韓昆瑾 郭娟娟 呂梓晴 李玉言 王世杰 楊敏生 王進(jìn)茂

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 保定 071001)

楊樹(Populus)是世界上分布范圍最廣、用途最多、適應(yīng)性最強(qiáng)的樹種之一。在我國(guó)，楊樹主要應(yīng)用于木材生產(chǎn)、生態(tài)防護(hù)和通道綠化等方面，由于其具有高生長(zhǎng)率和易繁殖等特點(diǎn)而受到廣泛重視。然而，楊樹在栽培種植過(guò)程中易受到蟲害威脅，食葉害蟲中鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲美國(guó)白蛾(Hyphantriacunea)及鞘翅目(Coleoptera)昆蟲柳藍(lán)葉甲(Plagioderaversicolora)等危害較為嚴(yán)重。蟲害除影響楊樹生長(zhǎng)和木材質(zhì)量外，還會(huì)給林業(yè)經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益帶來(lái)巨大損失。據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)每年因病蟲害損失約 880億元，其中直接經(jīng)濟(jì)損失145億元，生態(tài)服務(wù)價(jià)值損失 735億元(蘇宏鈞等，2004)，同時(shí)蟲害造成的葉損失會(huì)使森林由碳匯變?yōu)樘荚?(Kurzetal.,2008)。利用植物基因工程解決楊樹蟲害問(wèn)題是一種較為有效的途徑。楊樹作為林木基因工程中的一種模式植物，其在抗蟲轉(zhuǎn)基因研究中也取得了許多突破性進(jìn)展(Zuoetal.,2018;Zhangetal.,2016)，目前，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)晶體蛋白基因(Bt)、蛋白酶抑制劑類基因(PI)和昆蟲毒素基因等已應(yīng)用于楊樹抗蟲轉(zhuǎn)基因研究(睢韡等，2019)。但這些外源基因能否在受體植物中穩(wěn)定表達(dá)，還需要進(jìn)行長(zhǎng)期觀測(cè)。Hawkins等(2003)檢測(cè)了楊樹的44個(gè)不同轉(zhuǎn)基因株系，發(fā)現(xiàn)1個(gè)沉默株系，推測(cè)在木本植物中基因沉默相對(duì)較少，且在轉(zhuǎn)錄開始便已沉默。胡建軍等(2007)觀察并檢測(cè)了7年生的轉(zhuǎn)Bt基因歐洲黑楊(Populusnigra)，調(diào)查結(jié)果表明Bt基因能夠穩(wěn)定表達(dá)，且未發(fā)現(xiàn)害蟲對(duì)轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生耐受性。轉(zhuǎn)基因楊樹中外源基因穩(wěn)定性與環(huán)境也存在一定的相關(guān)性，樹木的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，基因沉默的可能性增加(魏冰等，2009)。

本研究以河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室培育的轉(zhuǎn)多基因歐美楊107楊(Populus×euramericana‘Neva’)為植物材料，對(duì)6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系2年生田間苗通過(guò)PCR技術(shù)鑒定外源基因是否穩(wěn)定存在，研究Bt基因表達(dá)情況以及生長(zhǎng)季的毒蛋白含量，以美國(guó)白蛾和柳藍(lán)葉甲為測(cè)試?yán)ハx檢測(cè)轉(zhuǎn)多基因107楊的抗蟲性。通過(guò)分析轉(zhuǎn)多基因107楊的外源基因表達(dá)情況及表達(dá)效率等問(wèn)題，為轉(zhuǎn)多基因楊樹的品種培育和推廣提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 試驗(yàn)材料為轉(zhuǎn)Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107楊(簡(jiǎn)稱V1)株系ECAA1、ECAA2、ECAA3及轉(zhuǎn)Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因107楊(簡(jiǎn)稱V2)株系ECAB1、ECAB2、ECAB3。其中，V1載體(圖1a)攜帶抗蟲的Bt基因Cry1Ac和Cry3A，同時(shí)攜帶有甜菜堿醛脫氫酶基因BADH，基因Cry1Ac和Cry3A的啟動(dòng)子為CAMV35S啟動(dòng)子，Cry1Ac基因接近載體右臂，Cry3A接近載體左臂；V2載體(圖1b)同樣攜帶抗蟲的Bt基因Cry1Ac和Cry3A，同時(shí)攜帶有煙草乙烯受體基因NTHK1，基因Cry1Ac和Cry3A的啟動(dòng)子及位置與V1載體相同。以未轉(zhuǎn)基因107楊為對(duì)照。轉(zhuǎn)基因植株為栽植在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)林學(xué)院專用苗圃中的2年生幼樹，正常管理，整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中未施用任何農(nóng)藥。

圖1 載體結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of vectora:載體V1結(jié)構(gòu)圖；b：載體V2結(jié)構(gòu)圖。a:The structure of vector V1;b:The structure of vector V2.

1.1.2 測(cè)試?yán)ハx 美國(guó)白蛾屬昆蟲綱(Insecta)鱗翅目燈蛾科(Arctiidae)，幼蟲卵塊由北京林業(yè)大學(xué)陳敏教授提供(2019年7月)。柳藍(lán)葉甲屬昆蟲綱鞘翅目葉甲科(Chrysomelidae)，成蟲、幼蟲或卵塊取自保定滿城和河北農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃(2019年7月底至8月初)。

1.2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

采集2年生轉(zhuǎn)基因苗木當(dāng)年生的長(zhǎng)枝葉片，采用改良的 CTAB法提取各轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照植株的基因組DNA。以基因組DNA為模板，分別用Cry1Ac、Cry3A基因的正反引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，正反引物的DNA序列及目的基因擴(kuò)增片段見(jiàn)表1。PCR檢測(cè)采用20 μL的反應(yīng)體系[ddH2O：12.8 μL；10×PCR Buffer：2 μL；引物R(10 pmol·L-1)：1 μL；引物F(10 pmol·L-1)：1 μL；DNTP：2 μL；2DNA：1 μL]，以含有Cry1Ac和Cry3A基因的質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以未轉(zhuǎn)基因的107楊的DNA作為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，50 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃退火5 min。PCR儀購(gòu)于新加坡Bio-Rad公司，型號(hào)為T1000。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.3 Cry1Ac和Cry3A毒蛋白的ELISA檢測(cè)

8月下旬于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)苗圃采集各轉(zhuǎn)基因株系及未轉(zhuǎn)基因歐美楊107楊2年生幼樹頂端完全展開的第3、4葉位的葉片，用于Cry1Ac、Cry3A毒蛋白檢測(cè)。采用美國(guó)Agdia公司的Bt-Cry1Ab/1Ac和Bt-Cry3A ELISA試劑盒，分別進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。檢測(cè)毒蛋白的陽(yáng)性對(duì)照為試劑盒自帶，陰性對(duì)照為對(duì)照組的107楊，檢測(cè)結(jié)果用 BioRad 550型酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。蛋白濃度以每g新鮮葉片所含毒蛋白質(zhì)量(ng)計(jì)算。每個(gè)處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 抗蟲性檢測(cè)

美國(guó)白蛾的1齡、2齡幼蟲用于檢測(cè)Cry1Ac毒蛋白的抗蟲性。1齡供試幼蟲為室內(nèi)孵化1～2天的初孵幼蟲，2齡幼蟲在未進(jìn)行試驗(yàn)前以107楊新鮮葉片飼養(yǎng)，其后用轉(zhuǎn)基因葉片進(jìn)行抗蟲性檢測(cè)，均設(shè)置對(duì)照組，飼喂至少量幼蟲結(jié)繭為止，歷時(shí)45天。

柳藍(lán)葉甲的1齡、2齡幼蟲及成蟲用于檢測(cè)Cry3A毒蛋白的抗蟲性，其幼蟲飼喂試驗(yàn)方法與美國(guó)白蛾大致相同，增加2齡供試幼蟲與1齡幼蟲進(jìn)行混齡抗蟲性試驗(yàn)，同時(shí)增加成蟲抗性試驗(yàn)。各試驗(yàn)均以未轉(zhuǎn)基因107楊作為對(duì)照組，飼喂至試驗(yàn)幼蟲發(fā)育成蛹或成蟲出現(xiàn)大面積死亡為止，歷時(shí)20天。

采集各轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照組當(dāng)年生枝條新鮮葉片，將測(cè)試?yán)ハx均勻放置于葉片表面，盡量減少對(duì)試驗(yàn)昆蟲造成損傷，然后將葉片(插于花泥保鮮)安放在透明塑料盒中，盒蓋扎上小孔，保證透氣性。

試驗(yàn)中，美國(guó)白蛾初孵幼蟲各株系設(shè)置2～4個(gè)重復(fù)，每處理20～30頭；美國(guó)白蛾2齡幼蟲各株系設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每處理10頭。柳藍(lán)葉甲初孵幼蟲各株系設(shè)置4個(gè)重復(fù)，每處理30頭；其余蟲期各株系設(shè)置3個(gè)重復(fù)，1齡、2齡混齡幼蟲每處理20頭，成蟲每處理15頭。

計(jì)算公式如下：

總死亡率=Σ(各重復(fù)昆蟲死亡數(shù)/該重復(fù)內(nèi)測(cè)試?yán)ハx總頭數(shù))/重復(fù)數(shù)；

校正死亡率=(轉(zhuǎn)基因株系死亡率-對(duì)照死亡率)/(1-對(duì)照死亡率)；

總增長(zhǎng)率=(最后一天的體質(zhì)量/體長(zhǎng)-第1天的體質(zhì)量/體長(zhǎng))/天數(shù)；

取食葉面積率=取食面積/葉片總面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

利用Cry1Ac和Cry3A基因的特異性引物對(duì)6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系2年生田間苗DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以帶有目的片段的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)基因107楊為陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，在6個(gè)轉(zhuǎn)基因107楊株系DNA中，均能檢測(cè)到Cry1Ac基因(圖2a，特異性條帶為546 bp)和Cry3A基因(圖2b，特異性條帶為667 bp)，而對(duì)照組均未檢測(cè)到特異性條帶，說(shuō)明轉(zhuǎn)多基因107楊在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，未發(fā)生外源目的基因的丟失。

圖2 外源基因的PCR檢測(cè)Fig.2 PCR amplification of the exogenous genes of various transgenic linesa:Cry1Ac基因的PCR檢測(cè)；b：Cry3A基因PCR檢測(cè)。CK+：質(zhì)粒p09687199；CK-：陰性對(duì)照(未轉(zhuǎn)基因植株)；M：DL2000 DNA Marker(自上而下為2 000，1 000，750，500，250，100 bp)。ECAA1-3：轉(zhuǎn)Cry1Ac-Cry3A-BADH基因的3個(gè)株系；ECAB1-3：轉(zhuǎn)Cry1Ac-Cry3A-NTHK1的3個(gè)株系。a:PCR detection of Cry1Ac;b:PCR detection of Cry3A. CK+:Plasmid p09687199;CK-:Control (Untransformed line);M:DL2000 DNA Marker (From up to down,these are 2 000,1 000,750,500,250,100 bp).ECAA1-3：Three lines transformed with Cry1Ac-Cry3A-BADH gene；ECAB1-3：Three lines transformed with Cry1Ac-Cry3A-NTHK1 gene.

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的Bt毒蛋白檢測(cè)

8月下旬采用ELISA法對(duì)轉(zhuǎn)多基因107楊葉片中Cry1Ac和Cry3A毒蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(圖3)表明，轉(zhuǎn)基因株系均含有2種Bt毒蛋白，但對(duì)照組均未檢測(cè)到。各轉(zhuǎn)基因株系Cry1Ac毒蛋白含量(3.60～20.76 ng·g-1)均明顯低于Cry3A毒蛋白含量(3 479.66～7 230.29 ng·g-1)，二者相差1 000倍左右。各株系間Cry1Ac毒蛋白含量存在顯著差異，株系ECAA1和ECAB3中含量較高，而株系ECAA3和ECAB2中含量較少。顯著低于其他株系。各轉(zhuǎn)基因株系中Cry3A毒蛋白含量均較高，且各株系間也存在顯著差異，株系ECAA1中毒蛋白含量最高，株系ECAA3與ECAB1中毒蛋白含量較少。在各株系中ECAA1的Cry1Ac和Cry3A毒蛋白含量均是最高的。

圖3 轉(zhuǎn)基因107楊不同株系的Cry1Ac和Cry3A毒蛋白含量Fig.3 Content of Cry1Ac and Cry3A toxin protein in different lines of transgenic 107 poplar

2.3 轉(zhuǎn)基因株系的抗蟲性檢測(cè)

2.3.1 對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲的抗性 用轉(zhuǎn)多基因107楊飼養(yǎng)美國(guó)白蛾1齡幼蟲14天，結(jié)果如表2所示。各株系之間美國(guó)白蛾的致死效果存在顯著差異，株系ECAA2、ECAA3和ECAB1對(duì)1齡幼蟲的致死效果較好，其中ECAB1抗性最高，其校正死亡率為100%。美國(guó)白蛾幼蟲在前6天死亡個(gè)數(shù)較多，隨后死亡率降低，但在12～14天，幼蟲的死亡個(gè)數(shù)突然增加，這可能與Cry1Ac毒蛋白的積累有關(guān)。

表2 轉(zhuǎn)基因株系對(duì)美國(guó)白蛾1齡幼蟲的致死作用①Tab.2 Lethal effect of transgenic lines on the 1st instar larvae of Hyphantria cunea

2.3.2 對(duì)美國(guó)白蛾的滯育效應(yīng) 用各轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照組107楊飼喂美國(guó)白蛾1齡幼蟲，圖4為飼喂不同天數(shù)時(shí)美國(guó)白蛾的各齡級(jí)分布。從圖可以明顯看出，美國(guó)白蛾的發(fā)育進(jìn)程，對(duì)照組植株在7天時(shí)已全部進(jìn)入2齡以上，而轉(zhuǎn)基因株系ECAA1、ECAA2和ECAA3中，仍存在很多1齡幼蟲，其中株系ECAA2的滯育表現(xiàn)最好。其他株系在7天時(shí)均出現(xiàn)3齡幼蟲，僅ECAB1的幼蟲全部處于2齡階段。到達(dá)13天時(shí)，對(duì)照組已大部分進(jìn)入4、5齡，此時(shí)轉(zhuǎn)基因株系ECAB1的幼蟲已全部死亡，轉(zhuǎn)基因株系ECAA2仍存在1齡幼蟲，ECAA1、ECAA3有較多的2齡幼蟲。由此可見(jiàn)，轉(zhuǎn)基因株系ECAA1、ECAA2、ECAA3和ECAB1對(duì)美國(guó)白蛾1齡幼蟲有較為明顯的抑制其生長(zhǎng)發(fā)育的作用，即延緩其發(fā)育進(jìn)度；而另外2個(gè)株系對(duì)美國(guó)白蛾生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)明顯抑制作用。

圖4 美國(guó)白蛾初孵幼蟲發(fā)育進(jìn)度Fig.4 Developmental progress of the first hatched larvae of Hyphantria cunea

用轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照飼喂的2齡幼蟲，結(jié)果見(jiàn)表3、圖5和圖6，可以看出各轉(zhuǎn)基因株系取食率皆低于對(duì)照組107楊。在8月6日至7日和8月14日至15日期間對(duì)照組美國(guó)白蛾的采食率、體質(zhì)量及體長(zhǎng)均高于轉(zhuǎn)基因各株系，特別是株系ECAA1、ECAA3、ECAB1、ECAB2均明顯抑制了美國(guó)白蛾2齡幼蟲的取食活動(dòng)，進(jìn)而影響其生長(zhǎng)發(fā)育，且各株系間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。由表3可看出，在8月6日至7日時(shí)間段內(nèi)，對(duì)照組107楊取食面積最高，而從圖6也可以看出轉(zhuǎn)基因107楊株系ECAA3、ECAB1、ECAB2的取食面積較低，由此表明目的基因在受體107楊中得到較好表達(dá)。

表3 美國(guó)白蛾2齡幼蟲平均采食率與死亡數(shù)①Tab.3 Average feeding rate and mortality of the 2nd instar larvae of Hyphantria cunea

圖5 美國(guó)白蛾2齡幼蟲平均體長(zhǎng)、質(zhì)量Fig.5 Average body length or weight of the 2nd instar larvae of Hyphantria cunea

2.3.3 轉(zhuǎn)基因株系對(duì)柳藍(lán)葉甲的抗性檢測(cè) 圖7結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系ECAA2對(duì)柳藍(lán)葉甲無(wú)論幼蟲還是成蟲致死率皆為最低，表現(xiàn)中低抗蟲性。除株系ECAA2外，其他轉(zhuǎn)基因株系對(duì)柳藍(lán)葉甲1齡幼蟲的致死率均達(dá)到100%。對(duì)1、2齡混齡幼蟲的致死率均在85%～100%之間，其中株系ECAB2 和ECAB3的致死率為100%。對(duì)于成蟲，株系ECAA3、ECAB1、ECAB2和ECAB3的致死效果較好，致死率在90%以上，且6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系之間存在顯著性差異。圖8可以看出轉(zhuǎn)基因株系明顯抑制了柳藍(lán)葉甲成蟲的取食。

3 討論

植物的大多數(shù)性狀和生理功能都是通過(guò)多基因的協(xié)調(diào)表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，而轉(zhuǎn)多基因植株可通過(guò)協(xié)調(diào)控制多種外源基因的表達(dá)來(lái)綜合改善植物的性狀(初易洋等，2016)。多基因轉(zhuǎn)化指將2個(gè)及以上的外源基因轉(zhuǎn)入受體植株中，且轉(zhuǎn)化的多基因可以是不同的抗性基因或是改良植物性狀的基因。楊夢(mèng)悅(2006)將DREB(調(diào)節(jié)逆境脅迫)、IRT1(提高耐缺鐵性)和rolC(毛狀根誘導(dǎo))融合三價(jià)基因 (Rirol)轉(zhuǎn)入八棱海棠(Malusrobusta)，其轉(zhuǎn)基因植株明顯表現(xiàn)出耐鹽、矮化和生根力強(qiáng)等性狀。王建革等(2006)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)SacB、vgb、BtCry3A+OC-Ⅰ、調(diào)節(jié)基因JERF36及報(bào)告基因NPTⅡ等基因的庫(kù)安托楊(Populus×euramericana‘Guariento’)具有抗鹽堿能力的同時(shí)，又具有Cry3A基因的抗蟲性。另外在對(duì)Bt基因的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)2個(gè)Bt基因同時(shí)存在時(shí)，楊樹表現(xiàn)為雙抗性，從而擴(kuò)大抗蟲譜，提高抗蟲效果(張超等，2019)。

本研究中，采用2年生轉(zhuǎn)多基因107楊株系的葉片進(jìn)行外源基因表達(dá)檢測(cè)和抗蟲試驗(yàn)，顯示外源基因仍存在于基因組中，2種Bt毒蛋白均存在，且對(duì)美國(guó)白蛾和柳藍(lán)葉甲表現(xiàn)雙抗性，說(shuō)明2年生轉(zhuǎn)基因楊樹的外源基因依舊穩(wěn)定表達(dá)。李秀芬(2008)在轉(zhuǎn)Bt基因的南林895楊(Populus×euramericana‘Nanlin895’)研究中證明其繼代培養(yǎng)4年后仍然攜帶外源目的基因；陳虞超等(2014)在對(duì)9年生抗蟲轉(zhuǎn)基因銀河楊(Populusalba×P.hopeiensis)的抗蟲性檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)基因銀河楊的外源抗蟲基因仍然表達(dá)正常。充分證明轉(zhuǎn)多基因植物的外源基因能夠保持長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在和表達(dá)。

本試驗(yàn)中，8月末各轉(zhuǎn)基因株系中Cry1Ac毒蛋白在葉片中含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Cry3A毒蛋白在葉片中的含量，Cry3A毒蛋白在葉片中含量約是 Cry1Ac毒蛋白的103～104倍。張超等(2019)對(duì)1年生轉(zhuǎn)Bt基因107楊毒蛋白的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Cry1Ac毒蛋白含量在9月份達(dá)到最高，Cry3A毒蛋白含量在8月份達(dá)到最高；徐麗娜等(2015)認(rèn)為蛋白質(zhì)含量的季節(jié)性和時(shí)空變化是植物體內(nèi)毒蛋白的積累和其代謝過(guò)程所造成的，理論上蛋白含量應(yīng)增加。但經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)抗蟲基因三倍體毛白楊的抗蟲性雖表達(dá)穩(wěn)定，但隨著樹齡的增大Bt基因的表達(dá)強(qiáng)度會(huì)減弱(李立，2009)，具體原因有待研究。

本試驗(yàn)的轉(zhuǎn)化載體V1及V2的啟動(dòng)子均為CaMV35S啟動(dòng)子，4個(gè)外源基因分別為Cry3A、Cry1Ac、BADH和NTHK1，其中，Cry1Ac基因處于上游，Cry3A處于下游。試驗(yàn)結(jié)果顯示，Cry1Ac毒蛋白含量明顯低于Cry3A。Xu等(2016)認(rèn)為在載體中上游Bt基因的表達(dá)水平較低；而張冰玉等(2006)認(rèn)為是由于Cry1Ac基因和Cry3A基因的同源性高，易出現(xiàn)共抑制狀況。轉(zhuǎn)多基因工程中存在的基因沉默等問(wèn)題，成為了影響受體植物外源基因表達(dá)穩(wěn)定性和高效性的巨大障礙，而引起基因沉默的原因大致分為3類：第1種為位置效應(yīng)引起的基因沉默，可以通過(guò)調(diào)整目的基因在載體中的排列位置與方向，或是在外源基因的兩側(cè)加上MAR結(jié)構(gòu)，顯著減少共抑制狀況，提高外源基因表達(dá)水平的穩(wěn)定性和效率，如Qiu等(2017)發(fā)現(xiàn)2個(gè)Bt基因處于相反方向排列時(shí)，對(duì)2個(gè)目的基因的表達(dá)均有較強(qiáng)的促進(jìn)作用；第2種為轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默，主要是由啟動(dòng)子甲基化引起，Giho等(2012)研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入受體植物本氏煙草(Nicotianabenthamiana)的花椰菜病毒，因35S啟動(dòng)子發(fā)生甲基化導(dǎo)致其基因沉默，啟動(dòng)子的甲基化對(duì)轉(zhuǎn)基因的遺傳穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響，可使用去甲基化試劑、修飾外源基因的序列或是選取有效促動(dòng)劑等方法解決轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默問(wèn)題；第3種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，應(yīng)通過(guò)盡量避免或是減少基因之間的同源性等方法解決(李寶健等，2005)。

本試驗(yàn)通過(guò)統(tǒng)計(jì)幼蟲、成蟲的致死率、發(fā)育進(jìn)度、蟲長(zhǎng)和蟲質(zhì)量，篩選出具中高雙抗性株系ECAA3和ECAB1，但發(fā)現(xiàn)這2個(gè)株系的Cry1Ac毒蛋白和Cry3A毒蛋白含量與抗蟲性之間無(wú)明顯規(guī)律性，毒蛋白含量與抗蟲性關(guān)系還有待進(jìn)一步研究，同時(shí)再次驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因楊樹能夠顯著毒殺靶標(biāo)害蟲。另外，轉(zhuǎn)基因株系對(duì)低齡幼蟲有較強(qiáng)致死效果，因低齡幼蟲對(duì)Bt毒蛋白較為敏感，其作用機(jī)理為Bt毒蛋白進(jìn)入幼蟲體內(nèi)轉(zhuǎn)化成活化了的毒素與腸道上皮的特異受體結(jié)合，形成穿孔導(dǎo)致幼蟲死亡(Batesetal.，2005)；而對(duì)高齡幼蟲的滯育效果較明顯，可能是隨著蟲齡的增長(zhǎng)，蟲體的解毒酶活力增加，而抗蟲毒蛋白被降解，故死亡率降低，但可以有效地抑制幼蟲的體長(zhǎng)與體質(zhì)量的增長(zhǎng)和發(fā)育速率(田亞坤等，2014)。轉(zhuǎn)多基因庫(kù)安托楊具有抗旱、抗?jié)?、抗鹽堿和抗鞘翅目昆蟲的特點(diǎn)(李環(huán)，2008)，這種轉(zhuǎn)入的多個(gè)基因均能在楊樹中穩(wěn)定表達(dá)，與本次試驗(yàn)中所選出的高抗株系中多基因穩(wěn)定表達(dá)的結(jié)果相似。

抗蟲基因轉(zhuǎn)化有諸多優(yōu)點(diǎn)，不僅可以實(shí)現(xiàn)定向改造植株的目標(biāo)，而且可以擴(kuò)大林木的抗蟲譜，達(dá)到一種林木具多抗蟲性的目的。但仍存在轉(zhuǎn)化效率低、重復(fù)性差和在受體中不能穩(wěn)定表達(dá)等問(wèn)題，特別是外源基因能否穩(wěn)定保留在基因組中的問(wèn)題(Zhangetal.，2016)仍需深入研究。因此，為了使外源基因安全穩(wěn)定表達(dá)、提高林木品質(zhì)仍需進(jìn)一步的研究和探討。同時(shí)，本試驗(yàn)中的毒蛋白含量與抗蟲性關(guān)系還待進(jìn)一步研究，且未對(duì)BADH和NTHK1這2種耐鹽基因進(jìn)行檢測(cè)和表達(dá)分析，未來(lái)需要進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)多基因107楊2年生田間苗各株系的外源基因仍然存在且穩(wěn)定表達(dá)，不同轉(zhuǎn)基因株系間抗蟲性差異顯著，株系ECAA3對(duì)美國(guó)白蛾1齡幼蟲具有明顯抑制其生長(zhǎng)發(fā)育的作用,株系ECAB1對(duì)美國(guó)白蛾的致死率最高，ECAA3和ECAB1株系對(duì)柳藍(lán)葉甲和美國(guó)白蛾均有較高抗性。