīng)口毒性為中毒，急性接觸為低毒[8]，本文參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》(GB/T 31270—2014)[9-13]和《化學(xué)農(nóng)藥天敵(瓢蟲)急性接觸毒性試驗(yàn)準(zhǔn)則》(NY/T 3088—2017)[14]，對(duì)6種模式陸生生物：日本鵪鶉(Coturnixjaponica)、蜜蜂(ApismelliferaL.)、家蠶(Bombyxmori)、赤眼蜂(Trichogrammadendrolimi)、七星瓢蟲(Coccinellaseptempunctata)和蚯蚓(Eiseniafoetida)進(jìn)行急性毒性測(cè)試，進(jìn)而評(píng)估污染物特別是農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的影響。急性毒性試驗(yàn)即單次給藥毒性試驗(yàn)，指機(jī)體(人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物)1次(或24 h內(nèi)多次)接觸外來(lái)化合物之后所引起的中毒效應(yīng)，甚至死亡。急性毒性試驗(yàn)是推測(cè)新農(nóng)藥對(duì)非靶標(biāo)生物進(jìn)行毒性分級(jí)的重要手段。但按照我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，農(nóng)藥的毒性一般按急性毒性終點(diǎn)值的大小來(lái)劃分，這樣會(huì)導(dǎo)致一些低毒，但具有致癌、致突變等慢性毒性的農(nóng)藥被錯(cuò)誤地劃歸為低毒農(nóng)藥范疇。還要注意的是低毒農(nóng)藥如果應(yīng)用范圍廣、暴露量大，則其危險(xiǎn)性也可能很高，因此單純用毒性指標(biāo)來(lái)衡量農(nóng)藥的安全性顯然是不適當(dāng)?shù)摹Ｋ愿鶕?jù)我國(guó)頒布的《農(nóng)藥登記 環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指南》(NY/T 2882—2016)[15]，使用China-PEARL模型預(yù)測(cè)農(nóng)藥在地下水中的環(huán)境暴露濃度和PECsoil_SFO_China模型預(yù)測(cè)的在土壤中的環(huán)境暴露濃度，對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行全面環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是很有必要的。本文旨在通過(guò)對(duì)77%氫氧化銅水分散粒劑在防治柑橘潰瘍病過(guò)程中，對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害特性和暴露程度進(jìn)行系統(tǒng)全面評(píng)估，為其農(nóng)藥登記風(fēng)險(xiǎn)管理提供一定的科學(xué)理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

1.1.1 供試農(nóng)藥

77%氫氧化銅水分散粒劑由山東迦奇生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2 供試生物

試驗(yàn)生物為日本鵪鶉(Coturnixjaponica)，由天津市武清興匯養(yǎng)殖場(chǎng)提供，該試驗(yàn)生物引入實(shí)驗(yàn)室5～7 d，馴養(yǎng)死亡率<5%，生長(zhǎng)狀態(tài)符合該物種生長(zhǎng)規(guī)律，來(lái)自同一個(gè)母本種群，且同一天孵化。飼喂飼料為秦皇島市奧極飼料有限公司生產(chǎn)的“奧極牌102蛋鵪鶉配合飼料”。意大利成年工蜂(ApismelliferaL.)為供試生物，供試生物由北京密云東菜園養(yǎng)蜂廠引種，為來(lái)自同一種群的成年工蜂，年齡相同、飼喂?fàn)顩r一致，并營(yíng)養(yǎng)良好、健康。以菁松×皓月為供試家蠶(BombyxmoriL.)，由山東廣通蠶種集團(tuán)有限公司提供，以蛻皮時(shí)間和大小相近的二齡起蠶為試驗(yàn)生物材料。以松毛蟲赤眼蜂(Trichogrammadendrolimi)為供試生物，供試卵卡由廣東省昆蟲研究所提供。在試驗(yàn)前，從冰箱(-4 ℃)中取出試驗(yàn)所需量的寄生米蛾卵或卵卡，每個(gè)指形管中裝入約0.2 mL寄生米蛾卵或1/8張卵卡，封閉管口，放入溫度為(25±2) ℃、相對(duì)濕度為50%～80%的培養(yǎng)室(黑暗條件)開(kāi)始羽化培養(yǎng)。羽化培養(yǎng)期間，需要定時(shí)檢查羽化情況，從出現(xiàn)羽化的成蟲開(kāi)始計(jì)時(shí)，使用開(kāi)始羽化后48 h內(nèi)羽化的成蜂。赤子愛(ài)勝蚓(Eiseniafoetida)，購(gòu)自天津市賈立明蚯蚓養(yǎng)殖有限公司，挑選已出現(xiàn)繁殖環(huán)帶的、體質(zhì)量在400～500 mg之間的健康成年蚯蚓用于試驗(yàn)，購(gòu)入后在室溫20 ℃條件下避光馴養(yǎng)。以七星瓢蟲(Coccinellaseptempunctata)為供試生物，供試卵卡由北京市農(nóng)林科學(xué)院提供，采用孵化3～4 d的二齡幼蟲。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 參比試驗(yàn)

采用99.9%樂(lè)果標(biāo)準(zhǔn)品作為參比物質(zhì)進(jìn)行蜜蜂經(jīng)口、蜜蜂接觸、家蠶接觸、天敵瓢蟲接觸敏感性檢查。采用99%氯乙酰胺作為參比物質(zhì)進(jìn)行蚯蚓敏感性檢查。試驗(yàn)過(guò)程根據(jù)國(guó)家頒布的《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》(GB/T 31270—2014)[9-13]和《化學(xué)農(nóng)藥天敵(瓢蟲)急性接觸毒性試驗(yàn)準(zhǔn)則》(NY/T 3088—2017)[14]進(jìn)行。

1.2.2 鳥(niǎo)類毒性試驗(yàn)

參照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD)試驗(yàn)準(zhǔn)則和我國(guó)頒布的《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》，先以各試驗(yàn)的最高濃度和最低濃度，設(shè)置較大極差的4～5個(gè)劑量組，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)求出最高全存活劑量和最低全致死劑量。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正式試驗(yàn)設(shè)置120.6、144.7、173.6、208.3、250.0、300.0和360.0 mg a.i.·(kg bw)-1共7個(gè)劑量組，稱量試驗(yàn)用鵪鶉體質(zhì)量，根據(jù)設(shè)計(jì)的分組劑量按1.0 mL·(100 g bw)-1計(jì)算給藥體積，將配制好的試驗(yàn)藥液按計(jì)算體積一次性經(jīng)口灌入鵪鶉體內(nèi)，即可得到上述設(shè)計(jì)劑量組，并設(shè)空白對(duì)照組。每處理1次重復(fù)，每處理組10只鵪鶉，雌雄各半，試驗(yàn)周期7 d。

1.2.3 蜜蜂急性接觸毒性試驗(yàn)

預(yù)實(shí)驗(yàn)方法同1.2.2，根據(jù)結(jié)果，設(shè)置100.0 μg a.i.·蜂-1劑量組，藥劑使用蒸餾水溶解，并設(shè)空白對(duì)照和助溶劑對(duì)照組(每只蜂點(diǎn)滴1.0 μL的體積分?jǐn)?shù)為0.1%吐溫-80水溶液)。處理組和對(duì)照組均設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只蜜蜂。將蜜蜂引入三角瓶?jī)?nèi)，用紗布封口，通入N2將蜜蜂麻醉，用電動(dòng)移液器分別點(diǎn)滴1.000×105mg a.i.·L-1供試藥液1.0 μL于蜜蜂中胸背板處，待蜂身晾干后轉(zhuǎn)入試驗(yàn)籠中，用50%(m/V)蔗糖水飼喂。

1.2.4 蜜蜂急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

預(yù)實(shí)驗(yàn)方法同1.2.2，根據(jù)結(jié)果，設(shè)置1.66、2.82、4.79、8.14、13.8和23.5 μg a.i.·蜂-1，將蜜蜂引入試驗(yàn)籠中，每個(gè)籠中10只試驗(yàn)用蜂。將藥液與50%蔗糖水以體積比1∶1混勻，然后在飼喂器(2 mL離心管)中加入200 μL含有不同濃度供試物的50%蔗糖水溶液(m/V)，并對(duì)每組藥液的消耗量進(jìn)行測(cè)定。一旦藥液消耗完，將食物容器取出，換用不含供試物的蔗糖水進(jìn)行飼喂(不限量)。對(duì)于異味較濃的農(nóng)藥，有時(shí)蜜蜂拒絕進(jìn)食，從而導(dǎo)致食物消耗很少或幾乎沒(méi)有消耗的，最多延長(zhǎng)至6 h，并對(duì)食物的消耗量進(jìn)行測(cè)定(即測(cè)定該處理的食物殘存質(zhì)量)。

1.2.5 家蠶急性毒性試驗(yàn)

預(yù)實(shí)驗(yàn)方法同1.2.2，根據(jù)結(jié)果，設(shè)置416、553、735、978、1.30×103、1.73×103和2.30×103mg a.i.·L-1這7個(gè)濃度組，藥劑使用蒸餾水溶解，并設(shè)空白對(duì)照組。處理組和對(duì)照組均設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20頭蠶。在培養(yǎng)皿內(nèi)飼養(yǎng)二齡起蠶，用不同濃度的藥液完全浸漬桑葉10 s，晾干后供蠶食用。整個(gè)試驗(yàn)期間飼喂藥劑處理后的桑葉。

1.2.6 赤眼蜂急性毒性試驗(yàn)

預(yù)實(shí)驗(yàn)方法同1.2.2，根據(jù)結(jié)果，設(shè)置2.772×10-4、5.544×10-4、1.109×10-3、2.218×10-3和4.435×10-3mg a.i.·cm-2這5個(gè)濃度組，在指形管中加入1 mL藥液，將藥液在指形管中充分滾吸晾干形成藥膜管，然后將供試赤眼蜂放入藥膜管中爬行1 h后轉(zhuǎn)入無(wú)藥指形管中，以棉線浸漬10%蜂蜜水飼喂，并用黑布封住管口，在人工氣候箱中培養(yǎng)。

1.2.7 七星瓢蟲急性毒性試驗(yàn)

預(yù)實(shí)驗(yàn)方法同1.2.2，根據(jù)結(jié)果，設(shè)置485.1 g a.i.·hm-2的濃度，在指形管中加入配制的試驗(yàn)藥液1 mL，采用烤腸機(jī)將藥液在指形管中充分滾吸晾干形成藥膜管。然后將二齡供試瓢蟲幼蟲單頭接入藥膜管中，給予足量的活幼蚜供瓢蟲取食，并以紗布封緊管口，以后每天飼喂充足的活蚜蟲作為食物，飼喂蚜蟲前需將殘余的蚜蟲清理干凈，以保證瓢蟲充分接觸藥膜。對(duì)照組的瓢蟲數(shù)量與處理組相同，并與處理組同時(shí)進(jìn)行。指形管應(yīng)平放，保證瓢蟲能夠自由爬行減少重力對(duì)其的不利影響。本次試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)處理組和對(duì)照組，對(duì)照組和處理組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為10頭二齡瓢蟲幼蟲。

1.2.8 蚯蚓急性毒性試驗(yàn)

預(yù)實(shí)驗(yàn)方法同1.2.2，根據(jù)結(jié)果，參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對(duì)蚯蚓急性毒性試驗(yàn)方法中的人工土壤法，移取7.500×103mg a.i.·L-1一級(jí)儲(chǔ)備液20.00 mL加入到1 500 g人工土壤中，加入適量的蒸餾水調(diào)節(jié)土壤含水量，占土壤干質(zhì)量的30%～35%，充分?jǐn)嚢枋顾幬锱c土壤混合均勻，得到100.0 mg a.i.·(kg干土)-1共1個(gè)濃度水平；然后將此濃度水平的土壤平均分裝于3個(gè)標(biāo)本瓶，制成一個(gè)濃度所需的3個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理放入蚯蚓10條，并設(shè)置空白對(duì)照。用紗布扎好瓶口，在人工氣候箱中培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 20.0[16]統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)算日本鵪鶉每一觀察時(shí)間的半致死劑量(LD50)和95%置信限，計(jì)算蜜蜂接觸和經(jīng)口試驗(yàn)的24 h和48 h的死亡率、LD50值及95%置信限，計(jì)算家蠶急性毒性試驗(yàn)的半數(shù)致死濃度(LC50)包括24 h-LC50、48 h-LC50、72 h-LC50、96 h-LC50值及其95%置信限，計(jì)算赤眼蜂24 h半致死用量(24 h-LR50)和95%置信限，計(jì)算瓢蟲48 h、96 h、蛹前(13 d)、成蟲前(18 d)的LR50和95%置信限，計(jì)算對(duì)赤子愛(ài)勝蚯蚓的7 d-LC50、14 d-LC50和95%置信限。

1.4 評(píng)估數(shù)據(jù)獲取

本研究涉及有效成分為氫氧化銅，進(jìn)行農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估需要的數(shù)據(jù)主要有理化性質(zhì)、環(huán)境相關(guān)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及生態(tài)毒性數(shù)據(jù)等，數(shù)據(jù)主要來(lái)本實(shí)驗(yàn)室(天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所)、歐洲食品安全局(European Food Safety Authority, EFSA)和農(nóng)藥性質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Pesticide Properties DataBase, PPDB)。本實(shí)驗(yàn)室毒性終點(diǎn)數(shù)據(jù)均根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》(GB/T 31270—2014)[9-13]和《化學(xué)農(nóng)藥天敵(瓢蟲)急性接觸毒性試驗(yàn)準(zhǔn)則》(NY/T 3088—2017)[14]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)獲得的。77%氫氧化銅水分散粒劑使用方法列于表1中，理化性質(zhì)和環(huán)境歸趨數(shù)據(jù)列于表2中，生態(tài)毒理數(shù)據(jù)列于表3中。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 鳥(niǎo)類急性毒性試驗(yàn)結(jié)果和風(fēng)險(xiǎn)表征

2.1.1 77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)鳥(niǎo)類急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)試結(jié)果顯示，空白對(duì)照組未觀察到中毒癥狀；處理組鵪鶉出現(xiàn)活動(dòng)減少、呆滯、攝食和攝水量減少、站立不穩(wěn)等癥狀。對(duì)鵪鶉急性經(jīng)口半致死劑量(7 d-LD50)為225.9 mg a.i.·(kg bw)-1，7 d-LD50的95%置信限為183.3～292.1 mg a.i.·(kg bw)-1，回歸方程為Y=3.78175X-8.90196，回歸系數(shù)R2=0.934，毒性等級(jí)為“中毒”。

表1 氫氧化銅的使用方法Table 1 Method of copper hydroxide application

表2 氫氧化銅的理化性質(zhì)和環(huán)境歸趨數(shù)據(jù)Table 2 Physicochemical properties and environmental fate data of copper hydroxide

表3 氫氧化銅的生態(tài)毒性數(shù)據(jù)Table 3 Ecotoxicity data of copper hydroxide

2.1.2 鳥(niǎo)類環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)暴露分析

根據(jù)被評(píng)估物質(zhì)77%氫氧化銅水分散粒劑的施藥信息，暴露途徑為農(nóng)藥噴霧，推薦的單位面積農(nóng)藥最高施藥劑量(AR)為277.2 g a.i.·hm-2，選擇暴露場(chǎng)景為“果園和觀賞植物/苗圃類”，小型食蟲鳥(niǎo)類作為指示物種，此情形下，選擇77%氫氧化銅水分散粒劑施藥3次對(duì)鳥(niǎo)類急性的預(yù)測(cè)暴露劑量(PED)按式(1)計(jì)算[15]，計(jì)算涉及的參數(shù)及計(jì)算結(jié)果如表4所示。

PEDacute=FIRbw·d×RUD90×AR×MAF90×10-3

(1)

式中：PEDacute為急性預(yù)測(cè)暴露劑量(mg a.i.·(kg bw·d)-1)；FIRbw·d為指示物種單位體質(zhì)量單位時(shí)間食物攝取量(g·(g bw·d)-1)；RUD90為第90百分位單位面積施藥劑量的食物農(nóng)藥殘留量((mg a.i.·(kg食物)-1)/(kg a.i.·hm-2))；AR為單位面積農(nóng)藥最高施藥劑量(g a.i.·hm-2)；MAF90為RUD90對(duì)應(yīng)的多次施藥因子。

2.1.3 鳥(niǎo)類環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)分析

77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)鳥(niǎo)類急性試驗(yàn)的毒性終點(diǎn)值列于表5中，按式(2)計(jì)算預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)劑量(PNED)[15]，計(jì)算涉及的參數(shù)及計(jì)算結(jié)果如表5所示。

(2)

式中：PNED為預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)劑量(mg a.i.·(kg bw·d)-1)；EnP為毒性試驗(yàn)終點(diǎn)(mg a.i.·(kg bw·d)-1)；UF為不確定性因子。

2.1.4 鳥(niǎo)類環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)表征

風(fēng)險(xiǎn)表征值通過(guò)式(3)計(jì)算[15]。初級(jí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果表明，77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)鳥(niǎo)類急性風(fēng)險(xiǎn)可接受。計(jì)算參數(shù)與計(jì)算結(jié)果如表6所示。

表4 鳥(niǎo)類風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的77%氫氧化銅水分散粒劑急性預(yù)測(cè)暴露劑量Table 4 Risk assessment of birds: Acute predicted exposure dose of 77% copper hydroxide aqueous dispersion granule

(3)

式中：RQ為風(fēng)險(xiǎn)商值；若RQ≤1，風(fēng)險(xiǎn)可接受；若RQ>1，風(fēng)險(xiǎn)不可接受。

2.2 蜜蜂急性毒性試驗(yàn)結(jié)果和風(fēng)險(xiǎn)表征

2.2.1 蜜蜂急性接觸毒性參比試驗(yàn)結(jié)果

98.5%樂(lè)果對(duì)蜜蜂急性接觸毒性的24 h-LD50為0.174 μg a.i.·蜂-1，其95%置信區(qū)間為0.155～0.210 μg a.i.·蜂-1，在0.10～0.30 μg a.i.·蜂-1之間，表明試驗(yàn)試材和體系符合要求，試驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.2.2 蜜蜂急性經(jīng)口毒性參比試驗(yàn)結(jié)果

98.5%樂(lè)果對(duì)蜜蜂急性經(jīng)口毒性的24 h-LD50為0.103 μg a.i.·蜂-1，其95%置信區(qū)間為0.0829～0.143 μg a.i.·蜂-1，在0.10～0.35 μg a.i.·蜂-1之間，表明試驗(yàn)試材和體系符合要求，試驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.2.3 77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)蜜蜂急性接觸毒性試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)試結(jié)果顯示，空白對(duì)照組未觀察到中毒癥狀；處理組蜜蜂也未觀察到中毒癥狀，對(duì)蜜蜂急性接觸LD50為>100 μg a.i.·蜂-1，毒性等級(jí)為“低毒”。

2.2.4 77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)蜜蜂急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)試結(jié)果顯示，空白對(duì)照組未觀察到中毒癥狀；處理組蜜蜂出現(xiàn)腹部膨脹、顯著的激動(dòng)和不安、對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍等癥狀。對(duì)蜜蜂急性經(jīng)口48 h-LD50為6.19 μg a.i.·蜂-1，其95%置信限為5.21～7.96 μg a.i.·蜂-1，回歸方程為Y=1.5692+4.3340X，回歸系數(shù)R2=0.8720，毒性等級(jí)為“中毒”。

2.2.5 蜜蜂環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)暴露分析

根據(jù)被評(píng)估物77%氫氧化銅水分散粒劑的良好農(nóng)業(yè)規(guī)范(Good Agricultural Practice, GAP)信息可知，AR為277.2 g a.i.·hm-2，使用方法為噴霧施藥，初級(jí)暴露分析中不計(jì)算PED，采用農(nóng)藥AR作為暴露量。

2.2.6 蜜蜂環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)分析

噴霧施藥不計(jì)算PNED，僅使用蜜蜂急性經(jīng)口或接觸毒性中毒性較高的LD50，當(dāng)同時(shí)具備有效成分及其制劑產(chǎn)品的LD50時(shí)，應(yīng)選擇毒性較高的數(shù)據(jù)。如表4所示，77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)蜜蜂急性經(jīng)口LD50為6.19 μg a.i.·蜂-1，對(duì)蜜蜂急性接觸LD50為>100 μg a.i.·蜂-1；氫氧化銅原藥對(duì)蜜蜂急性經(jīng)口LD50為49.0 μg a.i.·蜂-1，對(duì)蜜蜂急性接觸LD50為>44.46 μg a.i.·蜂-1。因此選擇制劑對(duì)蜜蜂急性經(jīng)口LD50，為6.19 μg a.i.·蜂-1。

2.2.7 蜜蜂環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)表征

通過(guò)下式根據(jù)農(nóng)藥單次最高施藥劑量和毒性較高的急性經(jīng)口半致死劑量計(jì)算噴施農(nóng)藥77%氫氧化銅水分散粒劑暴露場(chǎng)景的風(fēng)險(xiǎn)商值(RQsp)。

(4)

RQsp<1，風(fēng)險(xiǎn)可接受。

2.3 家蠶急性毒性試驗(yàn)結(jié)果和風(fēng)險(xiǎn)表征

2.3.1 家蠶急性毒性參比試驗(yàn)結(jié)果

98.5%樂(lè)果對(duì)家蠶急性毒性的96 h-LC50為1.34×103mg a.i.·L-1，在標(biāo)準(zhǔn)要求范圍內(nèi)，本試驗(yàn)結(jié)果可靠。

表5 鳥(niǎo)類風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的77%氫氧化銅水分散粒劑毒性終點(diǎn)及預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)劑量(PNED)Table 5 Risk assessment of birds: Toxicity endpoints and predicted no effect dose (PNED) of 77% copper hydroxide aqueous dispersion granule

表6 鳥(niǎo)類風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的77%氫氧化銅水分散粒劑初級(jí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果Table 6 Risk assessment of birds: The primary risk assessment results of 77% copper hydroxide aqueous dispersion granule

2.3.2 77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)家蠶急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)試結(jié)果顯示，空白對(duì)照組未觀察到中毒癥狀；處理組家蠶出現(xiàn)拒食或攝食減少、吐絲、吐液、對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍等癥狀。對(duì)家蠶急性經(jīng)口96 h-LC50為2.08×103mg a.i.·L-1，其95%置信限為1.80×103～2.60×103mg a.i.·L-1，回歸方程為Y=-7.0096+3.6197X，相關(guān)系數(shù)R2=0.9738，毒性等級(jí)為“低毒”。

2.3.3 家蠶環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)暴露分析

根據(jù)被評(píng)估物質(zhì)77%氫氧化銅水分散粒劑的GAP信息，可知暴露場(chǎng)景為飄移場(chǎng)景，根據(jù)式(4)～式(7)分別計(jì)算多次施藥最外圍、次外圍桑樹(shù)上的預(yù)測(cè)暴露濃度(PEC)、多次施藥因子(MAF)、桑葉上農(nóng)藥的降解系數(shù)(DFPHI)。

PECma-fr=AR×PDFfr×RUD95×MAF×DFPHI

(5)

式中：PECma-fr為多次施藥后最外圍一行桑樹(shù)預(yù)測(cè)暴露濃度(mg a.i.·(kg桑葉)-1)；AR為單位面積農(nóng)藥最高施用量(kg a.i.·hm-2)；PDFfr為最外圍一行桑樹(shù)上的漂移因子；RUD95為桑樹(shù)上第95百分位的單位施藥劑量的桑葉農(nóng)藥殘留量((mg a.i.·(kg桑葉)-1)/(kg a.i.·hm-2))；MAF為多次施藥因子；DFPHI為桑葉上農(nóng)藥的降解系數(shù)。

PECma-sr=AR×PDFsr×RUD95×MAF×DFPHI

(6)

式中：PECma-sr為多次施藥后次外圍一行桑樹(shù)預(yù)測(cè)暴露濃度(mg a.i.·(kg桑葉)-1)；PDFsr為次外圍一行桑樹(shù)上的漂移因子。

(7)

式中：n為施藥次數(shù)；i為施藥間隔期(d)；DT50為農(nóng)藥在桑葉上的降解半衰期(d)。

(8)

式中：PHI為農(nóng)藥最后一次使用距離桑葉采收的間隔期(d)，計(jì)算時(shí)DT50=10(默認(rèn)值)，PHI=1(默認(rèn)值)，n=1，其他數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果如表7所示。

2.3.4 家蠶環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)分析

被評(píng)估物質(zhì)77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)家蠶毒性終點(diǎn)LC50-GB為2 080 mg·L-1，通過(guò)式(9)計(jì)算修正半致死濃度(LC50-C)，通過(guò)式(10)計(jì)算PNEC，計(jì)算結(jié)果如表8所示。

表7 家蠶風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的77%氫氧化銅水分散粒劑預(yù)測(cè)暴露濃度(PEC)計(jì)算結(jié)果Table 7 Risk assessment of silkworms: Predicted exposure concentrations (PEC) of 77% copper hydroxide aqueous dispersion granule

表8 家蠶風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的77%氫氧化銅水分散粒劑預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)濃度(PNEC)計(jì)算結(jié)果Table 8 Risk assessment of silkworm: Predicted no effect concentration (PNEC) of 77% copper hydroxide aqueous dispersion granule

LC50-C=LC50-GB×FC

(9)

式中：LC50-C為修正半致死濃度(mg a.i.·(kg桑葉)-1)；FC為修正系數(shù)(L·(kg桑葉)-1)。

(10)

式中：PNEC為預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)濃度(mg a.i.·(kg桑葉)-1)；EnP為試驗(yàn)得出的毒性終點(diǎn)(mg a.i.·(kg桑葉)-1)；UF為不確定性因子。

2.3.5 家蠶環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)表征

初級(jí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果表明，77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)家蠶風(fēng)險(xiǎn)可接受。根據(jù)式(11)計(jì)算RQ，計(jì)算結(jié)果如表9所示。

(11)

式中：RQ為風(fēng)險(xiǎn)商值；若RQ≤1，風(fēng)險(xiǎn)可接受；若RQ>1，風(fēng)險(xiǎn)不可接受。

2.4 非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)結(jié)果和風(fēng)險(xiǎn)表征2.4.1非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物急性毒性參比試驗(yàn)結(jié)果

98.5%樂(lè)果在0.20 g·hm-2劑量時(shí)，七星瓢蟲幼蟲死亡率為53.3%，在40%～80%之間，符合標(biāo)準(zhǔn)要求范圍，表明試驗(yàn)試材和體系符合要求，試驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.4.2 77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)赤眼蜂急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)試結(jié)果顯示，空白對(duì)照組未觀察到中毒癥狀；處理組赤眼蜂出現(xiàn)觸角不動(dòng)、對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍等癥狀。對(duì)赤眼蜂急性24 h-LR50為1.690×10-3mg a.i.·cm-2，其95%置信限為1.200×10-3～2.590×10-3mg a.i.·cm-2，回歸方程為Y=3.70131+1.33547X，回歸系數(shù)R2=0.9649，毒性等級(jí)為“低毒”。

2.4.3 77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)七星瓢蟲急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)試結(jié)果顯示，空白對(duì)照組未觀察到中毒癥狀；處理組也未觀察到中毒癥狀，77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)瓢蟲急性接觸18 d-LR50>485.1 g a.i.·hm-2，毒性等級(jí)為“低毒”。

2.4.4 非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)暴露分析

根據(jù)被評(píng)估物質(zhì)77%氫氧化銅水分散粒劑GAP信息，通過(guò)式(12)和式(13)分別計(jì)算該物質(zhì)在農(nóng)田內(nèi)、農(nóng)田外的預(yù)測(cè)暴露用量(PER)，通過(guò)式(14)計(jì)算MAF，通過(guò)式(15)計(jì)算農(nóng)藥在植株表面的降解速率常數(shù)(k)。計(jì)算參數(shù)與計(jì)算結(jié)果如表10所示。

農(nóng)田內(nèi)暴露分析

PERin=AR×MAF

(12)

式中：PERin為農(nóng)田內(nèi)預(yù)測(cè)暴露用量(g a.i.·hm-2)；AR為推薦的農(nóng)藥有效成分單位面積最高施藥量(g a.i.·hm-2)；MAF為多次施藥因子。

農(nóng)田外暴露分析

(13)

表9 家蠶風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的77%氫氧化銅水分散粒劑初級(jí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果Table 9 Risk assessment of silkworms: Primary risk assessment of 77% copper hydroxide aqueous dispersion granule

表10 非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的77%氫氧化銅水分散粒劑預(yù)測(cè)暴露用量(PER)計(jì)算參數(shù)與計(jì)算結(jié)果Table 10 Non-target arthropod risk assessment: Predicted exposure dosage (PER) calculation parameters and results of 77% copper hydroxide aqueous dispersion granule

式中：PERoff為農(nóng)田外預(yù)測(cè)暴露用量(g a.i.·hm-2)；PDF為農(nóng)藥飄移因子；VDF為農(nóng)藥植被分布因子。

(14)

式中：n為施藥次數(shù)；k為農(nóng)藥在植株表面的降解速率常數(shù)；i為施藥間隔期(d)。

(15)

式中：DT50為農(nóng)藥在植株表面的降解半衰期(d)。

2.4.5 非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)表征

選擇代表物種的LR50，當(dāng)同一類型的非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物(NATs)有多個(gè)LR50值時(shí)，選擇最敏感的LR50值，因此對(duì)寄生性天敵LR50值選擇蚜繭蜂天敵的LR50，為50 g a.i.·hm-2。農(nóng)田內(nèi)危害商值(HQin)、農(nóng)田外危害商值(HQoff)分別按式(16)和式(17)計(jì)算，計(jì)算結(jié)果如表11所示，UF采用默認(rèn)值5。HQ≤5，表明風(fēng)險(xiǎn)可接受；HQ>5，表明風(fēng)險(xiǎn)不可接受。

(16)

(17)

根據(jù)被評(píng)估物質(zhì)77%氫氧化銅水分散粒劑的GAP信息，77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物進(jìn)行農(nóng)田內(nèi)和農(nóng)田外風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。分別得到：對(duì)寄生性天敵赤眼蜂HQin=9.702>5，HQoff=2.325<5；對(duì)捕食性天敵瓢蟲HQin=1.000<5，HQoff=0.2396<5。因此，77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)農(nóng)田內(nèi)寄生性天敵赤眼蜂風(fēng)險(xiǎn)不可接受；對(duì)農(nóng)田內(nèi)及農(nóng)田外捕食性天敵瓢蟲、農(nóng)田外寄生性天敵赤眼蜂風(fēng)險(xiǎn)均可接受。

2.5 蚯蚓急性毒性試驗(yàn)結(jié)果和風(fēng)險(xiǎn)表征

2.5.1 蚯蚓急性毒性參比試驗(yàn)結(jié)果

氯乙酰胺對(duì)蚯蚓急性毒性14 d-LC50為45.1 mg a.i.·(kg干土)-1，在20～80 mg a.i.·(kg干土)-1之間，本試驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.5.2 77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)蚯蚓急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

空白對(duì)照組未觀察到中毒癥狀；處理組也未觀察到中毒癥狀，77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)蚯蚓急性14 d-LC50>100.0 mg a.i.·(kg干土)-1，毒性等級(jí)為“低毒”。

2.5.3 土壤生物環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)暴露分析

根據(jù)被評(píng)估物77%氫氧化銅水分散粒劑的生態(tài)毒性數(shù)據(jù)及施藥信息，對(duì)土壤生物采用PECsoil_SFO_China模型進(jìn)行初級(jí)急性暴露分析。初級(jí)急性暴露分析使用PECsoilaccu, overall作為預(yù)測(cè)土壤環(huán)境濃度，PECsoil,accu,overall為7 998 mg·kg-1。PECsoil_SFO_China模型輸入?yún)?shù)及輸出結(jié)果如表12所示。

2.5.4 土壤生物環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)分析

采用生態(tài)毒理學(xué)研究得出的毒性終點(diǎn)及相應(yīng)的不確定因子進(jìn)行預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)濃度(PNEC)計(jì)算，PNEC按式(18)計(jì)算。計(jì)算涉及的參數(shù)及計(jì)算結(jié)果如表13所示。

(18)

式中：PNEC表示預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)濃度；Endpoint表示試驗(yàn)毒性終點(diǎn)，如LC50、25%效應(yīng)濃度(EC25)、無(wú)觀察效應(yīng)濃度(NOEC)等；UF表示不確定性因子。

2.5.5 土壤生物環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)表征

風(fēng)險(xiǎn)商值(RQ)按式(19)計(jì)算。計(jì)算涉及的參數(shù)及計(jì)算結(jié)果如表14表示。

(19)

式中：RQ表示風(fēng)險(xiǎn)商值；PEC表示預(yù)測(cè)土壤環(huán)境濃度；PNEC表示對(duì)土壤生物預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)濃度。當(dāng)RQ≤1，風(fēng)險(xiǎn)可接受；當(dāng)RQ>1，則表明風(fēng)險(xiǎn)不可接受。

表11 非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的77%氫氧化銅水分散粒劑危害商值(HQ)計(jì)算結(jié)果Table 11 Non-target arthropod risk assessment: Hazard quotient (HQ) calculation results of 77% copper hydroxide aqueous dispersion granule

由表14可知，77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)蚯蚓急性、慢性的RQ>1，因此風(fēng)險(xiǎn)都不可接受。

綜上所述，本研究表明：

(1)77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)蜜蜂急性經(jīng)口毒性為中毒，說(shuō)明對(duì)該農(nóng)藥的使用應(yīng)避開(kāi)流蜜期[17]，針對(duì)大片蜜源區(qū)以及需要昆蟲授粉的蟲媒植物選用毒性相對(duì)較低的劑型，并且注意施藥當(dāng)天的風(fēng)力和風(fēng)向，盡量減少農(nóng)藥對(duì)蜜蜂等有益生物的危害。也可開(kāi)展田間試驗(yàn)進(jìn)行高級(jí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，來(lái)獲得更實(shí)際的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果，從而降低評(píng)估結(jié)果的不確定性[18]。

(2)77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)桑樹(shù)種植園最外圍一行桑樹(shù)上的家蠶風(fēng)險(xiǎn)不可接受，應(yīng)在農(nóng)藥標(biāo)簽上注明“最外圍桑樹(shù)作為隔離帶”等標(biāo)識(shí)。

(3)77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)土壤生物蚯蚓風(fēng)險(xiǎn)不可接受，應(yīng)在農(nóng)藥標(biāo)簽上注明“禁止在蚯蚓養(yǎng)殖地使用”等標(biāo)識(shí)。

(4)77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)農(nóng)田內(nèi)赤眼蜂風(fēng)險(xiǎn)不可接受，應(yīng)在農(nóng)藥標(biāo)簽上注明“赤眼蜂卡投放期間禁用”等標(biāo)識(shí)。

表12 PECsoil_SFO_China模型輸入?yún)?shù)和輸出結(jié)果Table 12 Input parameters and output results of PECsoil_SFO_China Model

表13 土壤生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的77%氫氧化銅水分散粒劑毒性終點(diǎn)及預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)劑量(PNED)Table 13 Soil biological risk assessment: Toxicity endpoints and predicted no effect dose (PNED) of 77% copper hydroxide aqueous dispersion granule

表14 77%氫氧化銅水分散粒劑對(duì)土壤生物風(fēng)險(xiǎn)商值Table 14 Risk quotients of 77% copper hydroxide aqueous dispersion granule to soil organisms

綜上，不同生物遭受的毒性程度不一，其中2項(xiàng)經(jīng)口試驗(yàn)均為“中毒”，說(shuō)明農(nóng)藥制劑中助劑可能會(huì)影響經(jīng)口試驗(yàn)結(jié)果。我國(guó)的農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究雖然起步較晚，但發(fā)展迅速[19]。它反映了農(nóng)藥對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的直接或間接影響，同時(shí)也在農(nóng)藥的登記管理中發(fā)揮著重要作用[20]。雖然通過(guò)急性毒性試驗(yàn)，測(cè)試出該農(nóng)藥對(duì)大部分陸生生物是低毒，但參照《農(nóng)藥登記 環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指南》(NY/T 2882—2016)[15]的方法進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，仍有上述3項(xiàng)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)不可接受，因此只單純用急性毒性分級(jí)來(lái)衡量農(nóng)藥的安全性，顯然是不夠全面的。同時(shí)，對(duì)于一些“高毒”農(nóng)藥，采取“一刀切”管理方式，不但使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨無(wú)藥可用的局面，還會(huì)讓農(nóng)藥的創(chuàng)制遭遇極大的困境[21]。從目前發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，減少試驗(yàn)數(shù)量、優(yōu)化試驗(yàn)程序、建立評(píng)估模型是未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)[22]。所以，農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估手段亟待更新，應(yīng)進(jìn)一步補(bǔ)充農(nóng)藥的田間試驗(yàn)數(shù)據(jù)，加強(qiáng)環(huán)境暴露預(yù)測(cè)模型及場(chǎng)景分析信息收集，推動(dòng)高階風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)新農(nóng)藥、老農(nóng)藥和撤銷登記的農(nóng)藥都建立起有效的監(jiān)督管理機(jī)制，豐富完善風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系，從而更安全合理地使用農(nóng)藥。