徐 娜,王則托,謝廣成,李妙端,湯 婷,余珍珍,黃妍妍,陳文伙

(1.廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，福建 廈門361021；2.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院神內(nèi)腦血管病介入科)

腦卒中(stroke)具有 “五高”(高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率和高疾病經(jīng)濟負擔(dān))特點，嚴重威脅人類的生命健康。我國在2005年-2019年(15年間)，腦卒中的發(fā)病率患病率呈現(xiàn)持續(xù)增長且發(fā)病率、患病率和死亡率等均高于發(fā)達國家同期水平[1]。因此，我國的腦卒中的防治形勢仍然是任重道遠[2-3]，構(gòu)建中國卒中中心網(wǎng)絡(luò)體系建設(shè)也迫在眉睫[4]。腦卒中事件中約80%左右的為急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)[5]。引起腦栓塞發(fā)生的栓子主要有供血動脈來源的栓子(動脈源性栓子)和心臟來源的栓子(心源性栓子)[6]。雖然不同來源栓子的性狀已經(jīng)明確，但其分子水平上的基因組成仍是未知。為此本研究利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測動脈源性栓子和心源性栓子的轉(zhuǎn)錄組，旨在探討不同來源的栓子所攜帶的基因差異并為確定潛在的診斷性生物標志物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料選取2021年1月至2021年5月于廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院進行治療的AIS患者共計26例，AIS患者經(jīng)影像學(xué)(腦部CT和磁共振成像)檢測確診并符合中國急性缺血性腦卒中診治指南標準[7]。根據(jù)患者栓子來源的不同將患者分成動脈源性栓子組(12例)和心源性栓子組(14例)，患者平均年齡為(66.46±15.46)歲，最大年齡為92歲，最小年齡為30歲?；颊呋蚧颊咧毕导覍倬私庋芯績?nèi)容并同意在取栓手術(shù)完成后將取出栓子用于本文研究，同時本研究獲得廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院倫理委員會審查批準(倫理審查批件號：2021017)。

1.3 測序數(shù)據(jù)處理原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后，去除5’和3’接頭序列并過濾掉≤20 bp的過短片段，得到調(diào)整后數(shù)據(jù)(trimmed data)并進行數(shù)據(jù)比對，比對結(jié)果良好的數(shù)據(jù)進行基因和轉(zhuǎn)錄本表達定量分析、差異表達基因篩選、Gene Ontology (GO) (http://www.geneontology.org/) 進行生物學(xué)過程(biological process,BP)、細胞組成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (https://www.kegg.jp/)進行通路分析。使用CPAT預(yù)測新轉(zhuǎn)錄本的編碼能力，rMATS完成組間Alternative 5’ splice site(A5SS)、Alternative 3’ splice site(A3SS)、Skipped exon(SE)、Retained intron(RI)和Mutually exclusive exons(MXE)差異可變剪切事件的分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Ballgown定量動脈源性栓子組和心源性栓子組樣本表達水平及組間的基因和轉(zhuǎn)錄本的表達差異，設(shè)定變化倍數(shù)≥1.5倍，P≤0.05且組內(nèi)FPKM均值≥0.5界定為差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)和差異表達轉(zhuǎn)錄本(differentially expressed transcripts,DETs)。

2 結(jié)果

2.1 兩組栓子轉(zhuǎn)錄組檢測比較熱圖分析顯示動脈源性栓子組和心源性栓子組的基因表達譜具有明顯的差異(圖1A)。動脈源性栓子共鑒定出11080個基因和24759個轉(zhuǎn)錄本，心源性栓子共鑒定出10658個基因和24166個轉(zhuǎn)錄本；動脈源性栓子與心源性栓子相比，共有762個上調(diào)的DEGs，前5位上調(diào)DEGs分別為CYR61、ECSCR、EREG、CCL20、CTGF；共有508個下調(diào)DEGs，前5位下調(diào)DEGs分別為PLAU、FAM27B、TGM3、ST20-MTHFS、AMDHD2(圖1B)。共有1661個上調(diào)的DETs，前5位上調(diào)DETs分別為MAX-210、ACTN1-204、HIF1A-212、EEF1A1-204、CTNNB1-209；共有1191個下調(diào)的DETs，前5位下調(diào)DETs分別為ATG2A-202、TBC1D2-203、P4HB-203、SIPA1L1-203、STAT5A-209。上調(diào)和下調(diào)的DEGs分別定位在不同的染色體上(圖1C),見圖1。

圖1 動脈源性栓子與心源性栓子的轉(zhuǎn)錄組檢測

2.2 兩組栓子DEGs的GO分析BP分析顯示，下調(diào)DEGs主要富集在regulation of cellular process、response to stimulus、immune response(圖2A)，上調(diào)DEGs主要富集在regulation of cellular process、response to stimulus、regulation of primary metabolic process(圖2D)；CC分析顯示，下調(diào)DEGs主要富集在cytoplasm、cytosol、membrane(圖2B)，上調(diào)DEGs主要富集在cytoplasm、membrane-bounded organelle、intracellular membrane-bounded organelle(圖2E)；MF分析顯示，下調(diào)DEGs主要富集在protein binding、catalytic activity、metal ion binding(圖2C)，上調(diào)DEGs主要富集在protein binding、protein-containing complex binding、cell adhesion molecule binding(圖2F)，見圖2。

圖2 動脈源性栓子與心源性栓子的DEGs的GO分析

2.3 兩組栓子DEGs的KEGG分析兩組下調(diào)DEGs的KEGG通路富集共得到67條信號途徑(P<0.05)，前3條信號途徑分別為Measles、Epstein-Barr virus infection、Hepatitis_C(圖3A)；兩組上調(diào)DEGs的KEGG通路富集共得到35條信號途徑(P<0.05)，前3條信號途徑分別為Spliceosome、Protein export、Small cell lung cancer(圖3B),見圖3。

圖3 動脈源性栓子與心源性栓子的DEGs的KEGG分析

2.4 兩組栓子新轉(zhuǎn)錄本編碼能力預(yù)測通過對兩組栓子進行mRNA高通量測序，共計得到88570個新轉(zhuǎn)錄本，將預(yù)測的新轉(zhuǎn)錄本的編碼能力≥0.462為閾值，共計5464個新轉(zhuǎn)錄本具有編碼能力，其中前五位具有編碼能力的新轉(zhuǎn)錄本ID號分別為MSTRG.86325.23、MSTRG.86325.8、MSTRG.92497.14、MSTRG.92497.6、MSTRG.92497.3，見圖4。

圖4 動脈源性栓子與心源性栓子中新轉(zhuǎn)錄本編碼能力預(yù)測

2.5 兩組栓子差異可變剪切事件A5SS剪切事件共計2607個，其中差異可變剪切事件共計386個(上調(diào)213個、下調(diào)173個)；A3SS剪切事件共計4026個，其中差異可變剪切事件共計561個(上調(diào)297個、下調(diào)264個)；SE剪切事件共計32610個，其中差異可變剪切事件共計3919個(上調(diào)2201個、下調(diào)1718個)；RI剪切事件共計3650個，其中差異可變剪切事件共計748個(上調(diào)322個、下調(diào)426個)；MXE剪切事件共計4159個，其中差異可變剪切事件共計934個(上調(diào)414個、下調(diào)520個)，見圖5。

圖5 動脈源性栓子與心源性栓子中差異可變剪切事件

3 討論

血栓是引起腦卒中的主要栓子之一，在顱內(nèi)動脈粥樣硬化基礎(chǔ)上由于血管狹窄或粥樣硬化斑塊破裂形成的動脈源性栓子；栓子在心臟或其他部位形成并通過血流栓塞至顱內(nèi)進而形成心源性栓子。目前已基本確定纖維蛋白、血小板及紅細胞是血栓的主要成分[6]。不管是哪種栓子引起的腦卒中都給患者帶來嚴重的疾病負擔(dān)、經(jīng)濟負擔(dān)和治療負擔(dān)[8]。因此需要開展腦卒中的基礎(chǔ)研究與臨床研究的相結(jié)合，特別是應(yīng)用基于高通量檢測的蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能夠為腦卒中的潛在診斷性生物標志物確定和靶向生物治療提供的可能。我國已經(jīng)在缺血性腦卒中的基礎(chǔ)與臨床研究中取得重要研究成果[9]?；谌蚪M研究表明TSPAN2與大動脈粥樣硬化型卒中有關(guān)，PITX2和ZFHX3與心源性卒中有關(guān)，而ALDH2與所有缺血性卒中有關(guān)[10]。基于代謝組學(xué)研究腦卒中患者內(nèi)源性代謝產(chǎn)物已經(jīng)取得長足進展[11]，急性腦梗死患者血漿代謝組學(xué)研究表明谷氨酸、瓜氨酸/精氨酸在大動脈粥樣硬化型腦梗死患者血漿中水平偏高，蛋氨酸/苯丙氨酸、丙酰基肉堿/乙?；鈮A、己?；鈮A在穿支動脈疾病型患者血漿中水平偏高，上述代謝物可能作為腦梗死預(yù)測的潛在生物標志物[12]。AIS患者血清中提取總脂質(zhì)后進行脂質(zhì)組學(xué)，結(jié)果顯示共鑒定到1054個脂質(zhì)特異性差異，準確定性得到368個脂質(zhì)分子[13]。與正常健康人相比，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者血液中外泌體mRNA、lncRNA、circRNA的數(shù)據(jù)分析顯示共確定出312個差異mRNA、43個差異lncRNA和85個差異circRNA[14]。另外，基于血液來源的潛在生物標志物在缺血性腦卒中研究中也取得相應(yīng)進展，S100鈣結(jié)合蛋白B、膠質(zhì)纖維酸性蛋白和泛素C末端水解酶-L1可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷相關(guān)生物標志物；基質(zhì)金屬蛋白酶、L-精氨酸途徑代謝產(chǎn)物等可作為血管損傷/再生及凝血/血栓形成相關(guān)生物標志物[15]。

上述基于腦卒中患者體液(血液)確定的循環(huán)型生物標志物能夠為腦卒中患者診斷提供科學(xué)依據(jù)。但是腦卒中患者血栓自身成分的確定能夠為明確血栓形成和進一步確定出更為精確的潛在生物標志物提供更為準確的數(shù)據(jù)。AIS患者取栓手術(shù)中取出的血栓進行蛋白質(zhì)組學(xué)檢測，共計鑒定出1600種蛋白質(zhì)組分，其中339個蛋白是共性表達蛋白[16]。收集心源性腦卒中和大動脈粥樣硬化型腦卒中患者的血栓標本進行反向蛋白芯片檢測，共鑒定到31個蛋白參與到血小板/內(nèi)皮細胞功能、炎癥、氧化應(yīng)激和代謝組[17]，該研究得到的結(jié)果能夠為血栓微環(huán)境的細胞互作提供依據(jù)，但是該研究所使用的蛋白芯片只能檢測到數(shù)量局限的蛋白。本研究中同樣收集心源性腦卒中和大動脈粥樣硬化型腦卒中患者的血栓標本，進行基于高通量測序的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，動脈源性栓子和心源性栓子分別鑒定出11080個和10658個基因，兩種不同來源的栓子進行差異基因的確定，共計確定出762個上調(diào)的DEGs和508個下調(diào)DEGs，GO分析和KEGG信號途徑分析顯示，上調(diào)和下調(diào)DEGs參與到不同的生物學(xué)過程、細胞組分和分子功能，涉及到不同的信號途徑。另外高通量轉(zhuǎn)錄組測序同時鑒定出88570個新轉(zhuǎn)錄本，總計5464個新轉(zhuǎn)錄本具有編碼能力，此外還鑒定出數(shù)量不一的5種類型的A5SS、A3SS、SE、RI、MXE差異可變剪切事件。

綜上所述，本研究利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，鑒定出動脈源性栓子和心源性栓子的基因組成、差異表達的基因和轉(zhuǎn)錄本，構(gòu)建了差異基因的GO和KEGG通路網(wǎng)絡(luò)，鑒定了新轉(zhuǎn)錄本編碼能力、差異可變剪切事件類型和數(shù)量，這一結(jié)果為后期研究動脈源性栓子和心源性栓子潛在的生物標志物和血栓生成提供了科學(xué)依據(jù)。