孫六娜

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510405)

不規(guī)則抗體是引起交叉配血不合的主要原因，有時(shí)還可干擾血型鑒定[1]，其篩查作為輸血前檢測至關(guān)重要?？购Y細(xì)胞是表面存在多種血型抗原、用于檢測血漿中是否存在不規(guī)則抗體的離體紅細(xì)胞，其抗原性的穩(wěn)定是靈敏地篩查出不規(guī)則抗體的關(guān)鍵。若抗原性發(fā)生改變可能導(dǎo)致不規(guī)則抗體漏檢，影響紅細(xì)胞輸注的效果，甚至引起嚴(yán)重的輸血不良反應(yīng)。

為保障臨床輸血安全和血液的有效輸注，對保存期內(nèi)抗篩細(xì)胞血型抗原的抗原性進(jìn)行監(jiān)測可能對減少不規(guī)則抗體漏檢有一定作用。本研究采用較常見的有臨床意義的不規(guī)則抗體檢測抗篩細(xì)胞上對應(yīng)的抗原，并對比用單克隆抗體和人源抗體進(jìn)行質(zhì)量控制的優(yōu)劣勢。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 廠家1三系抗篩細(xì)胞(批號：45330751)、ID-Diluent2稀釋液(批號：0576100101)、微柱凝膠卡(批號：50531.62.05)、ID-Centrifuge 12 SⅡ離心機(jī)、ID-Incubator 37 SI0恒溫箱購自美國Bio-Rad公司；廠家2三系抗篩細(xì)胞(批號：20207040)、十系不規(guī)則抗體鑒定細(xì)胞(批號：20210119)、單克隆抗體IgG-D(批號：20190826)、單克隆抗體IgM-M(批號：20201016)、單克隆抗體IgM-E(批號：20203202)、單克隆抗體IgM-P1(批號：20200106)購自上海血液生物醫(yī)藥公司。

1.2方法

1.2.1人源不規(guī)則抗體收集 對本院輸血科不規(guī)則抗體篩查陽性的標(biāo)本采用十系不規(guī)則抗體鑒定細(xì)胞(E、M為雜合子試劑紅細(xì)胞，F(xiàn)ya為純合子試劑紅細(xì)胞)鑒定不規(guī)則抗體，收集抗M、抗E、抗P1、抗Fya陽性標(biāo)本各1例，保存于-30 ℃低溫冰箱。

1.2.2抗體最適濃度的標(biāo)定 將抗M、抗E、抗P1、抗Fya陽性的血漿各50 μL用生理鹽水倍比稀釋至1∶512后，各稀釋濃度分別取50 μL，與2個(gè)廠家的含有相應(yīng)抗原的1%濃度抗篩細(xì)胞(2個(gè)廠家抗篩細(xì)胞均離保質(zhì)期30 d)50 μL反應(yīng)，37 ℃溫育15 min后，1 000×g離心15 min，反應(yīng)凝集強(qiáng)度在6～9分判為合格(判斷標(biāo)準(zhǔn)見圖1)，-30 ℃保存已標(biāo)定好的人源抗體；用單克隆抗體試劑重復(fù)上述操作，-30 ℃保存已標(biāo)定的單克隆抗體試劑。已標(biāo)定的抗體用于后續(xù)監(jiān)測抗篩細(xì)胞血型抗原抗原性。

圖1 凝集強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3抗體的穩(wěn)定性監(jiān)測 參比紅細(xì)胞來源于本院輸血科員工和實(shí)習(xí)生志愿者，O型且紅細(xì)胞表達(dá)D抗原、E抗原、M抗原、P1抗原、Fya抗原。入選志愿者在每次抗篩細(xì)胞血型相關(guān)抗原的抗原性監(jiān)測時(shí)采血2 mL,EDTA-K2抗凝，1 000×g離心10 min后，用ID-Diluent2配制成1%濃度紅細(xì)胞做平行試驗(yàn)，用于明確人源及單克隆抗體的穩(wěn)定性。

1.2.4抗篩細(xì)胞血型相關(guān)抗原的抗原性監(jiān)測 保存期內(nèi)連續(xù)4周每周用已標(biāo)定的人源抗體及單克隆抗體與2組抗篩細(xì)胞相應(yīng)抗原反應(yīng)，每次連續(xù)檢測3次，記錄凝集強(qiáng)度；實(shí)驗(yàn)前放置抗體常溫解凍，加1%濃度抗篩細(xì)胞50 μL于凝膠卡孔中，再加入50 μL相應(yīng)抗體，37 ℃溫育15 min，1 000×g離心15 min,記錄凝集強(qiáng)度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1人源抗體收集及抗體的標(biāo)定情況 收集的人源抗體與十系不規(guī)則抗體篩查細(xì)胞反應(yīng)凝集強(qiáng)度為3+～4+，對照紅細(xì)胞血型抗體鑒定紅細(xì)胞反應(yīng)格局表，標(biāo)本1～4的鑒定結(jié)果分別為抗E、抗M、抗P1及抗Fya。

人源抗體與廠家1、2抗篩細(xì)胞標(biāo)定的最適稀釋倍數(shù)分別為1∶8、1∶4，單克隆抗體與廠家1、2抗篩細(xì)胞標(biāo)定的最適稀釋倍數(shù)均為1∶16。

2.2標(biāo)定抗體的穩(wěn)定性監(jiān)測結(jié)果 參比細(xì)胞與已標(biāo)定的單克隆抗體或人源抗體在第0天、第7天、第14天、第21天反應(yīng)凝集強(qiáng)度得分基本不變，說明已標(biāo)定的單克隆抗體和人源抗體在實(shí)驗(yàn)期間保持穩(wěn)定，抗原性監(jiān)測結(jié)果較可靠。

2.3抗篩細(xì)胞血型相關(guān)抗原抗原性監(jiān)測結(jié)果

2.3.1單克隆抗體及人源抗體監(jiān)測廠家1抗篩細(xì)胞抗原性結(jié)果 用單克隆抗體試劑及人源抗體監(jiān)測廠家1抗篩細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)凝集強(qiáng)度隨時(shí)間延長均有不同程度減弱，但用人源抗體時(shí)減弱更加明顯。用單克隆抗體第21天仍檢出相應(yīng)的單克隆抗體，而用人源抗抗體第21天未檢出人源抗體E、P1。見表1。

表1 單克隆抗體試劑及人源抗體監(jiān)測廠家1抗篩細(xì)胞抗原性凝集強(qiáng)度得分

2.3.2單克隆抗體及人源抗體監(jiān)測廠家2抗篩細(xì)胞抗原性結(jié)果 用單克隆抗體試劑及人源抗體監(jiān)測廠家2抗篩細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)凝集強(qiáng)度隨時(shí)間延長均有不同程度減弱，但用人源抗體時(shí)減弱更加明顯。用單克隆抗體試劑第21天仍能檢出單克隆抗D、抗E，未檢出單克隆抗M、抗P1；而用人源抗體時(shí)第21天時(shí)僅檢出抗E，其他人源抗體均未檢出。見表2。

表2 單克隆抗體試劑及人源抗體監(jiān)測廠家2抗篩細(xì)胞抗原性凝集強(qiáng)度得分

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)抗體篩查紅細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室存放過程中血型相關(guān)抗原抗原性隨時(shí)間延長而減弱。發(fā)生抗原性減弱的原因可能與紅細(xì)胞衰老、膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化相關(guān)；而減弱的速度快慢不同可能與抗原在紅細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)以及與膜結(jié)合的緊密性相關(guān)。

本研究中2個(gè)廠家同種抗原抗原性減弱的程度存在一定差異，廠家1抗篩細(xì)胞抗原的抗原性相對廠家2穩(wěn)定，這可能與紅細(xì)胞保存液的成分不同有關(guān)。有研究顯示，紅細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能會隨保存時(shí)間的延長發(fā)生改變[2]，這種變化可能是由紅細(xì)胞保存液中炎性因子增加、酶活性減低，血液流變學(xué)特征改變引起[3]。不同的保存液對紅細(xì)胞的壽命或活性影響也較大，也就對紅細(xì)胞表面糖蛋白的結(jié)構(gòu)或數(shù)量影響較大，保存液成分的差異可能是導(dǎo)致不同廠家抗篩細(xì)胞血型抗原抗原性在保存期內(nèi)減弱程度存在差異的原因之一。此外，保存液的理化性質(zhì)如pH、滲透壓、電導(dǎo)率等的差異也可能是導(dǎo)致不同廠家抗篩細(xì)胞血型抗原抗原性在保存期內(nèi)減弱程度存在差異的原因。

近些年“精準(zhǔn)輸血”概念的提出對輸血相容性檢測提出了更高的要求，除了ABO、RhD血型相容外，還需要進(jìn)行抗體篩選和鑒定，目的是減少血液輸注無效造成浪費(fèi)及輸血不良反應(yīng)的發(fā)生[4]。

不規(guī)則抗體漏檢的原因有實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的缺陷、不規(guī)則抗體效價(jià)低、抗篩細(xì)胞是雜合子細(xì)胞[5-7]等，此外，抗篩細(xì)胞的質(zhì)量直接影響不規(guī)則抗體篩查的檢測結(jié)果[8]。因此，作為篩查不規(guī)則抗體的抗篩細(xì)胞，其血型相關(guān)抗原的完整性和穩(wěn)定性非常重要，對保存期內(nèi)抗篩細(xì)胞血型抗原抗原性進(jìn)行監(jiān)測是防止不規(guī)則抗體漏檢必不可少的關(guān)鍵?！禝SO 15189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可準(zhǔn)則》等相關(guān)規(guī)定也指出輸血相容性檢測應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制[9]。

本研究在監(jiān)測抗原性時(shí)注意到一個(gè)現(xiàn)象，即在接近保質(zhì)期時(shí)單克隆抗體可能因特異性強(qiáng)、效價(jià)高未能及時(shí)反映出抗篩細(xì)胞部分血型抗原減弱致無法檢出相應(yīng)人源抗體的情況。因此建議使用人源抗體對抗篩細(xì)胞血型抗原進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測或者在接近保質(zhì)期時(shí)采用人源抗體輔助監(jiān)測，防止因不規(guī)則抗體漏檢導(dǎo)致血液輸注無效及發(fā)生輸血不良反應(yīng)。