戴曉港 陳 晨 薛良交 吳懷通 尹佟明

(江蘇省楊樹種質(zhì)創(chuàng)新與品種改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京林業(yè)大學(xué) 南京 210037)

美洲黑楊(Populusdeltoides)和小葉楊(P.simonii)分別屬于楊屬(Populus)的黑楊派(Sect.Aigeiros)和青楊派(Sect.Tacamahaca)。美洲黑楊天然分布于北美洲的中、東部，其生長(zhǎng)迅速、干形通直、材質(zhì)優(yōu)良，是歐亞大陸和北美洲工業(yè)用材經(jīng)濟(jì)價(jià)值和遺傳育種價(jià)值最高的樹種(Crosetal.,1984)。小葉楊天然分布于我國(guó)北方地區(qū)12個(gè)省市，具有耐旱、耐寒、易生根等特點(diǎn)，是中國(guó)重要的林木資源及栽培樹種(呂文等,2001)，但其生長(zhǎng)緩慢、干形較差。自1954年徐緯英(1958)開展雜交育種項(xiàng)目獲得雜種小黑楊(P.simonii×P.nigra)之后，從1979年開始，以引進(jìn)的美洲黑楊‘I-69’(P.deltoides‘Lux’)為母本，分別與小葉楊和青楊(P.cathayana)雜交，選育出NL105楊(P.deltoides×P.simonii‘Nanlin105’)、NL106楊(P.deltoides×P.simonii‘Nanlin106’)(王明庥等,1988)、陜林4號(hào)(P.deltoides×P.cathayana‘Shaanlin No.4’)(符毓秦等,1990)等一批美洲黑楊和青楊派的優(yōu)良雜交子代(馬常耕,1995)，經(jīng)過(guò)栽培試驗(yàn)，證實(shí)雜種后代具有較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)出速生、主干通直、耐旱、耐貧瘠等優(yōu)點(diǎn)(蘇曉華等,2004)。因此開展楊樹的種間雜交育種工作，對(duì)培育速生、適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)的楊樹新品種具有重要意義。

由于林木的育種周期長(zhǎng)，根據(jù)形態(tài)性狀辨識(shí)雜交子代的真實(shí)性需要漫長(zhǎng)的時(shí)間，因此建立一種快速、可靠且在苗期就能對(duì)雜交子代真實(shí)性鑒定的方法極為重要。分子標(biāo)記的發(fā)展為雜交個(gè)體的鑒別提供了可靠的手段。如李毅等(2002)、張玉平等(2015)分別利用RAPD標(biāo)記對(duì)箭桿楊×胡楊(P.nigravar.thevestina×P.euphratica)、銀白楊×新疆楊(P.alba×P.albavar.pyramidalis)雜交子代進(jìn)行鑒定，確定了種間雜交子代的真實(shí)性；AFLP標(biāo)記也用于銀白楊×N001楊(美洲黑楊)(P.alba×P.deltoides‘N001’)雜交子代的真實(shí)性鑒定(李曉宇等,2019)。但上述采用的均為顯性遺傳標(biāo)記，存在重復(fù)性差、操作復(fù)雜等缺陷。而物種特異性分子標(biāo)記可以提高鑒別的準(zhǔn)確率，是親本及子代鑒別的理想遺傳標(biāo)記。本文采用高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，開發(fā)了美洲黑楊和小葉楊物種特異性分子標(biāo)記，可用于美洲黑楊與小葉楊雜交子代的真實(shí)性鑒定。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019年4月，在泗洪縣馬浪湖林場(chǎng)的美洲黑楊種質(zhì)資源庫(kù)、美洲黑楊(T120)×小葉楊雜交F1代群體，分別選取50株美洲黑楊、40株雜交子代，在青海省北山林場(chǎng)自然分布的小葉楊群體中選取50株小葉楊，采集親本及雜交子代所選植株的新鮮嫩葉，置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室用液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用天根新型植物DNA提取試劑盒(DP320)提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，ND2000超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，然后將DNA稀釋至10 ng·μL-1，保存于-20 ℃。

1.2.2 物種特異性Indel位點(diǎn)查找 以美洲黑楊基因組為參考序列，首先采用BWA軟件(Lietal.,2010)將美洲黑楊和小葉楊各10個(gè)個(gè)體的重測(cè)序序列比對(duì)到參考基因組上，然后用Samtools(Lietal.,2009)將比對(duì)的文件轉(zhuǎn)換為SAM/BAM格式，最后用FreeBayes(Garrisonetal.,2012)檢測(cè)SNP和Indel位點(diǎn)。采用Python腳本提取種內(nèi)特異但種間長(zhǎng)度差異大于5 bp的Indel位點(diǎn)，并從美洲黑楊基因組中提取這些位點(diǎn)上下游各300 bp的序列用于引物設(shè)計(jì)。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及通用性分析 采用pirmer3進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物GC含量在40%～60%，退火溫度55～60 ℃，目的片段長(zhǎng)度150～200 bp。將設(shè)計(jì)的引物采用SeqHunter2(Yeetal.,2012)與小葉楊基因組比對(duì)，保留上下游引物序列和小葉楊基因組最多只有1個(gè)堿基差異且擴(kuò)增目的片段符合預(yù)期的引物，初步認(rèn)為這些引物在美洲黑楊和小葉楊中通用，將這些引物送金斯瑞生物科技股份有限公司合成。

1.2.4 引物通用性及特異性驗(yàn)證 首先用美洲黑楊和小葉楊各一個(gè)個(gè)體的DNA進(jìn)行引物通用性及多態(tài)性初步驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在ABI 9700 PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，采用15 μL反應(yīng)體系：10×Buffer(Mg2+)1.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 0.6 μL，10 ng·μL-1DNA模板1.5 μL，正向和反向引物(2 μmol·L-1)各1 μL，pfu Taq (5 U·μL-1)0.2 μL，DMSO 0.6 μL，最后用ddH2O補(bǔ)足至15 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，15 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，180 V恒壓電泳90 min，用0.1%硝酸銀銀染15 min，最后用2% NaOH + 1%甲醛顯影5～7 min直至條帶清晰。選取在美洲黑楊和小葉楊均能擴(kuò)增且產(chǎn)物長(zhǎng)度存在差異的引物，再對(duì)美洲黑楊和小葉楊各50個(gè)個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增，選出種內(nèi)保守、種間存在差異的物種特異性引物。

1.2.5 物種特異性引物進(jìn)行種間雜交子代鑒別 選取上述篩選出的物種特異性引物，對(duì)所有美洲黑楊和小葉楊的雜交子代進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行種間雜交子代的真實(shí)性判別。

2 結(jié)果與分析

2.1 InDel引物設(shè)計(jì)及通用性分析

分別將10個(gè)個(gè)體的美洲黑楊和小葉楊重測(cè)序序列比對(duì)到美洲黑楊基因組，共獲得長(zhǎng)度差異大于5 bp的InDel位點(diǎn)359 733個(gè)，其中種內(nèi)特異、種間差異的InDel位點(diǎn)18 418個(gè)。在美洲黑楊基因組中提取種內(nèi)特異、種間存在差異的InDel位點(diǎn)的序列，采用Primer3共在17 956個(gè)位點(diǎn)成功設(shè)計(jì)引物。從不同的染色體上，共隨機(jī)選取10對(duì)引物(表1)，采用SeqHunter2將這些引物序列比對(duì)到小葉楊基因組，其中有6對(duì)引物在小葉楊基因組中序列匹配度大于95%，且與目的片段長(zhǎng)度相符，設(shè)計(jì)引物通用率達(dá)60%以上(表1)。

表1 SeqHunter2檢索獲得的10對(duì)InDel引物在小葉楊中的通用性Tab.1 Ten pairs of universal InDel primer retrieved by SeqHunter2 in P. simonii

2.2 多態(tài)性InDel引物篩選

隨機(jī)選取美洲黑楊和小葉楊各1個(gè)樣品的DNA對(duì)SeqHunter2搜索獲得的6對(duì)通用性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)(圖1)，除Psi10-2在小葉楊中不能擴(kuò)增產(chǎn)物，其余5對(duì)引物均能有效擴(kuò)增，且產(chǎn)物清晰。Psi2-1和Psi13-14這2對(duì)引物，在美洲黑楊和小葉楊中擴(kuò)增的產(chǎn)物存在明顯的差別，可用于美洲黑楊和小葉楊物種特異性引物的進(jìn)一步篩選驗(yàn)證。

圖1 InDel引物在小葉楊(A)和美洲黑楊(B)中的篩選Fig.1 InDel primer screening for P. simonii(A)and P. deltoides(B)

2.3 物種特異性引物篩選

采用美洲黑楊和小葉楊自然群體各50個(gè)個(gè)體對(duì)Psi2-1和Psi13-14引物進(jìn)行物種特異性驗(yàn)證。引物Psi2-1在美洲黑楊自然群體的50個(gè)個(gè)體中均僅能擴(kuò)增出1條128 bp的產(chǎn)物，而在小葉楊自然群體的50個(gè)個(gè)體中均僅能擴(kuò)增出1條139 bp的產(chǎn)物(圖2A)；同樣地，引物Psi13-14在美洲黑楊中均只能擴(kuò)增出132 bp的產(chǎn)物，而在小葉楊中均僅能擴(kuò)增出1條144 bp的產(chǎn)物(圖2B)。這2對(duì)引物在美洲黑楊和小葉楊擴(kuò)增出的產(chǎn)物在種內(nèi)高度保守，而在種間存在明顯差異。

圖2 引物Psi2-1(A)和Psi13-14(B)擴(kuò)增美洲黑楊和小葉楊的結(jié)果Fig.2 Partial amplification results of primer Psi2-1(A)and Psi13-14(B)in P. simonii and P. deltoides1-12:美洲黑楊;13-24:小葉楊。1-12:P. deltoides;13-24:P. simonii.

2.4 引物特異性驗(yàn)證

從青海收集的小葉楊自然群體中隨機(jī)選取10個(gè)個(gè)體，分別從密西西比州、德克薩斯州收集的美洲黑楊自然群體中隨機(jī)選取5個(gè)個(gè)體，以及美洲黑楊與小葉楊雜交子代4個(gè)，共24個(gè)個(gè)體用于物種特異性引物及種間雜交子代的真實(shí)性驗(yàn)證。引物Psi2-1在10個(gè)美洲黑楊個(gè)體中僅擴(kuò)增出特異性為128 bp的產(chǎn)物，在10個(gè)小葉楊個(gè)體中僅能擴(kuò)增出特異性為139 bp的產(chǎn)物，而在4個(gè)雜交子代中能同時(shí)擴(kuò)增出128 bp和139 bp 2條產(chǎn)物(圖3A)。引物Psi13-14在10個(gè)美洲黑楊個(gè)體中擴(kuò)增出特異性為132 bp的產(chǎn)物，在10個(gè)小葉楊個(gè)體中只能擴(kuò)增出144 bp的特異性產(chǎn)物，而在4個(gè)雜交子代中均能擴(kuò)增出132 bp和144 bp 2條產(chǎn)物(圖3B)。在上述篩選出的2對(duì)InDel引物中，在美洲黑楊和小葉楊中都能擴(kuò)增出種特異的產(chǎn)物，而其雜交子代同時(shí)具有美洲黑楊和小葉楊的特異性產(chǎn)物，證明了它們是種間雜交的真實(shí)性。2對(duì)引物都可以用于小葉楊和美洲黑楊種間雜交子代的鑒定，2對(duì)引物的鑒別準(zhǔn)確率均為100%，2對(duì)引物同時(shí)使用可以相互驗(yàn)證，從而保證了種間雜交子代真實(shí)性鑒別的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

圖3 引物Psi2-1(A)、Psi13-14(B)擴(kuò)增美洲黑楊、小葉楊及其雜交子代的結(jié)果Fig.3 Partial results of Psi2-1(A)and Psi13-14(B)primer amplification of P. simonii,P. deltoides and their hybrids1-5:美洲黑楊(德克薩斯州,美國(guó));6-10:美洲黑楊(密西西比州,美國(guó));11-14:美洲黑楊×小葉楊;15-24:小葉楊(中國(guó)青海)。1-5:P. deltoides(Texas,USA);6-10:P. deltoides(Mississippi,USA);11-14:P. deltoides×P. simonii;15-24:P. simonii(Qinghai,China).

3 討論

楊樹作為全球分布范圍最廣、適應(yīng)性最強(qiáng)的樹種，在林業(yè)中占有重要的地位。截至2015年，中國(guó)楊樹人工林面積超過(guò)667萬(wàn)hm2，居世界之首。林業(yè)生產(chǎn)中推廣的楊樹良種主要還是通過(guò)人工控制授粉雜交培育的。雜交育種仍是目前及今后更長(zhǎng)時(shí)間楊樹新品種培育的重要手段，而開展遠(yuǎn)緣雜交育種可能會(huì)收到更好的效果。我國(guó)楊樹育種學(xué)家開展了黑楊派與青楊派的種間雜交育種，獲得了小黑楊、NL105楊、NL106楊等許多具有速生、耐旱、耐貧瘠等優(yōu)良性狀的無(wú)性系(李善文等,2004)。目前楊樹雜交主要采用室外高枝套袋雜交技術(shù)，由于室外套袋授粉容易引起花粉的污染，特別是在種間雜交授粉過(guò)程中，因此使用RAPD、AFLP等分子標(biāo)記技術(shù)手段對(duì)楊樹遠(yuǎn)緣雜交子代進(jìn)行真實(shí)性鑒定(李毅等,2002;李曉宇等,2019)。但上述采用的均為顯性遺傳標(biāo)記，易受外源污染的影響，鑒定存在重復(fù)性差、操作復(fù)雜等缺陷。共顯性SSR也被廣泛用于楊樹派間雜交子代的鑒別(陳洪偉等,2009;彭儒勝等,2013)，但由于鑒定中僅采用了1對(duì)SSR引物對(duì)種間雜交子代進(jìn)行真實(shí)性鑒別，如果供體花粉在這個(gè)SSR位點(diǎn)與母本同種的雄株相同，就會(huì)出現(xiàn)鑒別錯(cuò)誤，因此陳洪偉等(2009)又采用了AFLP標(biāo)記對(duì)SSR鑒別結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。而物種特異性引物用于種間雜交子代鑒別時(shí)，即使在雜交過(guò)程中受到來(lái)自于母本同種雄性個(gè)體花粉的污染，但子代的遺傳信息與母本相同，因此理論上1對(duì)物種特異性引物就可以鑒定出真實(shí)雜交子代。本試驗(yàn)采用基于全基因組測(cè)序開發(fā)的美洲黑楊和小葉楊種特異性的InDel引物，篩選出2對(duì)InDel引物，分別位于第Ⅱ和第ⅩⅢ染色體上，引物之間也不存在共分離，2對(duì)引物中任意1對(duì)都可以用于美洲黑楊與小葉楊種間雜交子代的真實(shí)性鑒定，鑒定準(zhǔn)確率均為100%。

物種特異性引物用于植物種間雜交子代鑒別具有較高的效率，但引物開發(fā)首先要有大量的共顯性標(biāo)記，然后還需要大量的自然群體材料進(jìn)行種特異性驗(yàn)證。張紅蓮等(2010)對(duì)鵝掌楸屬(Liriodendron)種間雜交子代鑒別時(shí)，從176對(duì)EST-SSR引物中僅篩選出1對(duì)物種特異性引物，此種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且效率較低。隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的植物材料被用于基因組denovo測(cè)序或重測(cè)序，將種內(nèi)所有重測(cè)序序列比對(duì)到參考基因組，根據(jù)位點(diǎn)的基因型分型，直接可用于多態(tài)性引物或物種特異性引物的篩選。本研究采用美洲黑楊和小葉楊各10個(gè)個(gè)體的重測(cè)序序列，比對(duì)到美洲黑楊基因組，共找到種內(nèi)保守、種間長(zhǎng)度差異大于5 bp的位點(diǎn)18 418個(gè)，并從6對(duì)通用性引物中，成功篩選到2對(duì)美洲黑楊和小葉楊的種特異性引物，并通過(guò)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)自然群體材料進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，可以用于黑楊派與青楊派種間雜交子代的鑒別。同時(shí)InDel標(biāo)記與SSR標(biāo)記相比，它在基因組內(nèi)分布廣泛、密度高、帶型穩(wěn)定、通用性較強(qiáng)(V?lietal.,2008)。馮芳君等(2005)發(fā)現(xiàn)，InDel標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物帶型比SSR標(biāo)記清晰簡(jiǎn)單，且產(chǎn)物的分離效果和穩(wěn)定性也明顯優(yōu)于SSR。本試驗(yàn)開發(fā)的InDel標(biāo)記為美洲黑楊與小葉楊雜交子代的真實(shí)性鑒定提供了一種快速、便捷、準(zhǔn)確率高的鑒別方法。

4 結(jié)論

本文開展了基于重測(cè)序技術(shù)的美洲黑楊和小葉楊物種特異性引物開發(fā)研究，從10對(duì)InDel引物中篩選出2對(duì)種內(nèi)特異、種間存在差異的引物，可以用于美洲黑楊與小葉楊種間雜交子代的真實(shí)性鑒定，鑒定的準(zhǔn)確率為100%，這為楊樹種間雜交選育新品種的真實(shí)性鑒定提供了有效的方法。