董春龍 黃顏青 鄧春紅

肺癌是目前世界各國癌癥發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，排列在前三位甚至首位，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在肺癌中占比高達85%[1]。傳統(tǒng)的化療及放療手段由于缺乏特異性，僅獲取的短期療效，同時亦給患者帶來較大的副作用，且研究[2]發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)治療非小細胞肺癌的5年生存率低于20%。近年來表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）日漸成為NSCLC的一種新型治療靶點。EGFR基因檢測包含4個外顯子（18、19、20、21），當(dāng)其中任一個發(fā)生突變，均可應(yīng)用EGFR受體抑制劑即酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）治療[3]。本研究旨在探討NSCLC患者的EGFR基因情況，并分析其與NSCLC患者的臨床病因的關(guān)系，以明確靶向治療的臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取茂名市中醫(yī)院病理科2012年1月—2018年6月期間經(jīng)肺穿刺及外科手術(shù)切除的50例非小細胞肺癌患者作為研究對象，所有標(biāo)本穿刺或切除前均未進行放療、化療。50例患者中男29例，女21例，年齡34～79歲，平均年齡（61.9±14.5）歲，吸煙18例，TNM分 期（tumor node metastasis classification），Ⅰ期14例，Ⅱ期8例，Ⅲ期24例，Ⅳ期4例，病理類型：腺癌40例，鱗癌8例，肉瘤樣癌2例。50份標(biāo)本均為合格標(biāo)本，患者標(biāo)本采集前均未接受化療、放療或其他抗癌治療。

1.2 EGFR基因突變檢測

1.2.1 石蠟標(biāo)本的采集 經(jīng)病理證實腫瘤細胞含量≥10%，使用一次性刀片連續(xù)切取石蠟包埋組織5 μm厚，共8～10張，使用二甲苯脫蠟、無水乙醇置換二甲苯、金屬浴40℃，10 min蒸干無水乙醇。

1.2.2 細胞學(xué)DNA提取 將石蠟標(biāo)本8～10片置入1.5 mL的Ep PendorF管中，添加適量的二甲苯脫蠟處理，后加入乙醇清洗脫二甲苯，30℃～40℃溫度下晾干，直至乙醇揮發(fā)完全，后添加30 μL的蛋白酶及180 μL的Buffer ATL震蕩混合均勻后過夜，直至樣本完全裂解，采用QIAamp DNA試劑盒提取細胞學(xué)DNA，具體操作步驟嚴(yán)格執(zhí)行試劑盒說明書。將獲取的目標(biāo)DNA在紫外光分光光度計下進行DNA濃度及純度的檢測，保證DNA濃度在100～1 500 ng/μL，-20℃～4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 EGFR基因突變檢測 采用應(yīng)用ARMS法檢測非小細胞肺癌的EGFR基因突變情況。試劑盒為人類EGFR基因突變檢測試劑盒（上海源奇公司研發(fā)），進行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），檢測EGFR基因的18～21號外顯子的突變情況。詳細操作步驟嚴(yán)格執(zhí)行試劑盒說明書。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，計量資料采用（±s）表示，采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因檢測結(jié)果

50例非小細胞肺癌患者均采用ARMS檢測，檢測結(jié)果顯示共28例非小細胞肺癌出現(xiàn)外顯子18～21基因突變（其中1例患者出現(xiàn)外顯子19及外顯子21雙位點突變），外顯子18基因突變率為4.0%（2/50），外顯子19基因突變率為22.0%（11/50），外顯子20基因突變率為8.0%（4/50），外顯子21基因突變率為24.0%（12/50）,總突變率56.0%（28/50）。詳見表1。

表1 50例NSCLC EGFR基因檢測分析

2.2 基因突變與臨床病理的關(guān)系

不同年齡、TNM分期患者的基因突變率比較無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05；女性EGFR基因突變率顯著高于男性，非吸煙人群EGFR基因突變率顯著高于吸煙人群。腺癌EGFR基因突變率顯著高于鱗癌，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移EGFR基因突變率顯著高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，P＜0.05。詳見表2。

表2 EGFR基因突變與臨床病例特征的關(guān)系[例（%）]

3 討論

肺癌常見的基因突變包括EGFR、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）基 因 和kirsten大 鼠 肉 瘤（kirsten rat sarcoma，KRAS）基因等，可出現(xiàn)突變共存的狀態(tài)，最常見的是EGFR突變及ALK融合突變[4]，鑒于檢測的經(jīng)濟性，往往首先檢測EGFR，必要時行多種基因突變檢測。其中EGFR共包含有28個外顯子，其中18、19、20、21四個外顯示子的突變是最有代表意義的，從而作為鞘向藥物EGFR受體抑制劑即酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）的用藥依據(jù)。Maemondo M等[5]的研究發(fā)現(xiàn)對EGFR表現(xiàn)敏感的NSCLC患者經(jīng)EGFR抑制劑治療后的無瘤進展期要顯著高于采用放療治療手段。2011年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（national comprehensive cancer network，NCCN）指南對非小細胞肺癌治療強調(diào)，對于復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌患者的選擇一線治療方案前，必須進行EGFR基因突變檢測[6]。我國華西醫(yī)學(xué)研究表明，EGFR陽性相較于陰性或未知的有明顯改善的5年生存率[2]，該研究同時表明，EGFR狀態(tài)未知甚至陰性的患者很難從鞘向治療中獲益。

ARMS法是一種非小細胞肺癌患者EGFR基因檢測敏感度高的方法之一[7]。基因檢測除了ARMS法外，尚有更先進的二代測序基因檢測，但需要更專業(yè)的實驗室和設(shè)備，多在國家級、省級醫(yī)院或第三方機構(gòu)應(yīng)用，本研究采用ARMS法如上方法所述，可適用地市級醫(yī)院。檢測結(jié)果顯示共28例非小細胞肺癌出現(xiàn)外顯子18～21基因突變（其中1例患者出現(xiàn)外顯子19及外顯子21雙位點突變），外顯子18基因突變率為4.0%（2/50），外顯子19基因突變率為22.0%（11/50），外顯子20基因突變率為8.0%（4/50），外顯子21基因突變率為24.0%（12/50）。提示非小細胞肺癌患者的基因突變點位主要集中在外顯子19及21，總計占比46.0%（23/50），外顯子18及20所占的比例較小，總計為12.0%（6/50）。雙位點突變出現(xiàn)了1例，為外顯子19+21，其他研究亦見其他雙位點突變，但為散發(fā)病例，所占比例不高[8]。雙位點突變多發(fā)于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和以乳頭狀生長方式為主的肺腺癌中[9]。根據(jù)最新世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）的肺腺癌生長方式，本研究尚未能對貼壁樣、腺泡狀、乳頭狀、微乳頭狀及實性這五種生長方式各自的EGFR突變情況加以分析。

本研究旨在進一步探究EGFR基因突變與臨床病理之間的意義?；颊叩哪挲g、TNM分期基因突變率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。但關(guān)于臨床病理分期與EGFR基因突變發(fā)生率的研究非常值得深究，國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[8]，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者的EGFR突變陽性率高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期非小細胞肺癌患者，本組的研究顯示前者亦略高于后者，雖差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但仍提示高分期的非小細胞肺癌患者存在較高的EGFR突變率。癌癥的組織類型與EGFR突變有一定的關(guān)系，非小細胞肺癌包括腺癌、鱗癌、腺鱗癌、肉瘤樣癌、涎腺樣癌、大細胞癌等，以上數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)腺癌EGFR基因突變率顯著高于鱗癌[10]，一項大樣本的臨床研究[11]發(fā)現(xiàn)，超過1/3的腺癌患者再采用EGFR TKI治療后，疾病獲得了有效控制，以上腺癌的突變比例與本研究的基本符合，盡管鞘向治療不是萬能，但聯(lián)合傳統(tǒng)治療一定可能讓患者獲益匪淺，應(yīng)更深入研究以提供充足的鞘向治療依據(jù)，本次研究例數(shù)偏少，如條件許可下一步可收集更多病例進行研究。

本研究發(fā)現(xiàn)女性患者EGFR基因突變率高于男性患者，P＜0.05，提示非小細胞肺癌的EGFR突變率與性別有關(guān)，推測原因可能與雌性激素的表達有關(guān)，對比研究表明EGFR突變多發(fā)于女性、無吸煙史人群，而KRAS突變好發(fā)于男性、有吸煙史的人群，尚無同時檢測出EGFR和KRAS基因突變的病例出現(xiàn)[12]。本組研究中非吸煙人群的基因突變率為64.9%，顯著高于吸煙人群30.8%，亦與上述研究相符。另外，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移EGFR基因突變率顯著高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，P＜0.05。EGFR突變在原發(fā)腫瘤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中可見，且伴有淋巴轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌患者往往出現(xiàn)較高的EGFR陽性率[13]，提示在肺穿刺活檢困難時淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶可行EGFR基因檢測。

綜上所述，EGFR基因突變以19及21外顯子突變?yōu)橹?，其中在女性、腺癌、非吸煙、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移人群中EGFR表達陽性率較高，而在年齡、TNM分期上未見有明顯的相關(guān)性，但可能影響非小細胞肺癌患者的預(yù)后。伴有EGFR基因突變的患者對TKI治療敏感度較高，通過EGFR檢測可為鞘向藥物治療提供有力的依據(jù)，因而對EGFR常規(guī)的18、19、20、21四個外顯子的突變檢測對于指導(dǎo)臨床治療方案有重要的意義。