彭亞允， 栗 寧， 陳玉梅， 周景明， 劉紅亮， 祁艷華， 梁 超， 丁培陽， 朱習(xí)芳， 王愛萍

(鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南 鄭州 450001)

0 引言

宮頸癌是世界上女性常見的癌癥之一，現(xiàn)已證實高危型人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染是宮頸癌的主要病因。在大多數(shù)發(fā)展中國家，女性癌癥患者總數(shù)中有25%為宮頸癌患者[1]。隨著生物技術(shù)和檢測方法的發(fā)展，已經(jīng)有300多種HPV亞型被鑒定，已明確的高危亞型有12種，而HPV45屬于高危亞型之一，與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)[2]。L1蛋白是HPV病毒衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可組裝形成72個五聚體[3]。L2蛋白是次要結(jié)構(gòu)蛋白，它與病毒基因組DNA和L1蛋白都密切相關(guān)。L1蛋白在體外可以自組裝成病毒樣顆粒(VLPs)，其外觀與天然病毒顆粒相似[4-5]。這些VLPs已被證明具有高度免疫原性，并在開發(fā)預(yù)防性疫苗中起重要作用[6-7]。L1蛋白含有多個抗原表位，而表位是可以誘導(dǎo)人體產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答的基本單位，此外，它還是抗原特異性結(jié)合相應(yīng)抗體的部位。

通過單克隆抗體或多抗血清確定HPV L1蛋白的表位研究有很多，比如基于假病毒中和實驗篩選中和表位(pseudovirion-based neutralization assay，PBNA)[8]，L1蛋白重疊多肽免疫血清篩選鑒定B細胞表位[3]等；另外還有基于噬菌體肽庫獲得模擬表位的研究[9]。噬菌體展示技術(shù)，也稱為體外選擇技術(shù)，是一種將肽或蛋白質(zhì)與噬菌體外殼蛋白結(jié)合并在噬菌體表面展示的生物技術(shù)[10]。噬菌體展示技術(shù)是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究的關(guān)鍵工具，可用于篩選靶向單克隆抗體的抗原模擬表位，并且通過這種方法篩選表位更加簡單[11-12]。但是很少有人使用噬菌體展示技術(shù)篩選HPV45 L1蛋白的表位。本研究成功制備了抗HPV45 L1蛋白的單克隆抗體，使用噬菌體隨機十二肽庫篩選，并通過Dot-ELISA和間接競爭ELISA鑒定了單克隆抗體識別的HPV45 L1蛋白的線性表位，為進一步研究HPV45 L1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供幫助。

1 材料和方法

1.1 菌株、試劑、細胞和噬菌體肽庫

SUMO-HPV45 L1-BL21(DE3)原核表達菌株和SP2/0骨髓瘤細胞由鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子免疫學(xué)實驗室保存；p45Shell假病毒制備質(zhì)粒由Prof. John T. Schiller惠贈；Ph.D.-12TM噬菌體展示肽庫試劑盒和大腸桿菌ER2738購自New England BioLabs；RPMI Medium 1640、HAT Supplement從Gibco購買；辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(HRP-goat anti mouse IgG)、抗His單克隆抗體購自Abbkine；X-gal，PEG 8000、四環(huán)素購自Solarbio。

1.2 重組L1蛋白的表達、純化及鑒定

BL21(DE3)-SUMO-HPV45 L1重組表達菌株以1∶1 000的比例接種在含有氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日，將1 mL過夜培養(yǎng)物添加到100 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，加入0.1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)，在16 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后，離心收集細菌培養(yǎng)物，使用磷酸鹽緩沖液重懸。用超聲破碎儀裂解菌體，12 000 r/min離心15 min，收集可溶性重組L1蛋白，使用Ni-NTA親和層析方法對蛋白進行純化，通過12% SDS-PAGE，Western-blot鑒定純化的L1蛋白，并通過血凝實驗(hemagglutination test, HA)鑒定重組蛋白活性。其中western-blot鑒定時一抗選用的是1∶5 000稀釋的抗-His單抗。HA鑒定：SUMO-45 L1連續(xù)用PBS進行2倍連續(xù)倍比稀釋，從1∶2、1∶4、1∶8至1∶512，以PBS作為陰性對照。將50 μL的0.8%小鼠紅細胞懸液添加到每個孔中，并將反應(yīng)板放置2 h，觀察重組蛋白的血凝活性。

1.3 單克隆抗體的制備與鑒定

使用純化的SUMO-45L1蛋白(40 μg)與弗氏佐劑混合(體積比1∶1)免疫Balb/c小鼠，細胞融合前三天，使用純化的SUMO-45L1蛋白(40 μg)對小鼠尾靜脈注射進行一次超強免疫。使用聚乙二醇以8∶1的比例將脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)篩選陽性雜交瘤細胞株，通過有限稀釋法亞克隆。三輪亞克隆后獲得了穩(wěn)定分泌抗L1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，制備單抗腹水，并通過辛酸硫酸銨法純化。

1.3.1單克隆細胞株的ELISA篩選方法 將SUMO-45 L1蛋白用CBS(pH 9.6)稀釋到4 μg/mL，以50 μL/孔的量包被96孔酶標(biāo)板；用5%豬血清37 ℃封閉2 h；將50 μL待測樣品添加到每個孔中，37 ℃孵育1 h，洗滌3次；1∶5 000稀釋的HRP-goat anti mouse IgG作為二抗，37 ℃孵育1 h，洗滌6次，3、3′、5、5′-四甲基聯(lián)苯胺底物顯色10 min，加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取OD450值。篩選過程中將重組表達的含pESUMO空載的超聲上清(含SUMO-tag)作為包被原同步進行ELISA檢測，并作為平行對照，排除非特異反應(yīng)。

1.3.2免疫熒光實驗(IFA) 將293T細胞培養(yǎng)在96孔板中，當(dāng)細胞密度達到70%時，依照jetPRIME?轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。選用HPV假病毒制備的質(zhì)粒p45shell和pcDNA3.1-GFP轉(zhuǎn)染293T細胞，48 h后，用預(yù)冷的甲醇將細胞固定20 min，晾干后用PBS洗滌3次。將純化后的單抗3C11用PBS以1∶100稀釋后加入到細胞孔中，使用未免疫的小鼠血清作為陰性對照，在37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次，將FITC-羊抗鼠抗體用PBS以1∶100的比例加入上述孔中，37 ℃孵育1 h。PBS洗滌5次，通過熒光倒置顯微鏡觀察細胞。

1.3.3ELISA鑒定單抗與HPV-18、31、53、58 L1蛋白的反應(yīng)性 HPV-18、31、53、58 L1蛋白由我們實驗室制備。用碳酸鹽緩沖液(pH為9.6)將純化的HPV-18、31、53、58 L1蛋白稀釋至4 μg/mL，加入酶標(biāo)孔中，37 ℃孵育3 h，PBST洗滌后加入5%的豬血清于4 ℃封閉過夜。將單抗上清用PBS進行稀釋，以50 μL/孔加入到酶標(biāo)板中，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌5次，將HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG以1∶5 000進行稀釋，每孔50 μL，37℃孵育1 h。PBST洗滌后加入3、3′、5、5′-四甲基聯(lián)苯胺過氧化物酶底物，顯色10 min后，加入2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測各待檢孔的OD450值。

1.4 從隨機噬菌體展示12肽庫進行生物淘選

使用噬菌體隨機十二肽庫來淘選與抗L1蛋白單克隆抗體結(jié)合的噬菌體。在第一輪生物淘選中，將單抗3C11用NaHCO3緩沖液稀釋至終濃度為100 μg/mL，4 ℃包被過夜。次日，TBST(TBST:含0.1% Tween-20的TBS；TBS:50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.5)洗滌3次后，將封閉緩沖液(0.1 mol/L NaHCO3、5 mg/mL BSA，0.02% NaN3，pH8.6)加入孔中，37 ℃孵育2 h，洗滌6次后，用TBST將噬菌體稀釋為2×1011pfu/mL，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h。TBST洗滌10次，加入洗脫緩沖液(Glycin-HCl，0.2 mol/L，pH2.2)，置于室溫2 h，然后加入15 μL中和緩沖液(Tris-HCl，pH 9.1)。取10 μL洗脫液進行滴度的測定，剩余的洗脫液用于擴增。在第二輪、第三輪生物淘選中，包被單抗的濃度分別為75 μg/mL、50 μg/mL。TBST中Tween-20的濃度分別為0.2%、0.3%。第三輪不需進行噬菌體的擴增，直接進行滴度的測定。

1.5 陽性噬菌體克隆的鑒定

從第三輪測定洗脫物滴度的平板上隨機挑取20個噬菌體克隆，分別在大腸桿菌ER2738中擴增，然后通過間接ELISA進行鑒定。將單抗3C11用NaHCO3緩沖液稀釋至濃度為10 μg/mL、4 ℃孵育過夜。次日，棄去包被液，PBST洗滌3次，加入5%脫脂奶，37 ℃封閉2 h。棄去封閉液，將挑取的噬菌體克隆以1∶400比例稀釋加入孔中，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌5次后，加入用脫脂奶以1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的抗M13抗體，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌后，加入3、3′、5、5′-四甲基聯(lián)苯胺過氧化物酶底物，避光顯色5 min后，加入2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測其OD450值。

1.6 DNA測序及肽的合成

將陽性噬菌體克隆送至金維智生物公司測序，使用DNASTAR軟件，將測序結(jié)果與HPV45 L1蛋白序列通過NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov，No.AGU90648.1訪問)進行比對。將與L1蛋白原始序列比對上的序列送至吉爾生物公司進行多肽的合成。

1.7 多肽與單抗的反應(yīng)性鑒定

1.7.1Dot-ELISA 首先，通過戊二醛法將BSA和多肽連接。然后，將NC膜裁剪成長條狀，吸取1 μL BSA-多肽溶液滴到NC膜上，用純化的L1蛋白作為陽性對照，BSA溶液作為陰性對照，SUMO空載超聲上清液為無關(guān)對照。將膜浸于5%脫脂奶中，在37 ℃封閉2 h，PBST洗滌3次，將膜浸于單抗3C11中，37 ℃孵育1 h，PBST洗膜5次。將膜與1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG在37 ℃孵育1 h，洗滌后使用AEC試劑盒顯色，并用蒸餾水終止反應(yīng)。

1.7.2間接競爭ELISA 將L1蛋白用CBS緩沖液稀釋至4 μg/mL，加入酶標(biāo)孔中，37 ℃孵育3 h，棄去包被液，加入5%豬血清4 ℃封閉過夜。將合成肽用PBS倍比稀釋(初始稀釋度為1∶40)后與3C11混合，并加入到L1蛋白包被的孔中于37 ℃孵育1 h，其余步驟與上述ELISA方法。

1.8 生物信息學(xué)分析

從NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)獲得HPV45 L1蛋白的氨基酸序列(Genebank，No.AGU90648.1)，然后用Robetta軟件對HPV45 L1蛋白的3D結(jié)構(gòu)模型進行建模，使用PYMOL軟件顯示篩序表位的空間分布。

2 結(jié)果

2.1 重組L1蛋白的表達、純化與鑒定

誘導(dǎo)表達后通過SDS-PAGE分析重組SUMO45 L1蛋白的可溶性表達情況，如圖1所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SUMO45 L1蛋白主要以可溶性形式表達(圖1a)，通過Ni-NTA親和層析柱純化目的蛋白，SDS-PAGE結(jié)果表明純化后目的蛋白條帶單一，分子量約為75 KDa，純度約90%(圖1b)。Western-blot結(jié)果表明，純化后的SUMO-45L1蛋白可以與抗His單抗發(fā)生反應(yīng)(圖1c)。將純化的SUMO-45L1蛋白進行血凝實驗，結(jié)果表明當(dāng)重組L1蛋白稀釋至1∶16時，仍能夠使0.8%小鼠紅細胞懸液完全凝集，稀釋至1∶128時仍能使0.8%小鼠紅細胞懸液發(fā)生凝集，表明純化后的SUMO-45L1蛋白具有類似于天然病毒的血凝活性，可以使小鼠紅細胞發(fā)生凝集(圖1d)。

圖1 重組蛋白的表達、純化及血凝活性鑒定

2.2 單克隆抗體的制備及鑒定

用純化后的L1蛋白免疫Balb/c小鼠，細胞融合后經(jīng)過三輪亞克隆后，篩選出四株可以穩(wěn)定分泌L1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為2F5、3B7、3C11、3G11。如表1所示，陽性對照NC為無關(guān)雜交瘤細胞株培養(yǎng)上清，M1～M10為培養(yǎng)上清稀釋倍數(shù)，分別為1∶40，1∶80，…，1∶20 480。通過間接ELISA法測其效價，其中3C11效價最高，達1∶10 240以上。如表2所示通過ELISA鑒定單抗3C11與HPV-18、31、53、58 L1蛋白的交叉反應(yīng)性，結(jié)果表明3C11僅與HPV45 L1蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而與HPV-18、31、53、58 L1蛋白均不發(fā)生反應(yīng)。如圖2所示進一步通過IFA實驗鑒定單克隆抗體3C11，結(jié)果顯示3C11與在293T細胞中瞬時表達的HPV45 L1蛋白具有良好的反應(yīng)性，與陰性對照(NC，pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的293T細胞)不發(fā)生反應(yīng)。

圖2 抗HPV31 L1蛋白單克隆抗體的篩選與鑒定

表1 ELISA測定單克隆雜交瘤細胞株培養(yǎng)上清的效價

表2 ELISA測定單抗3C11的特異性

2.3 噬菌體十二肽庫的生物淘選和富集

如表3所示以純化的單克隆抗體3C11為包被原，使用噬菌體十二肽庫進行三輪生物淘選，經(jīng)過三輪淘選后，其富集率比第一輪提高了5×103倍，并且在每一輪淘選后噬菌體量均有所增加，表明與3C11結(jié)合的噬菌體得到了良好的富集。

表3 噬菌體的富集情況

2.4 間接ELISA篩選陽性噬菌體克隆

如圖3所示，x軸上1～20代表20個噬菌體克隆，原始肽庫作為NC(陰性對照)，PBS為空白對照(BC)。從第三輪測定洗脫物滴度的固體平板上隨機選取了20個噬菌體克隆，間接ELISA結(jié)果顯示有19個陽性克隆，其中12個噬菌體克隆可以與單抗3C11呈現(xiàn)強陽性反應(yīng)。

圖3 間接ELISA鑒定20個噬菌體克隆

2.5 陽性噬菌體克隆的測序與序列比對

將12個強陽性噬菌體克隆送至金維智生物公司進行測序。如表4所示，分析測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性克隆C5、C8、C9、C10、C14、C17具有相同的氨基酸序列，克隆C3、C6、C12、C15、C16、C19顯示為不同的氨基酸序列。將上述氨基酸序列與 HPV45 L1蛋白的原始序列用DNASTAR中的MegAlign軟件進行比對，發(fā)現(xiàn)這些克隆比對上的氨基酸與HPV45 L1蛋白的氨基酸序列“381VPNTYD386”相同，說明“381VPNTYD386”極可能為單抗3C11識別HPV45 L1蛋白的抗原表位。

表4 陽性噬菌體克隆所對應(yīng)的氨基酸序列

2.6 表位肽的合成和鑒定

為了進一步鑒定篩選到的多肽381VPNTYD386，進行肽的合成并與載體BSA偶連，通過Dot-ELISA和間接競爭ELISA進行鑒定。如圖4所示，Dot-ELISA結(jié)果表明，單抗3C11可以與BSA偶連的多肽及HPV 45 L1 蛋白全長發(fā)生反應(yīng)，而與陰性對照載體蛋白BSA和無關(guān)對照SUMO-tag均不反應(yīng)。間接競爭ELISA結(jié)果表明，該BSA偶連的多肽可以抑制3C11與L1蛋白的結(jié)合，且隨著多肽濃度的升高，OD450值越低，表明抑制率越高。該結(jié)果表明381VPNTYD386為單抗3C11識別HPV45 L1蛋白的抗原表位。

圖4 多肽與單抗反應(yīng)性的Dot-ELISA和間接競爭ELISA鑒定

2.7 生物信息學(xué)分析抗原表位的定位

Robetta軟件進行HPV45 L1蛋白的3D結(jié)構(gòu)建模，如圖5(a)所示(http:∥new.robetta.org/results.php?id=30879)，通過PYMOL軟件對表位“381VPNTYD386”的空間分布進行分析，如圖5(b)中紅色所示。

圖5 HPV45 L1蛋白的同源建模及表位定位分析

3 討論

抗原表位的篩選鑒定方法有許多，例如，噬菌體展示的隨機肽庫，免疫學(xué)實驗和軟件預(yù)測等是最常見的方法[12-13]。單克隆抗體是用于繪制病毒蛋白抗原表位的有用工具[14]，可以用單克隆抗體從噬菌體展示的隨機肽庫中淘選模擬抗原線性或不連續(xù)的表位[15]，與其他篩選表位的方法相比，噬菌體展示技術(shù)更簡單、更快、更方便[16]。

目前許多研究使用噬菌體展示技術(shù)來獲得模擬表位，但是很少有報道使用噬菌體展示技術(shù)篩選HPV45 L1蛋白的表位，不過有研究者使用其他的方法來預(yù)測抗原的表位。Ghorban等通過使用BCPREDS服務(wù)器預(yù)測了HPV45 L1蛋白的表位位于74～93 aa、127～146 aa、165～184 aa、198～217 aa、314～333 aa、336～355 aa、375～394 aa、425～444 aa、456～475 aa、503～522 aa，HPV45 L2蛋白的表位位于40～59 aa、55～74 aa、82～101 aa、348～367 aa[17-18]。Dey等[19]通過使用Analysis Resource、ABCpred服務(wù)器以及IEDB(Immune Epitope Database)預(yù)測HPV45 L1蛋白的表位位于75～89 aa、157～171 aa、194～208 aa、301～314 aa。Wang等[20]鑒定了一種抗L2單克隆抗體(14H6)，該抗體可以中和HPV-6、11、16、18、31、33、35、45、52、58、59亞型制備的假病毒顆粒，最終識別了L2蛋白的線性表位，位于21～30 aa。在本研究中，我們使用抗L1蛋白的單克隆抗體通過親和淘選噬菌體十二肽庫篩選了HPV45 L1蛋白的線性表位“381VPNTYD386”，該表位正好包含在Ghorban使用BCPREDS服務(wù)器預(yù)測的表位375～394 aa之中。

綜上所述，我們成功制備了抗HPV45 L1蛋白的單克隆抗體，并結(jié)合噬菌體展示的隨機肽庫篩選并鑒定了HPV45 L1蛋白的線性表位“381VPNTYD386”，該研究為進一步分析HPV45L1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系奠定基礎(chǔ)。