轉(zhuǎn)Cry1Ie基因玉米和轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因大豆對(duì)斑馬魚(yú)的生態(tài)毒性

董姍姍，章嫡妮，于賜剛，王長(zhǎng)永，劉燕

生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，環(huán)境保護(hù)生物安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210042

以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)為保障糧食安全、推動(dòng)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了新的途徑。2019年，全球4種主要轉(zhuǎn)基因作物——棉花、大豆、玉米和油菜的平均應(yīng)用率為52.8%，其中轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因玉米的應(yīng)用率分別為74%和31%[1]。轉(zhuǎn)基因作物大規(guī)模商業(yè)化種植的潛在生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)已引起了人們的廣泛關(guān)注。目前，轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境安全評(píng)價(jià)仍主要集中在陸地生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的研究相對(duì)匱乏。

轉(zhuǎn)基因作物中的外源蛋白可通過(guò)植物殘?bào)w、花粉和根際分泌物等途徑進(jìn)入農(nóng)田土壤和水體，并隨地表徑流和地表徑流沉積物進(jìn)入鄰近水域。已有研究顯示，轉(zhuǎn)Bt玉米田間的地表水和沉積物中Cry1Ab蛋白濃度可分別達(dá)130 ng·L-1和143 ng·L-1[2-4]，玉米田附近河流中淡水河蚌的腮、性腺和消化腺等組織內(nèi)均能檢測(cè)到cry1Ab基因的存在[5]。轉(zhuǎn)基因蛋白在水體中的存續(xù)和累積可能對(duì)水生生物的安全構(gòu)成潛在風(fēng)險(xiǎn)。此外，轉(zhuǎn)基因作物的凋落物和殘?bào)w可以為水生動(dòng)物直接或間接地提供食物，是其鄰近水域內(nèi)生物群落重要的能量和營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，長(zhǎng)期大規(guī)模種植轉(zhuǎn)基因作物可能會(huì)誘發(fā)影響水生動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)、種群數(shù)量以及攝食行為等諸多因子的變化[6]。魚(yú)類(lèi)是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要生物組成之一，通過(guò)檢測(cè)魚(yú)類(lèi)生理和行為反應(yīng)可以有效監(jiān)測(cè)水環(huán)境質(zhì)量的變化[7]。近年來(lái)，已有研究以魚(yú)類(lèi)為模式動(dòng)物評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物的生態(tài)毒理效應(yīng)，大多數(shù)研究是通過(guò)開(kāi)展轉(zhuǎn)基因作物的飼喂實(shí)驗(yàn)，調(diào)查魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)表現(xiàn)、組織病理、臟器發(fā)育、運(yùn)動(dòng)行為、應(yīng)激和免疫反應(yīng)以及繁殖能力等，評(píng)估轉(zhuǎn)基因作物的外源基因及其表達(dá)蛋白對(duì)魚(yú)類(lèi)的安全性[8-9]。在調(diào)查魚(yú)類(lèi)的各項(xiàng)指標(biāo)時(shí)，通常是在飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，集中采集樣本進(jìn)行檢測(cè)分析，沒(méi)有對(duì)喂養(yǎng)期間魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)、發(fā)育、病理以及生理等方面的變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，這可能會(huì)影響最終的結(jié)果判定。而且，在魚(yú)類(lèi)的不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，其攝取轉(zhuǎn)基因飼料后的反應(yīng)可能會(huì)不同[10-11]。對(duì)喂養(yǎng)期間魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育、生理等指標(biāo)進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)，更有利于全面評(píng)估轉(zhuǎn)基因作物的潛在生態(tài)毒性或非預(yù)期效應(yīng)。

斑馬魚(yú)(Daniorerio)基因組與人類(lèi)基因組具有較高同源性，是發(fā)育生物學(xué)、毒理學(xué)、基因功能以及人類(lèi)代謝疾病研究中的理想模型[12-13]。由于斑馬魚(yú)體型小、世代周期短、易于飼養(yǎng)和繁殖，近些年也被推薦作為轉(zhuǎn)基因作物安全性評(píng)價(jià)中的模式動(dòng)物[14-15]。本研究以斑馬魚(yú)為受試動(dòng)物，以我國(guó)自主研制的轉(zhuǎn)Cry1Ie基因玉米IE09S034和轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因大豆中作J9331為原料分別配制飼料，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因飼料的營(yíng)養(yǎng)成分和霉菌毒素含量，通過(guò)98 d的喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，調(diào)查斑馬魚(yú)的攝食、生長(zhǎng)、抗氧化酶活性和繁殖等指標(biāo)，分析不同喂養(yǎng)階段斑馬魚(yú)的組織病理及敏感蛋白mRNA表達(dá)水平，探討轉(zhuǎn)基因作物對(duì)魚(yú)類(lèi)的生態(tài)毒理效應(yīng)，為轉(zhuǎn)基因作物對(duì)水生動(dòng)物的環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)材料

供試的玉米材料為轉(zhuǎn)Cry1Ie基因抗蟲(chóng)玉米IE09S034及其非轉(zhuǎn)基因近等基因系綜31，供試的大豆材料為轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因耐除草劑大豆中作J9331及其非轉(zhuǎn)基因近等基因系中黃30，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

受試動(dòng)物為野生型AB品系斑馬魚(yú)，由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心購(gòu)買(mǎi)的種魚(yú)所繁殖。幼魚(yú)開(kāi)口期的餌料為草履蟲(chóng)(Parameciumcaudatum)，孵化出20 d后喂食豐年蟲(chóng)(Artemiasalina)，每天早、中、晚喂食3次。幼魚(yú)在靜水中飼養(yǎng)30 d左右，轉(zhuǎn)移至斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)(Aquatic habitats ZF0601, Apopka, FL, USA)中養(yǎng)殖，該系統(tǒng)為循環(huán)水，每天換水量為10%。魚(yú)齡達(dá)到60 d時(shí)開(kāi)始喂食商業(yè)顆粒飼料，每天喂食量為其體質(zhì)量(濕質(zhì)量)的4%。斑馬魚(yú)魚(yú)齡達(dá)到90 d時(shí)開(kāi)始試驗(yàn)，測(cè)量受試魚(yú)初始體質(zhì)量和體長(zhǎng)。

1.2 試驗(yàn)飼料的制備及檢測(cè)

試驗(yàn)飼料制備前，對(duì)所有玉米和大豆材料的主要營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行檢測(cè)，為后續(xù)飼料配制提供參考。根據(jù)美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)(National Research Council, NRC)制定的魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)需求標(biāo)準(zhǔn)配制人工飼料[16]，飼料配方如表1所示。飼料加工前，將玉米和大豆種子用商用磨粉機(jī)(FLBP-250，上海菲力博)打磨成粉，過(guò)100目篩網(wǎng)備用，加工時(shí)先將明膠和加麗素紅溶于80 ℃左右的純凈水中，攪拌均勻，然后按照比例“由小到大”的順序依次填加表1中的其他飼料成分，添加過(guò)程中用攪拌機(jī)不斷攪拌使其充分混合，混合均勻的飼料用家用料理機(jī)制作成直徑1.5 mm的條狀，平鋪于托盤(pán)上，置于陰涼處自然風(fēng)干，再根據(jù)斑馬魚(yú)口徑大小進(jìn)行研磨和過(guò)篩，使飼料顆粒直徑為450～550 μm，4 ℃冷藏。商業(yè)顆粒飼料為購(gòu)買(mǎi)自日清丸紅(天津)飼料科技有限公司的熱帶魚(yú)飼料，主要成分為魚(yú)粉、豆粕、小麥淀粉、魚(yú)肝油、復(fù)合維生素及礦物質(zhì)等。通過(guò)酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米飼料中的Cry1IE蛋白，ELISA試驗(yàn)的單克隆抗體和檢測(cè)方法均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所劉允軍博士提供。采用CP4-EPSPS蛋白檢測(cè)試紙條(Agdia Elkhart, IN, USA)檢測(cè)耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆飼料中的CP4-EPSPS蛋白。同時(shí)，采用轉(zhuǎn)基因蛋白檢測(cè)試紙條(Agdia Elkhart, IN, USA)檢測(cè)了商業(yè)飼料中的Cry1Ab/Ac及CP4-EPSPS外源蛋白。對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米飼料中伏馬毒素B1(FB1)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEB)和嘔吐毒素(DON)的含量也進(jìn)行了檢測(cè)(英格爾檢測(cè)技術(shù)服務(wù)(上海)有限公司)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇體質(zhì)量和體長(zhǎng)相近的斑馬魚(yú)隨機(jī)分成5組，即轉(zhuǎn)基因玉米組(GMM)、非轉(zhuǎn)基因玉米組(Non-GMM)、轉(zhuǎn)基因大豆組(GMS)、非轉(zhuǎn)基因大豆組(Non-GMS)和商業(yè)飼料對(duì)照組(CF)，每組設(shè)置3個(gè)平行(3缸)，每缸50條斑馬魚(yú)(10 L)。試驗(yàn)期間的飼養(yǎng)條件與幼魚(yú)期飼養(yǎng)條件保持一致，試驗(yàn)周期為98 d。每天喂食量為受試魚(yú)初始體質(zhì)量的3%～4%，分3次投喂(8:30、12:30、16:30)，并根據(jù)受試魚(yú)體質(zhì)量的變化調(diào)整喂食量。試驗(yàn)期間每天對(duì)斑馬魚(yú)的游動(dòng)、集群、棲息水層、食性及外觀的狀況進(jìn)行觀察，并記錄身體異常(如呼吸急促、不協(xié)調(diào)的游動(dòng)和反常的靜止)和死亡情況等。試驗(yàn)期間斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)的水溫為(27.2±0.5) ℃、pH為7.2±0.4、電導(dǎo)率為(507±18) μS·cm-1，溶解氧為(10.2±1.1) mg·L-1，符合斑馬魚(yú)生長(zhǎng)條件。

表1 試驗(yàn)飼料配方成分和比例(%)Table 1 Composition and proportion (%) of the experimental feeds

1.4 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

在試驗(yàn)開(kāi)始后的第14、28、42、56、70、84和98天，每缸隨機(jī)選取10條斑馬魚(yú)稱(chēng)量(濕質(zhì)量)、測(cè)量體長(zhǎng)，并根據(jù)測(cè)得的數(shù)據(jù)計(jì)算特定增長(zhǎng)率和飼料轉(zhuǎn)化率。

1.5 組織病理學(xué)分析

在試驗(yàn)開(kāi)始后的第28、56和98天，將斑馬魚(yú)禁食12 h后，每缸隨機(jī)選取4條固定于10%的福爾馬林溶液中，脫水處理后將整條魚(yú)橫切成頭、胸腹、臀和尾4段，然后用石蠟包埋機(jī)(HistoStar, Thermo Fisher Scientific, USA)進(jìn)行組織蠟塊包埋，再利用全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(Shandon Finesse, Thermo Fisher Scientific, USA)切為4 μm左右的連續(xù)切片，采用蘇木精-伊紅(HE)將石蠟切片染色，最后在熒光顯微鏡(DX45, Olympus, Japan)下進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。根據(jù)檢查結(jié)果，按照病變由輕到重的程度進(jìn)行打分，分別標(biāo)記為1、2、3和4分，無(wú)明顯病變?yōu)?分，極輕度病變?yōu)?.5分。

1.6 繁殖指標(biāo)檢測(cè)

每缸隨機(jī)選取5對(duì)斑馬魚(yú)按照雌雄比1∶2進(jìn)行配對(duì)產(chǎn)卵，從試驗(yàn)的第70天開(kāi)始至喂養(yǎng)結(jié)束，每14 d配對(duì)一次，總共配3次，記錄每對(duì)斑馬魚(yú)的產(chǎn)卵量、孵化率、孵化出仔魚(yú)的畸形和異常行為等。

1.7 肝臟和腸道超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定

在試驗(yàn)開(kāi)始后的第98天，每缸隨機(jī)選取雌性和雄性斑馬魚(yú)各2條，大體解剖后取其肝臟和腸道組織樣本，分別采用SOD試劑盒(Sigma, USA)和CAT試劑盒(Biovision, USA)檢測(cè)雌、雄魚(yú)肝臟和腸道組織中的SOD和CAT活性。

1.8 斑馬魚(yú)臟器組織中SOD、CAT和熱激蛋白70(HSP70) mRNA表達(dá)量檢測(cè)

在試驗(yàn)開(kāi)始后的第28、56和98天，每缸隨機(jī)選取雌性和雄性斑馬魚(yú)各3條，大體解剖后取其肝臟、腸道和性腺組織樣本，采用微量RNA提取試劑盒(Qiagen, Germany)提取臟器組織的總RNA。通過(guò)超微量分光光度計(jì)(DS-11, DeNovix, USA)和瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA的純度和完整性。RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)斑馬魚(yú)肝臟、腸道和性腺組織中SOD、CAT和HSP70的mRNA表達(dá)水平，以actin為內(nèi)參基因，采用相對(duì)定量法2-ΔΔCT計(jì)算SOD、CAT和HSP70的mRNA表達(dá)量，其中ΔΔCT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)試驗(yàn)組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對(duì)照組，各基因的特異性引物序列和檢測(cè)方法均參照董姍姍等[17]的方法。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)斑馬魚(yú)體質(zhì)量和攝食量計(jì)算特定生長(zhǎng)率(special growth rate, SGR)和飼料轉(zhuǎn)化率(feed conversion ratio, FCR)，特定生長(zhǎng)率和飼料轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式如下：

SGR=(lnWt-lnW0)/t×100

FCR=C/(Wt-W0)

式中：Wt和W0分別為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)和試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的魚(yú)體濕質(zhì)量(mg)；t為試驗(yàn)時(shí)間(d)；C為攝食量(mg)。

采用多因素方差分析(multi-way ANOVA)分別檢驗(yàn)玉米組(包括轉(zhuǎn)基因玉米組、非轉(zhuǎn)基因玉米組和商業(yè)飼料對(duì)照組)和大豆組(包括轉(zhuǎn)基因大豆組、非轉(zhuǎn)基因大豆組和商業(yè)飼料對(duì)照組)中組別、性別、取樣時(shí)間以及它們之間的交互作用對(duì)不同臟器組織中敏感蛋白mRNA表達(dá)量和抗氧化酶活性的影響。單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)不同組別斑馬魚(yú)的體質(zhì)量、體長(zhǎng)、特定生長(zhǎng)率、飼料轉(zhuǎn)化率、組織病理以及繁殖等指標(biāo)的差異，顯著性水平設(shè)為α=0.05，若檢驗(yàn)結(jié)果顯著，則采用Tukey法進(jìn)行不同組別間的多重比較。利用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)(T-test)比較雌性和雄性斑馬魚(yú)臟器組織中敏感蛋白mRNA表達(dá)量及抗氧化酶活性的差異(α=0.05)。以上分析均使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 試驗(yàn)飼料的營(yíng)養(yǎng)成分、霉菌毒素含量以及外源基因表達(dá)蛋白

飼料營(yíng)養(yǎng)成分的分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因飼料與相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因飼料在主要營(yíng)養(yǎng)成分上沒(méi)有明顯差異，且都能夠滿足斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)需求(表2)，但與商業(yè)飼料相比，人工飼料中的粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量明顯偏低，而淀粉含量明顯偏高。對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米飼料中霉菌毒素的檢測(cè)結(jié)果顯示，非轉(zhuǎn)基因玉米飼料中的FB1、DON和AFB1含量略高于轉(zhuǎn)基因玉米飼料中的，不過(guò)兩者均遠(yuǎn)低于《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078—2017)中規(guī)定的最高限量水平(表2)[18]。在轉(zhuǎn)基因玉米飼料和轉(zhuǎn)基因大豆飼料中均檢測(cè)到了外源基因表達(dá)蛋白，而相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因飼料和商業(yè)飼料中Cry1Ac和CP4-EPSPS蛋白呈陰性(表2)。

2.2 生長(zhǎng)表現(xiàn)

受試斑馬魚(yú)的初始平均體質(zhì)量和體長(zhǎng)分別為(124.78±4.69) mg和(23.0±0.3) mm，在試驗(yàn)期間各組斑馬魚(yú)的體質(zhì)量和體長(zhǎng)均呈明顯增加趨勢(shì)。轉(zhuǎn)基因組與相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因組斑馬魚(yú)的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)整體上無(wú)顯著差異(圖1)，但在試驗(yàn)98 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因玉米組斑馬魚(yú)體質(zhì)量顯著低于非轉(zhuǎn)基因玉米組的(P<0.05)，與商業(yè)飼料組相比，人工飼料組斑馬魚(yú)的體長(zhǎng)、體質(zhì)量和特定生長(zhǎng)率均顯著偏低，飼料轉(zhuǎn)化率顯著偏高(圖1)。

2.3 組織病理

斑馬魚(yú)肝臟、腸道和腦組織的病理檢測(cè)結(jié)果整體上為無(wú)明顯病變、極輕度或輕度病變。肝臟病變主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂變，多數(shù)為輕度，少數(shù)為中度，個(gè)別重度。少數(shù)斑馬魚(yú)腸壁黏膜上皮中的杯狀細(xì)胞數(shù)量增多，提示腸道黏液分泌增加。各組斑馬魚(yú)腦組織神經(jīng)細(xì)胞和白質(zhì)未見(jiàn)明顯病變，只在試驗(yàn)28 d時(shí)非轉(zhuǎn)基因玉米組有1條受試魚(yú)的個(gè)別神經(jīng)細(xì)胞壞死。對(duì)組織病理評(píng)分的方差分析結(jié)果顯示，在試驗(yàn)56 d時(shí)，商業(yè)飼料組斑馬魚(yú)腸道病變程度顯著高于轉(zhuǎn)基因大豆組(P<0.05)(表3)，其他取樣時(shí)間點(diǎn)各組間斑馬魚(yú)肝臟、腸道和腦組織病變程度無(wú)顯著差異。隨著試驗(yàn)時(shí)間推移，各組肝臟病變(肝細(xì)胞脂變)程度有加重趨勢(shì)(表3)。

2.4 繁殖指標(biāo)

斑馬魚(yú)配對(duì)產(chǎn)卵結(jié)果顯示，在每組隨機(jī)選取的45對(duì)斑馬魚(yú)中，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米組有75%左右的雌魚(yú)產(chǎn)卵，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆組有68%左右的雌魚(yú)產(chǎn)卵，商業(yè)飼料組有84%產(chǎn)卵，轉(zhuǎn)基因飼料組與非轉(zhuǎn)基因飼料組的平均產(chǎn)卵量和受精卵孵化率均無(wú)顯著差異(圖2)，不過(guò)試驗(yàn)飼料組的產(chǎn)卵量和孵化率與商業(yè)飼料組相比整體偏低(135±15vs175±23，(53.1±4.5)%vs(60.8±2.3)%)，各組孵化出的幼魚(yú)均未見(jiàn)身體畸形和明顯異常行為。

2.5 肝臟和腸道中抗氧化酶活性

玉米組多因素方差分析結(jié)果顯示(表4)，組別和性別對(duì)斑馬魚(yú)腸道中的SOD酶活有顯著影響，非轉(zhuǎn)基因玉米組斑馬魚(yú)SOD酶活顯著高于商業(yè)飼料組的，商業(yè)飼料組雌魚(yú)SOD酶活相對(duì)于雄魚(yú)顯著偏低。性別以及性別與組別的交互作用對(duì)玉米組斑馬魚(yú)腸道中的CAT酶活有顯著影響，即在不同組別中，雌魚(yú)和雄魚(yú)的表現(xiàn)不一致，T檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)僅在轉(zhuǎn)基因玉米組中雌魚(yú)腸道中的CAT酶活顯著高于雄魚(yú)(圖3)。大豆組多因素方差分析結(jié)果顯示(表4)，組別和性別對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中的SOD酶活有顯著影響，轉(zhuǎn)基因大豆組顯著高于非轉(zhuǎn)基因大豆組和商業(yè)飼料組，雄魚(yú)的SOD酶活顯著高于雌魚(yú)。

表2 飼料的營(yíng)養(yǎng)成分、外源蛋白和霉菌毒素含量Table 2 Nutrient composition, exogenous protein and the content of mycotoxins of the diets

圖1 不同組別斑馬魚(yú)的體長(zhǎng)、體質(zhì)量、特定生長(zhǎng)率和飼料轉(zhuǎn)化率注：不同大寫(xiě)字母表示轉(zhuǎn)基因玉米組、非轉(zhuǎn)基因玉米組和商業(yè)飼料組之間在P<0.05水平上差異顯著； 不同小寫(xiě)字母表示轉(zhuǎn)基因大豆組、非轉(zhuǎn)基因大豆組和商業(yè)飼料組之間在P<0.05水平上差異顯著；下同。Fig. 1 Length, weight, specific growth rate and feed conversion ratio of zebrafish in different groupsNote: Different capital letters represent significant difference between GMM, Non-GMM and CF at P<0.05; different lowercase letters represent significant difference between GMS, Non-GMS and CF at P<0.05; the same below.

表3 不同組別斑馬魚(yú)肝臟、腸道和腦組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果Table 3 Histopathological results of liver, intestinal tract and brain of zebrafish in different groups

圖2 不同組別斑馬魚(yú)的產(chǎn)卵量和受精卵孵化率Fig. 2 The egg-laying amount and hatching rates of fertilized eggs of zebrafish in different groups

圖3 不同組別斑馬魚(yú)肝臟和腸道中超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性注：(a)和(b)為肝臟，(c)和(d)為腸道；*和**分別表示同組雌魚(yú)與雄魚(yú)間在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。Fig. 3 Superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activity in the liver and intestinal tract of zebrafish in different groupsNote: (a) and (b) are liver, (c) and (d) are intestinal tract; *and **represent significant difference between female and male zebrafish at P<0.05 and P<0.01, respectively.

2.6 不同臟器組織中SOD、CAT和HSP70的mRNA表達(dá)量

對(duì)玉米組斑馬魚(yú)肝臟、腸道和性腺組織中，敏感蛋白mRNA表達(dá)量的多因素方差分析結(jié)果顯示(表5)，試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間與組別和性別的交互作用對(duì)臟器組織中SOD、CAT和HSP70 mRNA表達(dá)量有顯著影響，說(shuō)明在不同取樣時(shí)間點(diǎn)、不同組別和性別間差異的表現(xiàn)不同。例如：在試驗(yàn)28 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因玉米組斑馬魚(yú)肝臟中CATmRNA表達(dá)量顯著高于商業(yè)飼料組，但在98 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米組CATmRNA表達(dá)量均顯著低于商業(yè)飼料組；在28 d時(shí)，雌魚(yú)肝臟中的HSP70 mRNA表達(dá)水平與雄魚(yú)相比顯著偏高，到98 d時(shí)顯著偏低(表6)。大豆組的多因素方差分析結(jié)果顯示(表5)，組別對(duì)斑馬魚(yú)肝臟和腸道中的SOD和CATmRNA表達(dá)量有顯著影響，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆組的SOD和CATmRNA表達(dá)量均顯著低于商業(yè)飼料組(表7)，試驗(yàn)時(shí)間與組別和性別的交互作用顯著影響性腺組織中SOD和CATmRNA的表達(dá)水平，各組之間的差異在不同取樣時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有一致的表現(xiàn)。通過(guò)對(duì)玉米組和大豆組中不同處理組間的多重比較，發(fā)現(xiàn)組別之間的差異主要來(lái)自人工飼料組與商業(yè)飼料組之間，而不是轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因飼料組之間(表8)。而且隨著試驗(yàn)時(shí)間的推移，斑馬魚(yú)臟器組織中的敏感蛋白mRNA表達(dá)水平并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯升高或下降的趨勢(shì)。

表4 組別和性別對(duì)斑馬魚(yú)肝臟和腸道中抗氧化酶活性影響的多因素方差分析Table 4 Multi-way ANOVA of the effects of group and sex on the antioxidant enzymes activities in liver and intestinal tract of zebrafish

表5 組別、性別和試驗(yàn)時(shí)間對(duì)斑馬魚(yú)臟器組織中敏感蛋白mRNA表達(dá)水平影響的多因素方差分析Table 5 Multi-way ANOVA of the effects of group, sex and experimental duration on mRNA expression levels in tissues of zebrafish

3 討論(Discussion)

3.1 轉(zhuǎn)基因作物對(duì)斑馬魚(yú)生長(zhǎng)表現(xiàn)的影響

抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米和耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)斑馬魚(yú)的體質(zhì)量、體長(zhǎng)、飼料轉(zhuǎn)化率和特定生長(zhǎng)率整體上沒(méi)有顯著影響，但在試驗(yàn)98 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因玉米組斑馬魚(yú)的體質(zhì)量顯著低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M。生長(zhǎng)指標(biāo)的變化通常被認(rèn)為是生物體中各種生物因素綜合變化的結(jié)果，并且可能作為評(píng)估魚(yú)類(lèi)生態(tài)毒性效應(yīng)的終點(diǎn)指標(biāo)[19]。一般情況下，生長(zhǎng)指標(biāo)的降低會(huì)伴隨著飼料攝取量和轉(zhuǎn)化率的下降，本研究未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因玉米組斑馬魚(yú)的飼料轉(zhuǎn)化率有顯著差異，而且整個(gè)試驗(yàn)期間僅在最后一次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因玉米組的體質(zhì)量顯著偏低，這種差異可能是測(cè)量中的隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致，沒(méi)有生物學(xué)意義。在用含有抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米(MON810)的飼料喂食大西洋鮭的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因玉米組的最終體質(zhì)量顯著低于非轉(zhuǎn)基因玉米組，推測(cè)可能是由于飼料中某些成分的差異，比如：直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例或纖維素含量的差異等，可能會(huì)影響魚(yú)類(lèi)的消化率進(jìn)而引起生長(zhǎng)指標(biāo)的變化[10]。

值得注意的是，與4個(gè)試驗(yàn)飼料組相比，商業(yè)飼料組斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)表現(xiàn)更好，之前在以商業(yè)飼料作為對(duì)照的研究中也有類(lèi)似結(jié)果[17,20]。盡管我們配制的試驗(yàn)飼料能夠滿足斑馬魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)需求，但在加工工藝上與商業(yè)飼料有較大差別。為了最大限度保證轉(zhuǎn)基因作物中的外源蛋白在飼料制備過(guò)程中不被降解，我們沒(méi)有對(duì)試驗(yàn)飼料進(jìn)行加熱加壓處理，而商業(yè)飼料是經(jīng)高溫、高壓處理后的顆粒飼料，其適口性和消化率都優(yōu)于試驗(yàn)飼料，這可能會(huì)直接影響斑馬魚(yú)的攝食量和飼料利用率。此外，商業(yè)飼料中粗蛋白和粗脂肪的含量相對(duì)較高，可能更利于營(yíng)養(yǎng)成分的吸收和利用[21]，從而提高斑馬魚(yú)的特定增長(zhǎng)率。

3.2 轉(zhuǎn)基因作物對(duì)斑馬魚(yú)組織病理的影響

98d的喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米和耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)斑馬魚(yú)肝臟、腸道和性腺的組織病理沒(méi)有顯著影響。但隨著試驗(yàn)時(shí)間增加，各組斑馬魚(yú)肝細(xì)胞脂變程度表現(xiàn)出從無(wú)明顯病變至輕度病變的趨勢(shì)，推測(cè)與飼料中的脂肪和蛋白質(zhì)配比、霉菌毒素、抗?fàn)I養(yǎng)因子以及營(yíng)養(yǎng)素(比如：膽堿、維生素)等因素有關(guān)，長(zhǎng)期飼喂可能影響斑馬魚(yú)的脂肪代謝，導(dǎo)致肝臟脂肪沉積[22-23]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)過(guò)7個(gè)月的長(zhǎng)期喂養(yǎng)，轉(zhuǎn)基因大豆組和非轉(zhuǎn)基因大豆組大西洋鮭腸道均出現(xiàn)輕微炎癥，推測(cè)可能是大豆中抗?fàn)I養(yǎng)因子誘發(fā)的炎癥[24]。在用含有抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米的飼料連續(xù)喂食2代斑馬魚(yú)的研究中，轉(zhuǎn)基因組和非轉(zhuǎn)基因組子一代斑馬魚(yú)都有個(gè)別樣本的腸道組織出現(xiàn)輕微炎癥[25]。

3.3 轉(zhuǎn)基因作物對(duì)斑馬魚(yú)繁殖的影響

抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米和耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)斑馬魚(yú)的繁殖性能無(wú)顯著影響，各組斑馬魚(yú)的平均產(chǎn)卵量為(144±17)粒，與文獻(xiàn)報(bào)道的相近[25]。但試驗(yàn)飼料組的產(chǎn)卵量和受精卵孵化率，與商業(yè)飼料組相比均略偏低，可能主要由于試驗(yàn)飼料與商業(yè)飼料在適口性和營(yíng)養(yǎng)成分上的差異，影響斑馬魚(yú)的攝食、飼料轉(zhuǎn)化和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，在一定程度上對(duì)其性腺等生殖器官的發(fā)育產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致產(chǎn)卵量和孵化率偏低[26-27]。目前國(guó)際上在轉(zhuǎn)基因作物對(duì)魚(yú)類(lèi)的飼用安全性研究中，涉及繁殖能力的還很少，主要因?yàn)榇蟛糠盅芯恳源笪餮篚q為受試動(dòng)物，其性成熟時(shí)間較晚，仔魚(yú)孵化期長(zhǎng)，對(duì)環(huán)境條件要求較高，試驗(yàn)操作比較困難，而斑馬魚(yú)生育周期短、易于人工繁殖[9]。一項(xiàng)以斑馬魚(yú)為模式動(dòng)物，調(diào)查轉(zhuǎn)Bt玉米對(duì)其繁殖能力影響的研究顯示，盡管轉(zhuǎn)基因玉米組親魚(yú)的產(chǎn)卵量略高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M(P>0.05)，但2組胚胎的DNA甲基化水平和仔魚(yú)的行為活動(dòng)均無(wú)顯著差異[25]。

3.4 轉(zhuǎn)基因作物對(duì)斑馬魚(yú)臟器組織中抗氧化酶活性和mRNA表達(dá)水平的影響

斑馬魚(yú)臟器組織中敏感蛋白mRNA的表達(dá)水平，沒(méi)有隨時(shí)間呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性變化，各組間mRNA表達(dá)量的差異(92.6%)主要來(lái)自于試驗(yàn)飼料組與商業(yè)飼料組之間，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)其沒(méi)有顯著影響。這與Sagstad等[23]對(duì)大西洋鮭的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因大豆組大西洋鮭臟器組織中的SOD、CAT和HSP70 mRNA表達(dá)量沒(méi)有顯著差異，但與魚(yú)粉飼料組相比，2組大西洋鮭腸道中的HSP70 mRNA表達(dá)水平均表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)，推測(cè)可能與大豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子(如大豆凝集素)有關(guān)。已有文獻(xiàn)報(bào)道大豆凝集素能夠與大西洋鮭小腸上皮細(xì)胞特異性結(jié)合，影響腸道的結(jié)構(gòu)和功能[28-29]。本研究中，性別與試驗(yàn)時(shí)間的交互作用對(duì)斑馬魚(yú)臟器組織中的mRNA表達(dá)量有顯著影響，在不同取樣時(shí)間和不同檢測(cè)指標(biāo)上雌魚(yú)與雄魚(yú)的差異表現(xiàn)不同。Sissener等[20]對(duì)喂食轉(zhuǎn)基因大豆飼料的雌性和雄性斑馬魚(yú)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因大豆組雌魚(yú)肝臟中SOD的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著低于非轉(zhuǎn)基因大豆組，而雄魚(yú)在2組間沒(méi)有顯著差異。已有研究顯示，轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆中大豆異黃酮等植物雌激素的含量可能存在差異[30]，雌魚(yú)和雄魚(yú)對(duì)植物雌激素的敏感程度也有所差別[31]，植物雌激素能夠誘導(dǎo)雄魚(yú)肝臟中卵黃蛋白原的合成、影響魚(yú)的性腺發(fā)育和繁殖[32]。

表6 不同組別斑馬魚(yú)肝臟中的SOD、CAT和HSP70 mRNA表達(dá)水平Table 6 SOD, CAT and HSP70 mRNA expression levels in the liver of zebrafish in different groups

表7 不同組別斑馬魚(yú)腸道中的SOD、CAT和HSP70 mRNA表達(dá)水平Table 7 SOD, CAT and HSP70 mRNA expression levels in the intestinal tract of zebrafish in different groups

表8 不同組別斑馬魚(yú)性腺組織中的SOD、CAT和HSP70 mRNA表達(dá)水平Table 8 SOD, CAT and HSP70 mRNA expression levels in the gonad tissues of zebrafish in different groups

斑馬魚(yú)臟器組織中的抗氧化酶活性與其mRNA表達(dá)量之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性，可能主要與基因表達(dá)過(guò)程中轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控有關(guān)。值得注意的是，玉米組雌魚(yú)和雄魚(yú)腸道中SOD酶活與其98 d時(shí)的mRNA表達(dá)量顯著相關(guān)，非轉(zhuǎn)基因玉米組的SOD酶活及其mRNA表達(dá)量均顯著高于商業(yè)飼料組，可能是飼料組成和營(yíng)養(yǎng)成分上的差異導(dǎo)致。腸道是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要器官，也是生物體免疫防御的重要屏障，腸道中抗氧化酶活性的變化可以指示脅迫條件下機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究中，非轉(zhuǎn)基因玉米飼料的FB1、DON和AFB1含量均略高于轉(zhuǎn)基因玉米飼料，已有文獻(xiàn)報(bào)道高劑量的霉菌毒素暴露可以誘導(dǎo)魚(yú)臟器組織中SOD基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[33-34]，DON和AFB1在魚(yú)體中的靶標(biāo)器官分別是腸道和肝臟[35]，因此，推測(cè)非轉(zhuǎn)基因玉米組斑馬魚(yú)腸道中的SOD酶活和mRNA表達(dá)量顯著偏高，可能也與飼料中霉菌毒素含量相對(duì)偏高有關(guān)。

綜上所述，攝食含有抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米和耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆飼料的斑馬魚(yú)，在生長(zhǎng)表現(xiàn)、組織病理和繁殖性能上與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M相比均無(wú)顯著差異。轉(zhuǎn)基因大豆組斑馬魚(yú)肝臟中的SOD酶活顯著高于非轉(zhuǎn)基因大豆組和商業(yè)飼料組，且雄魚(yú)顯著高于雌魚(yú)(P<0.05)。斑馬魚(yú)臟器組織中敏感蛋白mRNA的表達(dá)水平，沒(méi)有隨時(shí)間呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性變化，喂養(yǎng)時(shí)間與組別和性別之間存在顯著的交互作用?？傮w上看，轉(zhuǎn)Cry1Ie基因抗蟲(chóng)玉米和轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因耐除草劑大豆對(duì)斑馬魚(yú)沒(méi)有明顯的生態(tài)毒性效應(yīng)。但是，試驗(yàn)飼料組斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)表現(xiàn)、肝臟中SOD酶活以及mRNA表達(dá)量與商業(yè)飼料組相比有顯著差異，可能與飼料的適口性和營(yíng)養(yǎng)成分上的差異有關(guān)。