周嘉輝，馬文韜，姚博謙，羅 瑋，方麗君，劉 鵬，林展翼，

［1.廣東省心血管病研究所廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州 510080；2.廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州 510080；3.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣州 510006；4.廣東省東莞市松山湖中心醫(yī)院，廣東東莞 523326；5.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州 510515；6.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006］

組織工程無(wú)支架培養(yǎng)如細(xì)胞薄片技術(shù)（cell sheet）是組織工程培養(yǎng)常用的方法之一，它通過(guò)種子細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)自組裝（self-assembly）的方式形成特定結(jié)構(gòu)和功能的工程化組織，目前被廣泛應(yīng)用于器官補(bǔ)片、皮膚、角膜及心血管移植材料的構(gòu)建，部份產(chǎn)品已進(jìn)入臨床研究［1］。過(guò)去種子細(xì)胞以人體或大動(dòng)物分化成熟的細(xì)胞為主，人源性細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)與人體接近，是組織工程培養(yǎng)比較理想的細(xì)胞來(lái)源。但成熟的人體細(xì)胞來(lái)源有限，個(gè)體差異大，無(wú)法滿足開(kāi)展大規(guī)模組織工程培養(yǎng)的需求。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）可為組織工程培養(yǎng)提供充足的的人源性種子細(xì)胞［2-3］。人iPSC 的分化受諸多因素影響，不同批次誘導(dǎo)分化的種子細(xì)胞存在不均一性［4-5］，而種子細(xì)胞的性狀，如增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力，直接影響組織工程培養(yǎng)物的質(zhì)量［6］。因此，建立一種快速有效的實(shí)驗(yàn)方法，在組織工程培養(yǎng)前對(duì)iPSC 來(lái)源的種子細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，對(duì)獲得優(yōu)質(zhì)的組織工程產(chǎn)品有重要的指導(dǎo)價(jià)值。本研究利用人iPSC 分化的血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）在體外培養(yǎng)圓環(huán)形工程化組織，通過(guò)對(duì)組織的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外基質(zhì)的觀察分析，建立一種評(píng)價(jià)人iPSC 來(lái)源的種子細(xì)胞應(yīng)用于組織工程培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料和方法

1.1 誘導(dǎo)人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞分化血管平滑肌細(xì)胞的方法

誘導(dǎo)人iPSC分化VSMC的方法參照本課題組先前發(fā)表的文獻(xiàn)［7］。人iPSC（購(gòu)自Cellapy）用MTeSR（STEMCELL）培養(yǎng)基在Matrigel 包被的6 孔板上培養(yǎng)，每天換液至克隆團(tuán)生長(zhǎng)融合到80%左右，用1 U/mL 的中性蛋白酶在37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱中消化10 min，吸去中性蛋白酶后重新加入MTeSR 培養(yǎng)基，用吸管吹打iPSC 克隆團(tuán)使它變成均勻的小團(tuán)塊，轉(zhuǎn)移至低吸附6 孔板（Corning）懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)擬胚體，第2 天開(kāi)始以MTeSR 和EB 培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，并逐漸增加EB 培養(yǎng)基的比例。EB 培養(yǎng)基由高糖DMEM（Corning）、10%胎牛血清（Corning）、1%非必需氨基酸、2 mmol/L谷氨酰胺、0.012 mmol/L巰基乙醇組成。第5 天收集擬胚體放入明膠包被的6 孔板，加入EB 培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)5 d，然后用0.25%胰蛋白酶消化，再把細(xì)胞放入Matrigel 包被的T75 培養(yǎng)皿，用含1 ng/mL 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β1）（PEPROT?ECH）的SmGM-2 培養(yǎng)基（Lonza）貼壁培養(yǎng)7 d，隔天換液，培養(yǎng)結(jié)束后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行a-SMA，Cal?ponin，MYH-11 及SM-22 平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物免疫熒光染色。

1.2 瓊脂基質(zhì)模型的制作和圓環(huán)形組織培養(yǎng)

按圖1A 所示用樹(shù)脂以3D 打印方法制作圓環(huán)形瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)的模具，環(huán)氧乙烷消毒備用。按2%濃度稱取瓊脂粉（索萊寶）加入DMEM 培養(yǎng)基，經(jīng)高溫高壓蒸氣溶解并滅菌，趁熱在超凈工作臺(tái)內(nèi)倒入經(jīng)消毒的模具，自然冷卻得到瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)（圖1B）。取出瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)放入12 孔培養(yǎng)板內(nèi)，向瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)加入2×106人iPSC 誘導(dǎo)的VSMC細(xì)胞懸液，在瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)與培養(yǎng)板的間隙加入少量DMEM 培養(yǎng)基保持培養(yǎng)板內(nèi)的濕度，放入37 °C 二氧化碳培養(yǎng)箱靜置24 h，然后吸掉培養(yǎng)板內(nèi)的DMEM 培養(yǎng)基，輕柔地加入成環(huán)培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基淹沒(méi)瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)并浸潤(rùn)VSMC。成環(huán)培養(yǎng)由含20%胎牛血清、10 ng/mL PDGF（PEPROTECH）、1 ng/mL TGF-β、50 μg/mL 脯氨酸、50 μg/mL 甘氨酸、20 μg/mL 丙氨酸、3 ng/mL 硫酸銅和100 μg/mL維生素C 的高糖DMEM 培養(yǎng)基組成。此后每2 d換液1 次，7 d 后收獲圓環(huán)形組織。

圖1 iPSC-VSMC 培養(yǎng)的圓環(huán)形組織（A：瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)模具圖樣；B：瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)實(shí)物；C：iPSC-VSMC 在瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)中生長(zhǎng)成圓環(huán)；D：圓環(huán)組織外觀；E：圓環(huán)組織抵受鑷子張力；F：圓環(huán)組織串于小管上）

1.3 圓環(huán)形組織的形態(tài)學(xué)檢測(cè)

對(duì)培養(yǎng)獲得的圓環(huán)形組織進(jìn)行大體觀察并拍照，OCT 液包埋冷凍后切片，分別行蘇木素伊紅（HE）染色，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白（PEPROTECH）染色及a-SMA、Calponin、MYH-11、SM-22a（Ab?cam）細(xì)胞免疫組化染色。

2 結(jié)果

以EB 法誘導(dǎo)人iPSC 分化的VSMC 形態(tài)與原代培養(yǎng)的細(xì)胞類似，為長(zhǎng)梭形，免疫熒光染色表達(dá)a-SMA，Calponin，MYH-11 及SM-22a 等VSMC 特異性標(biāo)志物（圖2）。把誘導(dǎo)分化的VSMC 置于瓊脂基質(zhì)中培養(yǎng)7 d 獲得圓環(huán)形工程化組織，該組織形態(tài)規(guī)整，具有一定的力學(xué)強(qiáng)度，能自我維持組織形態(tài)（圖1C～F）；內(nèi)部含有以膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)（圖3B～D），基質(zhì)間細(xì)胞排列緊密，持續(xù)表達(dá)成熟的VSMC 標(biāo)志物（圖3E～H）。

圖2 EB 法誘導(dǎo)人iPSC 分化VSMC 及免疫熒光染色熒光顯微鏡下圖像（×100；A：Matrigel 上培養(yǎng)的iPSC；B：懸浮培養(yǎng)的擬胚體；C：iPSC-VSMC 貼壁培養(yǎng)第1 天；D：iPSC-VSMC 貼壁培養(yǎng)第12 天展現(xiàn)平滑肌細(xì)胞形態(tài)；E：a-SMA 免疫熒光；F：Calponin 免疫熒光；G：MYH-11 免疫熒光；H：SM-22 免疫熒光）

圖3 圓環(huán)組織切片染色光學(xué)顯微鏡下圖像（標(biāo)尺：200 μm；A：蘇木素伊紅染色；B：Ⅰ型膠原蛋白染色；C：Ⅲ型膠原蛋白染色；D：Ⅳ型膠原蛋白染色；E：a-SMA免疫組化染色；F：Calponin 免疫組化染色；G：MYH-11免疫組化染色；H：SM-22免疫組化染色）

3 討論

組織工程培養(yǎng)的目的是為人體受損的組織器官提供替換和修復(fù)的材料。為減輕移植后的炎癥反應(yīng)，組織工程培養(yǎng)應(yīng)盡量采用人體細(xì)胞，減少合成材料的應(yīng)用［8］。組織工程無(wú)支架培養(yǎng)從這個(gè)理念出發(fā)，通過(guò)細(xì)胞薄片技術(shù)目前已開(kāi)發(fā)出一系列組織工程產(chǎn)品并應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。人源性種子細(xì)胞應(yīng)用于組織工程培養(yǎng)，分泌與體內(nèi)天然成份接近的細(xì)胞外基質(zhì)，具有其他種屬種子細(xì)胞無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，但隨著產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，分化成熟的人體細(xì)胞將無(wú)法滿足大規(guī)模培養(yǎng)的需求。

人iPSC 有向三胚層細(xì)胞分化的能力，是人源性種子細(xì)胞的一個(gè)重要來(lái)源，目前已有許多公開(kāi)發(fā)表的誘導(dǎo)分化方案［9-12］。人iPSC 的分化受諸多因素影響，不同批次誘導(dǎo)分化的種子細(xì)胞存在不均一性。種子細(xì)胞的質(zhì)量直接關(guān)系到組織工程產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，建立一種快速有效的實(shí)驗(yàn)方法，在組織工程培養(yǎng)前對(duì)iPSC 來(lái)源的種子細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，對(duì)獲得優(yōu)質(zhì)的組織工程產(chǎn)品有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

本研究通過(guò)前期的研究，已建立穩(wěn)定高效的誘導(dǎo)人iPSC 分化為VSMC 的方法。后者作為種子細(xì)胞加入到瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)7 d，即可獲得一塊結(jié)構(gòu)完整的圓環(huán)形工程化組織，組織切片顯示組織內(nèi)部含有以膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)，基質(zhì)間細(xì)胞排列緊密，提示人iPSC 分化的VSMC 具有良好的增殖和分泌能力，種子細(xì)胞所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)通過(guò)自組裝形式形成圓環(huán)形三維組織，初步驗(yàn)證了種子細(xì)胞符合組織工程培養(yǎng)要求。本研究建立的體外培養(yǎng)及組織評(píng)價(jià)的方法，是一種快速有效的評(píng)價(jià)人iPSC 來(lái)源的種子細(xì)胞應(yīng)用于組織工程培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)方法。

綜上所述，誘導(dǎo)人iPSC 分化VSMC 可獲取大量種子細(xì)胞，利用該細(xì)胞可成功培養(yǎng)出結(jié)構(gòu)完整的圓環(huán)形工程化組織。對(duì)組織的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外基質(zhì)的觀察分析可作為評(píng)價(jià)人iPSC 來(lái)源的種子細(xì)胞應(yīng)用于組織工程培養(yǎng)的方法。

本研究存在一些不足之處，如培養(yǎng)時(shí)間較短，未在機(jī)械應(yīng)力加載條件下摸索種子細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律等，在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)研究中將會(huì)進(jìn)一步完善。