戴曉港, 劉景勝, 李淑嫻

(南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院/南方楊樹(shù)工程技術(shù)研究中心/江蘇省楊樹(shù)種質(zhì)創(chuàng)新與品種改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 南京 210037)

植物在整個(gè)生命活動(dòng)過(guò)程中會(huì)不斷受到各種生物脅迫(如食草動(dòng)物和害蟲(chóng)的啃食、病原體侵染)和非生物脅迫(如干旱、低溫、高溫、土壤高鹽堿等)的影響，然而植物不能自由移動(dòng)來(lái)躲避這些不利環(huán)境，因此在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，植物逐漸從形態(tài)、生理、細(xì)胞以及分子水平發(fā)生進(jìn)化以應(yīng)對(duì)這些不利環(huán)境條件。當(dāng)植物受到脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)，相關(guān)基因、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物構(gòu)成復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以應(yīng)答相應(yīng)的脅迫。轉(zhuǎn)錄因子作為反式作用因子可以與靶標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域相應(yīng)的順式作用元件特異結(jié)合，從而調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，在植物應(yīng)答生物脅迫和非生物脅迫中具有舉足輕重的作用[1]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中的超級(jí)轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其典型特征是在氨基酸N-端有保守的WRKYGQK結(jié)構(gòu)域，在C-端含有C2H2或C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)[2]。根據(jù)上述保守結(jié)構(gòu)域數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)類(lèi)型可將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為3組：第I組包含2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)；第II組含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)；而第Ⅲ類(lèi)是由1個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域和C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)組成[2]。大量研究表明，WRKY在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物脅迫和非生物脅迫[3-4]、次生代謝等多種生物過(guò)程中起著重要的作用[5-6]。如木本雞腳棉中GaWRKY1轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控卡丁烯合酶-A的活性，從而參與棉酚等倍半萜烯類(lèi)化合物的合成[5]；從黃花蒿分泌型腺毛中分離的AaWRKY1通過(guò)上調(diào)倍半萜環(huán)化酶基因ADS的表達(dá)，從而提高抗瘧青蒿素的生物合成[6]。隨著基因組測(cè)序的發(fā)展，藥用植物越來(lái)越引起大家的關(guān)注，這也為鑒定更多的參與調(diào)控次生代謝的WRKY轉(zhuǎn)錄因子提供可能。

望春玉蘭(Yulaniabiondii)是木蘭科(Magnoliaceae)玉蘭屬多年生落葉喬木，是中國(guó)特有的珍稀瀕危樹(shù)種，原產(chǎn)湖北、河南、陜西、甘肅等地海拔600—1 200 m的闊葉林中[7]。望春玉蘭先花后葉，種子鮮紅，樹(shù)形優(yōu)美，被廣泛應(yīng)用于園林綠化[7]，其干燥的花蕾是中藥材“辛夷”的正品，具有散風(fēng)寒、通肺竅、降壓、殺菌等作用，是一種用途廣泛的藥用植物[8]。望春玉蘭具有一定的耐寒性，喜微酸性土壤，但堿性土壤對(duì)生長(zhǎng)的影響較大。望春玉蘭全基因組測(cè)序的完成為WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定和分析提供了基礎(chǔ)，本研究對(duì)望春玉蘭WRKY基因家族成員進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)蛋白理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)進(jìn)化、保守結(jié)構(gòu)域、順式作用元件、以及在不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行了初步研究，以期為深入研究該基因家族在望春玉蘭中應(yīng)答非生物脅迫以及次生代謝的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子查找及理化性質(zhì)分析

從國(guó)家基因庫(kù)生命大數(shù)據(jù)平臺(tái)(https://db.cngb.org/codeplot/)中下載望春玉蘭基因組和轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)(CNP0000884)[9]，利用hmmsearch v3.3.2將WRKY隱馬爾可夫模型(Pfam: PF00847)和下載的望春玉蘭蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，保留E-value≤1e-5的蛋白序列，再采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域鑒定[10]，去除不含WRKY保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。采用Expasy[11](https://web.expasy.org/protparam/)在線預(yù)測(cè)蛋白分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)，并利用Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)對(duì)鑒定的WRKY基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化樹(shù)分析

從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/WRKY-Som.jsp)下載擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子序列。根據(jù)SMART分析結(jié)果提取擬南芥和望春玉蘭WRKY轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域序列，并提交到MEGA-6.0[12]軟件中利用ClustalW進(jìn)行多重比對(duì)，然后用鄰接法(Neighbor Joining method)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，bootstrap值設(shè)置為1 000，最后采用Figtree(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)對(duì)構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行可視化，根據(jù)進(jìn)化樹(shù)中擬南芥WRKY家族的分類(lèi)對(duì)望春玉蘭WRKY家族進(jìn)行類(lèi)群的劃分。

1.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守基序和基因結(jié)構(gòu)

利用MEME(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)在線預(yù)測(cè)望春玉蘭WRKY蛋白的保守基序(Motif)，Motif個(gè)數(shù)設(shè)置為10個(gè)，基序長(zhǎng)度為6—70，其他參數(shù)均為默認(rèn)值。根據(jù)MEME的分析結(jié)果，結(jié)合基因注釋的gff文件，利用TBtools[13]對(duì)保守基序、基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行整合，繪制望春玉蘭WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守基序和基因結(jié)構(gòu)圖。

1.4 WRKY轉(zhuǎn)錄因子順式作用元件分析

利用perl腳本根據(jù)基因組注釋的gff文件，從基因組中提取目的基因上游2 000 bp序列，用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行順式作用元件分析，最后利用TBtools[13]結(jié)合進(jìn)化樹(shù)并繪制順式作用元件分布圖。

1.5 WRKY轉(zhuǎn)錄因子染色體定位及串聯(lián)重復(fù)基因分析

根據(jù)基因組注釋的gff文件，使用TBtools[13]繪制望春玉蘭WRKY轉(zhuǎn)錄因子在染色體上的分布圖。串聯(lián)重復(fù)基因的鑒定參照Lehti-Shiu對(duì)毛果楊基因組串聯(lián)重復(fù)基因的鑒定標(biāo)準(zhǔn)：2個(gè)基因之間不超過(guò)350 kb且中間插入的基因不超過(guò)10個(gè)，進(jìn)化樹(shù)上它們還需要同屬于1個(gè)亞家族[14]。

1.6 WRKY轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)分析

將從國(guó)家基因庫(kù)生命大數(shù)據(jù)平臺(tái)中下載的望春玉蘭葉片(CNX0149886)和花(CNX0149883)的轉(zhuǎn)錄組，以及實(shí)驗(yàn)室測(cè)序的根系轉(zhuǎn)錄組，使用Trimmomatic[15]過(guò)濾低質(zhì)量序列，然后利用STAR[16]默認(rèn)參數(shù)將上述過(guò)濾后的序列分別比對(duì)到望春玉蘭基因組，統(tǒng)計(jì)根、葉和花分別比對(duì)到每個(gè)WRKY基因的序列數(shù)量，采用RPKM(reads per kilobase of transcripts per million mapped reads)對(duì)每個(gè)基因表達(dá)量進(jìn)行均一化。

2 結(jié)果與分析

2.1 望春玉蘭WRKY基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

本研究共鑒定出望春玉蘭WRKY基因家族有56個(gè)成員，各成員蛋白長(zhǎng)度、理化性質(zhì)、理論等電點(diǎn)和亞細(xì)胞定位等信息如表1。從表1中結(jié)果可以看出，蛋白長(zhǎng)度在106—1 675個(gè)氨基酸之間，不同基因氨基酸數(shù)量存在較大差異。通過(guò)Expasy在線分析了望春玉蘭WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白理化性質(zhì)，該家族基因蛋白分子量在12 215.15—191 326.88 Da之間，理論等電點(diǎn)在4.9—10.06之間。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，55個(gè)基因家族成員定位在細(xì)胞核，其中MBI36866_MAGBIO成員同時(shí)定位在細(xì)胞外間隙和細(xì)胞核，而MBI24213_MAGBIO還定位在細(xì)胞質(zhì)。

表1 望春玉蘭WRKY家族基因基本信息及蛋白理化性質(zhì)

2.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化分析

以望春玉蘭和擬南芥WRKY基因蛋白保守域序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，參照擬南芥WRKY基因家族的分類(lèi)，根據(jù)進(jìn)化樹(shù)和保守域序列結(jié)構(gòu)特征，將望春玉蘭WRKY轉(zhuǎn)錄因子劃分為Group Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ共3個(gè)組。Group Ⅰ具有2個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型，共有8個(gè)基因；Group Ⅱ只含有1個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)也是C2H2型，但根據(jù)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果又可將Group II進(jìn)一步分為Ⅱa，Ⅱb，Ⅱc，Ⅱd,Ⅱe共5個(gè)亞組，其成員數(shù)量分別為9，7，10，7,4個(gè)；Group Ⅲ雖然也只含有1個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域，但其鋅指結(jié)構(gòu)(C2HC)和其他2組不同，該組中共有7個(gè)基因。還有3個(gè)基因(MBI36007_MAGBIO、MBI46007_MAGBIO和MBI29696_MAGBIO)雖然含有WRKY保守結(jié)構(gòu)域，但序列與其他基因分化較大而未被分類(lèi)到現(xiàn)有的I，Ⅱ和Ⅲ組中(見(jiàn)圖1)。

圖1 望春玉蘭和擬南芥WRKY基因家族進(jìn)化樹(shù)

2.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白基序分析

利用MEME在線分析望春玉蘭WRKY基因家族的Motif，利用TBTools對(duì)Motif分析結(jié)果進(jìn)行可視化(見(jiàn)圖2)。望春玉蘭WRKY蛋白共包含10個(gè)Motif，其中Motif 1，Motif 2和Motif 3是WRKY的保守結(jié)構(gòu)域，Motif 1含有保守序列WRKYGQK，望春玉蘭所有WRKY蛋白都含有這個(gè)保守結(jié)構(gòu)域；Motif 1尾端2個(gè)蛋白和Motif 2構(gòu)成了WRKY結(jié)構(gòu)域的鋅指結(jié)構(gòu)(C2H2)，其中48個(gè)基因含有Motif 2結(jié)構(gòu)域；Motif 3是WRKY的完整結(jié)構(gòu)域，其中7個(gè)基因同時(shí)含有Motif 3和Motif 1，這類(lèi)基因因含有2個(gè)保守的WRKY結(jié)構(gòu)域而被劃分為Group I。Motif 4—Motif 10雖然在數(shù)據(jù)庫(kù)中暫無(wú)功能記錄，但這些Motif也為望春玉蘭WRKY基因分類(lèi)提供了重要參考，如Motif 8和Motif 10是Group I特有的，而Motif 5，Motif 6和Motif 9是Group IIa和Group IIb中特有?？傮w而言，望春玉蘭WRKY基因家族不同分組中Motif是相似的，這個(gè)結(jié)果也有利地支持了進(jìn)化樹(shù)對(duì)基因家族分類(lèi)的可靠性。

圖2 望春玉蘭WRKY基因家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域

2.4 WRKY轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件

利用PlantCARE注釋望春玉蘭56個(gè)WRKY基因上游2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)域序列，得到WRKY基因家族順式作用元件，除最基本的TATA box，CAAT box和光響應(yīng)元件之外，還含有參與各種激素、調(diào)控生長(zhǎng)、參與次生代謝和非生物脅迫等響應(yīng)元件。在激素類(lèi)響應(yīng)元件中，分別有53個(gè)和47個(gè)基因含有脫落酸反應(yīng)元件(abscisic acid responsiveness)和茉莉酸甲酯反應(yīng)元件(MeJA-responsiveness)；應(yīng)答水楊酸、赤霉素和生長(zhǎng)素響應(yīng)元件的基因相對(duì)較少，分別有32，26，18個(gè)。參與非生物脅迫相關(guān)的主要有無(wú)氧誘導(dǎo)(the anaerobic induction)、干旱誘導(dǎo)(drought-inducibility)、低溫響應(yīng)(low-temperature responsiveness)和防御脅迫(defense and stress responsiveness)等所必需的調(diào)節(jié)元件。MBI11137_MAGBIO含有多個(gè)干旱誘導(dǎo)響應(yīng)順式作用元件，推測(cè)該基因可能調(diào)控望春玉蘭響應(yīng)干旱脅迫。值得注意的是望春玉蘭WRKY基因除了參與激素響應(yīng)和非生物脅迫的順式作用元件，其中還有9個(gè)基因(MBI08947_MAGBIO，MBI10258_MAGBIO，MBI10883_MAGBIO，MBI12228_MAGBIO，MBI19961_MAGBIO，MBI36613_MAGBIO，MBI36866_MAGBIO，MBI42321_MAGBIO，MBI46335_MAGBIO)含有類(lèi)黃酮合成調(diào)節(jié)元件，參與植物的次生代謝。望春玉蘭的花蕾和根系入藥，表明了WRKY基因可能參與了次生代謝產(chǎn)物的合成調(diào)節(jié)。

2.5 WRKY基因家族染色體分布

望春玉蘭基因組共有19條染色體，而WRKY基因只分布在其中14條染色體上(見(jiàn)圖4)，Chr08，Chr09，Chr12，Chr13和Chr17均不含有WRKY基因。在含有WRKY基因的染色體中，Chr15，Chr14和Chr04這3條染色體含有WRKY基因的數(shù)量約占總數(shù)的48.2%，分別有12，9，6個(gè)；其余11條染色體WRKY基因的數(shù)量在1—3個(gè)不等。串聯(lián)重復(fù)是導(dǎo)致基因家族擴(kuò)張的主要方式之一，對(duì)望春玉蘭WRKY基因復(fù)制方式分析發(fā)現(xiàn)，這個(gè)基因家族中有9個(gè)串聯(lián)復(fù)制事件，包含20個(gè)WRKY基因，其中7次串聯(lián)復(fù)制發(fā)生在Chr14和Chr15上，這也是引起WRKY基因家族成員在染色體上分布不均勻的主要原因。

圖4 望春玉蘭WRKY基因家族在染色體上的分布(串聯(lián)復(fù)制)

2.6 望春玉蘭WRKY基因家族組織表達(dá)分析

基因表達(dá)模式可以揭示植物不同組織的生物學(xué)功能。將望春玉蘭葉片、花和根系轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列分別比對(duì)到基因組，分析WRKY家族基因在不同組織中的表達(dá)模式，結(jié)果如圖5所示。從圖5中可以看出，Group I中除了MBI36007_MAGBIO在根系中不表達(dá)，Group IId中除了MBI36007_MAGBIO在根系和葉片中不表達(dá)外，其余基因在所有組織中均檢測(cè)到表達(dá)，且Group IId中的基因整體表達(dá)量均較高。Group IIa中只有MBI32392_MAGBIO和MBI46105_MAGBIO在3個(gè)組織中均能檢測(cè)到表達(dá)，有5個(gè)基因在3個(gè)組織中均未檢測(cè)到表達(dá)，而MBI37104_MAGBIO和MBI05415_MAGBIO是葉片組織特異性基因，只在葉片中有表達(dá)量。Group IIb中有1個(gè)基因MBI37844_MAGBIO在3個(gè)組織中表達(dá)量均較高，F(xiàn)PKM值均超過(guò)10，還有3個(gè)基因只在根系特異表達(dá)。Group IIc中除了MBI24029_MAGBIO在葉片中特異表達(dá)外，其余基因在不同的組織中也都能檢測(cè)到表達(dá)。

圖5 望春玉蘭不同組織WRKY基因家族表達(dá)模式

3 討論

WRKY是植物中較大的基因家族，已被證實(shí)在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、發(fā)育、非生物脅迫中起到重要作用。隨著全基因組測(cè)序發(fā)展，已有幾十種雙子葉植物全基因組WRKY基因家族被鑒定和分析，而其基因家族中基因數(shù)量在45—188個(gè)不等[17]。本研究從望春玉蘭基因組中鑒定了56個(gè)WRKY基因，比較分析發(fā)現(xiàn)，望春玉蘭基因組(2.20 Gb)大小約是擬南芥(125 Mb)的18倍，但望春玉蘭WRKY基因的數(shù)量(56個(gè))卻只有擬南芥(74個(gè))的3/4；同樣，望春玉蘭基因組約是木本植物毛果楊(0.55 Gb)的4倍，但WRKY基因的數(shù)量卻不足毛果楊(122個(gè))的1/2[17]。上述結(jié)果說(shuō)明了基因組中，基因家族基因的數(shù)量并不是由基因組大小決定的。

根據(jù)WRKY基因保守結(jié)構(gòu)域序列和鋅指結(jié)構(gòu)類(lèi)型，同時(shí)結(jié)合擬南芥WRKY基因家族的分類(lèi)，將望春玉蘭WRKY基因家族分為3個(gè)組：Group Ⅰ，Group Ⅱ和Group Ⅲ，分別含有8，38和7個(gè)基因。然而在擬南芥和毛果楊中，Group I基因的數(shù)量占主導(dǎo)地位[18]，而望春玉蘭中Group II基因數(shù)量占67.9%，說(shuō)明Group II在進(jìn)化過(guò)程中可能發(fā)生了更多的基因復(fù)制。這與對(duì)望春玉蘭WRKY基因家族串聯(lián)復(fù)制分析結(jié)果一致，在望春玉蘭WRKY基因家族中共發(fā)現(xiàn)9個(gè)串聯(lián)重復(fù)，其中Group II中有5個(gè)串聯(lián)重復(fù)共產(chǎn)生了11個(gè)基因。望春玉蘭WRKY基因家族Group II可進(jìn)一步細(xì)分為IIa，IIb，IIc，IId和IIe共5個(gè)亞組，分別含有9，7，10，7,4個(gè)基因。對(duì)擬南芥、水稻、葡萄等7種植物基因組WRKY基因家族Group II基因數(shù)量分析發(fā)現(xiàn)，Group IIa基因的比例為8.8%—12.2%之間[18]，而望春玉蘭Group IIa基因的比例為23.7%，約是其他物種的2—3倍，說(shuō)明Group IIa在望春玉蘭中發(fā)生了大量擴(kuò)張。已有研究表明，WRKY基因家族的Group IIa基因可以提高擬南芥苗期和蘋(píng)果愈傷的滲透脅迫能力和抗鹽性[19]，也是調(diào)節(jié)水稻先天免疫能力的重要轉(zhuǎn)錄因子[20]，望春玉蘭Group IIa基因的大量擴(kuò)張，可能是在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中提高非生物脅迫的表現(xiàn)。

WRKY不僅調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、發(fā)育和參與非生物脅迫的調(diào)節(jié)，還參與調(diào)控植物的次生代謝。Xu等在棉花中克隆的GaWRKY1轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控卡丁烯合酶-A的活性，從而參與調(diào)節(jié)棉花倍半萜烯類(lèi)化合物的合成[5]；Liu等研究發(fā)現(xiàn)藥用植物杜仲WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與苯基丙胺酸和黃酮類(lèi)物質(zhì)合成代謝的調(diào)控[17]。望春玉蘭轉(zhuǎn)錄因子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，WRKY啟動(dòng)子區(qū)域不僅含有大量參與非生物脅迫的順式作用元件，還有9個(gè)基因含有參與黃酮類(lèi)物質(zhì)合成代謝的順式作用元件，其中MBI19961_MAGBIO和MBI08947_MAGBIO分別在根系和花中高表達(dá)，而根系和花是望春玉蘭藥物合成的主要組織，因此這2個(gè)基因可能影響望春玉蘭根系和花的次生代謝。