張國文，黎 沙，朱 苗

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

肥胖是一種慢性疾病，與艾滋病、吸毒、酗酒并列為世界性四大醫(yī)學(xué)社會問題[1]。胰脂肪酶(Pancreatic Lipase，簡稱PL)是胰腺合成和分泌的重要脂解酶，它能將膳食甘油三酯水解成單甘油酯和脂肪酸，然后被重新吸收并最終合成為人體所需的脂肪[2]。過多的脂肪蓄積導(dǎo)致的肥胖容易引起糖尿病、脂肪肝、高血脂、高血壓、骨關(guān)節(jié)炎等多種疾病[3-4]。抑制胰脂肪酶活性是防治肥胖及其并發(fā)癥最有效的方法之一，然而，臨床藥物如奧利司他等對人體都會產(chǎn)生一定的副作用，因而限制了其臨床應(yīng)用。因此，開發(fā)高效、低毒的新型胰脂肪酶抑制劑已成為近年來的研究熱點(diǎn)之一。白楊素是一種主要存在于蜂膠、紫葳科和松科植物等食品和天然植物中的黃酮化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗高血壓、抗糖尿病、抗高血脂等藥理活性[5]，是新藥研發(fā)中的一種非常重要的資源。研究表明，白楊素不僅可以顯著改善大鼠血清蛋白水平，還能降低低密度脂蛋白膽固醇水平，而高膽固醇水平是動脈粥樣硬化和許多與肥胖、心臟病、中風(fēng)等脂質(zhì)相關(guān)疾病的致病因素[6]。白楊素已成為治療肥胖及其并發(fā)癥等疾病的研究熱點(diǎn)。

Mangal等[4]報道來源于木蝴蝶中白楊素對胰脂肪酶有一定的抑制活性，當(dāng)其濃度為250 μg mL-1時，胰脂肪酶的抑制率為52.08%±2.14%，但其抑制機(jī)制尚不清楚。本研究運(yùn)用多種光譜學(xué)方法并結(jié)合分子模擬技術(shù)，研究白楊素對胰脂肪酶的抑制作用及機(jī)制，以期為白楊素作為抗肥胖營養(yǎng)補(bǔ)充劑的深入研究提供理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津公司)；F-7000型熒光光度計(日本日立公司)；MOS 450型圓二色譜儀(法國Bio-Logic公司)；pHS-3C型pH酸度計(中國上海雷磁儀器有限公司)；Millipore Simplicity超純水機(jī)(法國Millipore公司)。

PL(Ⅱ型，來自豬胰腺，100-400單位Mg-1蛋白)購自Sigma-Aldrich公司；奧利司他(純度≥98%)購自(上海源葉生物科技有限公司)；白楊素(純度≥98%)和對硝基苯丁酸酯(pNPB)來自阿拉丁(上海)有限公司。用Tris-HCl緩沖液(pH8.0,0.05 mol)配制PL和pNPB儲備液，將白楊素溶于二甲基亞砜(DMSO)中作為儲備溶液。由于DMSO有較強(qiáng)的極性，所以體系中DMSO的含量控制在5%(v/v)以下。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶活性測定

通過抑制動力學(xué)方法測定白楊素對PL的抑制能力。首先，用Tris-HCl緩沖液配制5 mg mL-1PL溶液，充分溶解后將PL溶液放置在離心速度為10,000×g的離心機(jī)上離心5 min后，得到的上清液作為PL儲備液。在濃度為6.67×10-6mol L-1PL溶液中加入不同濃度的白楊素，混勻后置于37℃恒溫水浴中孵育30 min，冷卻至室溫后，快速加入一定量的底物pNPB(最終濃度1.71×10-3mol L-1)啟動反應(yīng)，采用分光光度計的動力學(xué)/時間掃描模式在200 s內(nèi)每間隔10 s測定1次反應(yīng)體系在405 nm處的吸光度。通過關(guān)系式(1)，計算在含有不同濃度白楊素下PL的相對活性，并計算白楊素的半抑制濃度(IC50，表示PL活性被抑制50%時白楊素在反應(yīng)體系中的濃度)[7]。未加抑制劑的PL活性定義為100%，奧利司他為陽性對照。

相對酶活性(%)=(R/R0)×100%

(1)

R0、R分別表示不存在抑制劑和添加不同濃度抑制劑時反應(yīng)體系的吸光度隨時間的變化率(均已扣除空白對照)。

1.2.2 抑制可逆性和抑制類型測定

采用上述相同的實(shí)驗(yàn)條件，在5組白楊素對PL活性抑制的測定體系中，固定pNPB濃度(最終濃度1.71×10-3mol L-1)，測定加入不同白楊素濃度時測定PL對pNPB的催化反應(yīng)速率(ΔOD)，繪出ΔOD與PL濃度的關(guān)系曲線，根據(jù)該關(guān)系曲線分析白楊素對PL抑制可逆性。

在上述相同的條件下，在4組實(shí)驗(yàn)中，改變白楊素的濃度，同時保持PL最終濃度在6.67×10-6mol L-1，測定反應(yīng)體系中不同濃度的pNPB對酶促反應(yīng)速率的影響，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程，繪出酶促反應(yīng)速率倒數(shù)與底物濃度倒數(shù)的關(guān)系曲線，評估白楊素對PL的抑制類型[8]。

1.2.3 熒光猝滅實(shí)驗(yàn)

分別準(zhǔn)確移取0.1 mL的PL溶液和2.4 mL的Tris-HCl緩沖液于1 cm熒光比色皿中，反應(yīng)體系中PL的濃度固定為2.67×10-6mol L-1，隨后依次加入等體積的白楊素，共10次，每次滴加后混勻并靜置5 min，測定反應(yīng)體系在不同溫度(298、304和310 K)下300～500 nm范圍的熒光光譜，并扣除緩沖溶液的背景熒光。設(shè)置激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為2.5 nm。

同時配制上述相同的反應(yīng)系列，在298 K下測定反應(yīng)體系在Δλ=15和60 nm(Δλ=λem-λex)時200～400 nm范圍的同步熒光光譜。為了消除“內(nèi)濾光效應(yīng)”，收集的熒光數(shù)據(jù)均通過以下方程進(jìn)行校正[9]：

Fc=Fme(A1+A2)/2

(2)

Fc、Fm分別為校正后和測定的反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度，A1、A2分別表示白楊素在激發(fā)和發(fā)射波長下的吸光度。

1.2.4 非輻射能量轉(zhuǎn)移

當(dāng)PL的發(fā)射光譜和白楊素的吸收光譜有足夠重疊時，它們的結(jié)合過程有可能發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移。在相同條件下，以人血清白蛋白(HSA)為標(biāo)準(zhǔn)溶液(HSA熒光量子產(chǎn)率φst為0.13[10])，測量HSA和PL的熒光強(qiáng)度Fst和Fx及其激發(fā)和發(fā)射波長下HSA和PL的吸光度Ast和Ax，根據(jù)方程(3)計算PL的熒光量子產(chǎn)率(φx)[11]：

(3)

白楊素與PL之間的能量轉(zhuǎn)移效率和結(jié)合距離可根據(jù)以下F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論方程求得[12]：

(4)

(5)

(6)

式中E代表PL與白楊素之間的能量轉(zhuǎn)移效率，R0表示E=50%時的臨界距離，κ2表示酶-抑制劑隨機(jī)分布的取向因子，其值為2/3，N代表介質(zhì)的折射率(1.336)，J為白楊素的吸收光譜與PL的熒光發(fā)射光譜之間的重疊光譜積分，ε(λ)和F(λ)分別表示白楊素在波長λ處的摩爾吸收系數(shù)和PL的熒光強(qiáng)度。

1.2.5 圓二色光譜測定

在反應(yīng)體系中保持PL的濃度為1.0×10-5mol L-1，將不同濃度的白楊素加入反應(yīng)體系中，充分混勻靜止后，在連續(xù)氮?dú)馔ㄈ胂拢瑴y定游離PL及白楊素與PL不同摩爾比時的圓二色光譜(190～250 nm)，扣除緩沖介質(zhì)信號，所得數(shù)據(jù)運(yùn)用在線SELCON3程序(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml)處理獲得PL二級結(jié)構(gòu)的含量[12]。

1.2.6 分子對接

應(yīng)用Discovery Studio 4.5程序的CDOCKER算法進(jìn)行白楊素、奧利司他、底物pNPB與PL的分子對接。白楊素、奧利司他、底物pNPB的3D結(jié)構(gòu)文件選自PubChem網(wǎng)站，PL的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：1ETH)從RCSB：PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫獲得[13]。對接前先除去PL晶體結(jié)構(gòu)中的所有水分子，同時加入氫原子和加極性處理；通過軟件中的CDOCKER程序執(zhí)行受體PL和配體白楊素的對接，設(shè)定運(yùn)行次數(shù)和對接公差分別設(shè)置為100和0.25。根據(jù)獲得的對接結(jié)果，選擇最低CDOCKER結(jié)合能的對接構(gòu)象分析白楊素與PL的相互作用。

2 結(jié)果與討論

2.2.1 白楊素對PL抑制作用

隨著加入的白楊素濃度增大，PL的相對活性逐漸減小(圖1A)，當(dāng)白楊素的濃度達(dá)到1.01×10-3mol L-1時，PL的殘留活性不再下降，隨后基本達(dá)到穩(wěn)定，表明白楊素能夠抑制PL活性且存在濃度依賴關(guān)系。白楊素的IC50值為(8.21±0.02)×10-4mol L-1，而陽性對照奧利司他的IC50值則為(6.05±0.02)×10-5mol L-1，表明白楊素對PL有一定的抑制能力，但要弱于奧利司他。

(A)c(PL)=6.67×10-6 mol L-1,c(pNPB)=1.71×10-3 mol L-1;(B)c(pNPB)=1.71×10-3 mol L-1,c(chrysin)=0,1.80,3.60,5.40 and 7.20×10-4mol L-1 for curves a→e,respectively.

圖1B為不同濃度白楊素存在下，酶促反應(yīng)速率v與PL濃度的關(guān)系圖。圖中所有直線均通過原點(diǎn)，在相同濃度抑制劑存在下，PL的濃度與酶促反應(yīng)速率v呈正相關(guān)，而反應(yīng)體系中白楊素的濃度越大，直線斜率越低，表明白楊素對PL的抑制過程是可逆的，其主要通過形成分子間的非共價鍵而產(chǎn)生相互作用。

2.2.2 白楊素對PL的抑制類型

如圖2所示，不同濃度下白楊素的擬合直線都在Y軸相交，同時直線斜率隨著白楊素濃度增加而增大，而vmax保持不變，表明白楊素對PL的抑制為競爭型抑制[14]。對于競爭型抑制劑，可用以下動力學(xué)方程進(jìn)行描述[9]：

(7)

(8)

觀察到的每條直線的斜率與白楊素的濃度具有良好的線性關(guān)系(圖2左上角插圖)，表明白楊素與PL只有一個結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)方程(7)-(8)，計算出白楊素的抑制常數(shù)Ki值為(3.32±0.51)×10-4mol L-1，表明白楊素對PL具有中等強(qiáng)度的結(jié)合親和力。

c(PL)=6.67×10-6 mol L-1,c(chrysin)=0,2.70,5.40 and 8.10×10-4mol L-1 for curves a→d,respectively.The upper left was a plot of slope vs.[chrysin].

2.2.3 白楊素對PL的熒光猝滅分析

圖3A顯示在激發(fā)波長為280 nm時，PL在345 nm處有最大熒光發(fā)射峰，而白楊素在此激發(fā)波長下的熒光強(qiáng)度很弱(曲線L)，幾乎可以忽略不計。隨著滴加白楊素濃度的增大，PL的熒光強(qiáng)度逐漸減小，表明白楊素與PL發(fā)生相互作用而猝滅PL內(nèi)源熒光。

c(PL)=2.67×10-6 mol L-1,c(chrysin)=0,1.97,3.93,5.90,7.87,9.83,11.80,13.77,15.73,17.70 and 19.67×10-6 mol L-1for curves a→k,respectively.Curve L was the fluorescence spectrum of chrysin alone at the concentration of 19.67×10-6 mol L-1.

熒光猝滅根據(jù)猝滅機(jī)制不同分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅，靜態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光物質(zhì)相互作用形成不發(fā)熒光的基態(tài)復(fù)合物而導(dǎo)致熒光猝滅，其猝滅常數(shù)與溫度之間呈負(fù)相關(guān)，而動態(tài)猝滅則發(fā)生于猝滅劑與熒光物質(zhì)的分子碰撞，其猝滅常數(shù)與溫度呈正相關(guān)[15]。應(yīng)用Stern-Volmer方程評估熒光猝滅機(jī)制：

(9)

其中F0和F分別表示白楊素加入前后PL的熒光強(qiáng)度，Ksv代表猝滅常數(shù)，[Q]是白楊素的濃度，Kq表示雙分子猝滅速率常數(shù)，τ0表示未加入白楊素時熒光團(tuán)分子的平均壽命，約為10-8s[9]。

根據(jù)Stern-Volmer方程，作F0/F與[Q]的關(guān)系圖(圖3B)，不同溫度下(298、304和310 K)，F(xiàn)0/F對[Q]線性回歸呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(R>0.99)，表明白楊素對PL熒光猝滅為單一猝滅方式。通過方程(9)計算的猝滅常數(shù)Ksv值隨溫度升高呈降低的趨勢(表1)，其相應(yīng)的Kq(Ksv=Kqτ0)值也遠(yuǎn)大于生物分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)(2.0×1010L mol-1s-1)，表明白楊素對PL熒光猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅[16]。

表1 不同溫度下白楊素與PL相互作用的結(jié)合參數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)

2.2.4 結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)分析

靜態(tài)猝滅過程中猝滅劑與熒光分子相互作用的結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)通過以下方程計算[10]：

(10)

[Qt]和[Pt]分別代表白楊素和PL的濃度。計算出白楊素與PL的結(jié)合常數(shù)Ka值為104數(shù)量級L mol-1(表1)，表明其相互作用存在中等強(qiáng)度結(jié)合親和力，Ka值隨溫度的升高而降低，表明溫度升高兩者結(jié)合作用減弱。3個溫度下白楊素與PL的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n值都約為1，表明白楊素在PL上只有一個或一類結(jié)合位點(diǎn)，這與上述“2.2.2白楊素對PL的抑制類型”分析結(jié)果一致。

由熱力學(xué)參數(shù)可以確定白楊素和PL之間的結(jié)合力的類型，焓變(ΔH°)、熵變(ΔS°)和吉布斯自由能(ΔG°)可由van’t Hoff方程求得[17]。

(10)

ΔG°=ΔH°-TΔS°

(11)

式中R值表示氣體常數(shù)，其值為8.314 J mol-1K-1。由表1可見，白楊素與PL結(jié)合作用的ΔG°<0，表明兩者結(jié)合是自發(fā)進(jìn)行的；ΔH°<0，ΔS°>0，表明白楊素與PL相互作用過程是一個放熱過程，疏水作用力和氫鍵是其結(jié)合的主要驅(qū)動力[18]。

2.2.5 同步光譜分析

Δλ=15和60 nm的同步熒光光譜分別為蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的特征光譜。圖4A顯示隨著體系中白楊素濃度的增加，PL中酪氨酸和色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度逐漸降低，且2個熒光峰最大波長均有一定的紅移(酪氨酸從286→291 nm，色氨酸從290→292 nm)，表明白楊素與PL的結(jié)合增強(qiáng)了酪氨酸和色氨酸周圍微環(huán)境的極性[19]。同時，白楊素對同步熒光的猝滅百分率RSFQ(RSFQ=1-F/F0)結(jié)果表明，白楊素對色氨酸殘基的熒光猝滅百分率稍大于酪氨酸殘基(圖4B)，當(dāng)白楊素的濃度達(dá)到1.97×10-5mol L-1時，對色氨酸殘基熒光猝滅百分率65.12%，而對酪氨酸殘基熒光猝滅百分率62.35%，表明白楊素誘導(dǎo)PL的熒光猝滅，色氨酸殘基的貢獻(xiàn)稍大于酪氨酸殘基，類似的結(jié)果在表沒食子兒茶素與α-葡萄糖苷酶相互作用中也被發(fā)現(xiàn)[20]。

c(PL)=2.67×10-6 mol L-1,c(chrysin)=0,1.97,3.93,5.90,7.87,9.83,11.80,13.77,15.73,17.70 and 19.67×10-6 mol L-1for curves a→k,respectively.

2.2.6 非輻射能量轉(zhuǎn)移和結(jié)合距離測定

圖5顯示白楊素的紫外-可見吸收光譜與PL的熒光發(fā)射光譜有一定的重疊。根據(jù)方程(3)計算出PL的熒光量子產(chǎn)率φx為0.12。再由上述方程(4)-(6)計算得到白楊素與PL之間的重疊光譜積分J=5.44×10-14cm3L mol-1，臨界距離R0=3.26 nm，結(jié)合距離r=4.41 nm，r<8 nm 且0.5R0

c(PL)=c(chrysin)=2.67×10-6 mol L-1

2.2.7 圓二色譜分析

圓二色譜法是測定配體對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響的一種靈敏有效的方法。如圖6所示，游離PL的圓二色光譜在208和228 nm附近顯示兩個負(fù)的吸收峰，是PL結(jié)構(gòu)α-螺旋的多肽骨架發(fā)生n→π*躍遷產(chǎn)生的特征峰[21]。隨著加入白楊素濃度的增大，PL的2個峰信號強(qiáng)度逐漸降低，208 nm特征峰的位置也發(fā)生一定程度的紅移，PL二級結(jié)構(gòu)含量發(fā)生了變化(表2)。當(dāng)白楊素與PL的摩爾比由0:1增大到4:1時，PL的α-螺旋由32.10%增加到34.37%，β-轉(zhuǎn)角從23.97%提高到25.76%，而β-折疊則是從21.33%減少至19.84%，無規(guī)則卷曲從22.60%下降到20.03%，表明白楊素與PL相互作用導(dǎo)致PL的結(jié)構(gòu)緊縮，其表面疏水性有所增加，將影響底物和PL的結(jié)合[22]。

c(PL)=1.00×10-5 mol L-1,the molar ratios([chrysin]/[PL])were 0:1,1:1 and 4:1

表2 白楊素對PL二級結(jié)構(gòu)的影響

2.2.8 分子對接

分子對接技術(shù)可以直觀地顯示配體與受體的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合構(gòu)象并可用于其相互作用機(jī)理分析。圖7A,C,E為白楊素、奧利司他和pNPB與PL進(jìn)行100次分子對接結(jié)果中能量最低和結(jié)合次數(shù)最多的復(fù)合物結(jié)合構(gòu)像。白楊素、奧利司他、pNPB結(jié)合于PL疏水空腔活性位點(diǎn)所需要的最低能量分別為-35.28、-54.78和-32.33 kJ mol-1，表明它們與PL的結(jié)合能力大小依次為奧利司他>白楊素>pNPB[23]。

圖7 白楊素(A)、奧利司他(C)和pNPB(E)與PL分子模擬的3D結(jié)構(gòu)圖；白楊素(B)、奧利司他(D)及pNPB(F)相互作用的氨基酸殘基

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)白楊素以競爭性方式可逆地抑制PL活性，其IC50值為(8.21±0.02)×10-4mol L-1，白楊素通過氫鍵和疏水作用與胰脂肪酶結(jié)合形成復(fù)合物，白楊素在胰脂肪酶上有一個結(jié)合位點(diǎn)且該位點(diǎn)更接近色氨酸殘基，結(jié)合過程很可能發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移。白楊素主要與胰脂肪酶疏水空腔中Glu188,Pro194,Gln220、Thr221,Val322和Ser323殘基發(fā)生氫鍵和疏水相互作用且占據(jù)了酶活性中心位點(diǎn)，導(dǎo)致胰脂肪酶的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量增加，β-折疊和無規(guī)則卷曲含量減少，酶二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，結(jié)構(gòu)變得更加緊密，影響酶活性中心的形成，阻礙了底物進(jìn)入活性中心與酶作用，從而降低了胰脂肪酶的催化活性。該發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究白楊素作為天然抗肥胖的食品功能因子提供了理論參考。