石夢(mèng)瑤，張娜娜，王麟，彭沖，劉明軍，孫桂榮

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東青島 266003)

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤，5年生存率低于20%。腫瘤局部的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)所形成的炎癥微環(huán)境是腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)的重要組成部分，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。有資料表明由免疫細(xì)胞及組織細(xì)胞分泌、在細(xì)胞間發(fā)揮相互調(diào)控作用的細(xì)胞因子參與了前列腺癌、乳腺癌及結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[1-3]。本研究通過(guò)檢測(cè)不同組織學(xué)分型、TNM分期和治療前后肺癌患者外周血細(xì)胞因子和炎性細(xì)胞的表達(dá)變化，探討其在肺癌發(fā)病中的參與作用及臨床意義。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象 選取2020年3月至2022年6月青島大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)病理診斷確診、未經(jīng)任何抗腫瘤治療的肺癌患者458例，其中男250例，女208例，年齡(57.06±9.35)歲。按2015年版世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)肺腫瘤組織學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)[4]，分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)組414例(其中腺癌363例、鱗狀細(xì)胞癌51例)及小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)組44例。按國(guó)際肺癌研究學(xué)會(huì)(The International Association for the Study of Lung Cancer, IASLC)第八版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行分期，包括肺腺癌組Ⅰ期217例、Ⅱ期50例、Ⅲ期58例、Ⅳ期38例；肺鱗癌組Ⅰ期11例、Ⅱ期12例、Ⅲ期17例、Ⅳ期11例，SCLC組Ⅰ期5例、Ⅱ期7例、Ⅲ期12例、Ⅳ期20例。全部入組病例均排除患支氣管和肺部其他疾病(包括上下呼吸道感染、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、間質(zhì)性肺疾病、支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核等)、超敏反應(yīng)、其他器官急性感染、自身免疫病、免疫缺陷病、外傷、急性心腦血管損傷、血液系統(tǒng)疾病，肝、腎功能不全、糖尿病以及其他組織器官惡性腫瘤等疾病。選取同期本院體檢健康人員44例作為健康人對(duì)照組，其中男25例，女19例，年齡(56.89±10.5)歲，體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)、胸部影像學(xué)、B超等均未見(jiàn)異常，且與肺癌組患者比較，性別和年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

本研究另對(duì)同期診于本院的87例初診的肺癌患者(肺腺癌Ⅲ期3例、Ⅳ期29例，肺鱗癌Ⅲ期12例、Ⅳ期8例，SCLC Ⅲ期17例、Ⅳ期18例)進(jìn)行療效監(jiān)測(cè)，觀察這些患者經(jīng)一線化療4周期后血漿細(xì)胞因子和炎性細(xì)胞的變化。所有患者按實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST)V1.1[6]判定近期療效，并分為完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、病情穩(wěn)定(stable disease，SD)和病情進(jìn)展(progressive disease，PD)4種級(jí)別，并進(jìn)一步分為兩大組，即疾病控制組(CR+PR+SD)和疾病進(jìn)展組(PD)。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：QYFY WZLL 27257)，納入對(duì)象均知情同意。

1.2主要儀器與試劑 12項(xiàng)細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(青島瑞思凱爾公司)，Navios流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)，XN-9000全自動(dòng)血液分析儀及其配套試劑(日本Sysmex公司)。

1.3標(biāo)本采集 用EDTA-K2抗凝采血管采集健康查體人員和肺癌患者治療前、后(經(jīng)4周期化療后)的清晨空腹靜脈血標(biāo)本。1 000×g離心10 min，取分離出的血漿進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)。全血充分混勻后在全自動(dòng)血液分析儀上進(jìn)行炎性細(xì)胞檢測(cè)。

1.4實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1血漿細(xì)胞因子檢測(cè) 血漿白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-12P70、干擾素(interferon, IFN)-α、IFN-γ、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α共12種細(xì)胞因子檢測(cè)采用多重微球流式免疫熒光發(fā)光法，按照細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒和Navios流式細(xì)胞分析儀說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。

1.4.2炎性細(xì)胞檢測(cè) 中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(absolute neutrophil count, ANC)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(absolute lymphocyte count, ALC)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(absolute monocyte count, AMC)檢測(cè)采用熒光流式細(xì)胞技術(shù)，按照XN-9000全自動(dòng)血液分析儀及其配套試劑說(shuō)明書(shū)檢測(cè)，并經(jīng)計(jì)算獲得中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)與淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)比值(monocyte-to-lymphocyte ratio, MLR)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 26.0軟件進(jìn)行。檢測(cè)數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，用中位數(shù)(四分位數(shù))表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩組間比較采用Mann-WhitenyU檢驗(yàn)，治療前后比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1肺癌患者12種血漿細(xì)胞因子水平比較 經(jīng)非參數(shù)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，對(duì)照組、SCLC組和NSCLC組3組間5種血漿細(xì)胞因子IL-2、IL-5、IL-6、IL-8和TNF-α水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H值分別為6.025、10.292、29.821、7.589、11.361，P均<0.05)，其余7種細(xì)胞因子水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行兩兩組間比較，結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，SCLC組血漿IL-6、IL-8、TNF-α水平均明顯升高(U值分別為346、663、632，P均<0.05)，IL-2和IL-5水平無(wú)明顯變化，NSCLC組除血漿IL-6、IL-8、TNF-α水平明顯升高外，IL-5水平也明顯升高(U值依次分別為5 605.5、7 031、6 410.5和6 414.5，P均<0.05),而IL-2水平則明顯降低(U值為7 055，P<0.05)；與NSCLC組比較，血漿IL-6水平明顯升高(U值為6 491，P<0.01)，其余4種細(xì)胞因子水平無(wú)顯著變化；與肺腺癌組比較，肺鱗癌組血漿IL-2、IL-6水平明顯升高(U值分別為7 138、5 817.5，P均<0.01)，其余3種細(xì)胞因子水平無(wú)明顯變化。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組、SCLC組和NSCLC組各血漿細(xì)胞因子水平比較[pg/mL，M(P25，P75)]

2.2肺癌患者3種炎性細(xì)胞及其比值NLR、MLR水平比較 經(jīng)非參數(shù)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，對(duì)照組、SCLC組、NSCLC組3組間3種炎性細(xì)胞ANC、ALC、AMC和NLR、MLR水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H值分別為21.725、22.653、21.885、43.562、62.339，P均<0.001)。對(duì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行兩兩組間比較，結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，SCLC組和NSCLC組ANC、AMC、NLR、MLR水平均明顯升高(SCLC組U值分別為481、466、302和223，NSCLC組U值分別為5 427、5 568、4 330和3 621，P均<0.001)，ALC水平均明顯降低(SCLC組U值為474，NSCLC組U值為6 096.5，P均<0.001)；與NSCLC組比較，SCLC組NLR、MLR水平明顯升高(U值分別為6 587.5和5 554，P均<0.01)，ALC水平則明顯降低(U值為666 1，P<0.01),ANC和AMC水平無(wú)明顯變化；與肺腺癌組比較，肺鱗癌組ANC、AMC、NLR、MLR水平明顯升高(U值分別為5 309.5、5 044.5、5 738和4 849，P均<0.001)，ALC水平則無(wú)顯著變化。見(jiàn)表2。

表2 肺癌組與對(duì)照組各炎性細(xì)胞水平比較[M(P25，P75)]

2.3不同TNM分期肺癌患者血漿細(xì)胞因子和炎性細(xì)胞水平變化 分析肺癌患者差異表達(dá)的5種血漿細(xì)胞因子IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、TNF-α水平及3種炎性細(xì)胞ANC、ALC、AMC和NLR、MLR水平在不同TNM分期肺癌患者中的表達(dá)變化，結(jié)果見(jiàn)表3、表4。Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析結(jié)果表明，SCLC組Ⅲ/Ⅳ期患者僅血漿IL-6水平明顯高于Ⅰ/Ⅱ期(U值為97.5，P<0.05)，其余4種細(xì)胞因子水平差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NSCLC組Ⅲ/Ⅳ期患者血漿IL-5、IL-6、IL-8水平明顯高于Ⅰ/Ⅱ期(U值分別為14 954.5、11 048、15 243，P均<0.05)，其余3種細(xì)胞因子水平無(wú)顯著變化，結(jié)果見(jiàn)表3。同時(shí)，SCLC組Ⅲ/Ⅳ期NLR、MLR明顯高于Ⅰ/Ⅱ期(U值分別為90、65，P均<0.01)，ALC則明顯低于Ⅰ/Ⅱ期(U值為96，P<0.05)，ANC、AMC水平差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NSCLC組Ⅲ/Ⅳ期患者ANC、AMC、NLR、MLR表達(dá)均高于Ⅰ/Ⅱ期(U值分別為12 237.5、14 370.5、12 617.5和14 245，P均<0.01)，ALC水平無(wú)明顯變化。

表3 不同TNM分期肺癌患者5種血漿細(xì)胞因子水平變化[pg/mL，M(P25，P75)]

表4 不同TNM分期肺癌患者炎性細(xì)胞水平變化[M(P25，P75)]

2.4不同療效晚期肺癌組患者化療前、后血漿IL-6、IL-8、TNF-α細(xì)胞因子水平及ANC、ALC、AMC、NLR、MLR炎性細(xì)胞水平變化 87例初診的肺癌患者經(jīng)一線化療4周期后血漿IL-6、IL-8、TNF-α及ANC、ALC、AMC、NLR、MLR水平變化見(jiàn)表5和表6，按RECIST實(shí)體瘤分級(jí)V1.1標(biāo)準(zhǔn)判定的近期療效評(píng)估結(jié)果為： CR患者0例，PR患者28例，SD患者34例，PD患者25例。疾病控制組(CR+PR+SD)和疾病進(jìn)展組(PD)兩組在治療前血漿IL-6、IL-8、TNF-α水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。經(jīng)4周期治療后，疾病控制組血漿IL-6、IL-8、TNF-α水平較治療前明顯降低(P均<0.05)，而疾病進(jìn)展組明顯升高(P均<0.05)，并且經(jīng)4周期治療后疾病進(jìn)展組血漿IL-6、IL-8、TNF-α水平明顯高于疾病控制組(U值分別為441.5、415.5、372，P均<0.01)。同時(shí)，治療前兩組間ANC、ALC、AMC、NLR、MLR水平差異也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，經(jīng)4周期治療后疾病控制組ANC、ALC、NLR水平明顯低于治療前(P均<0.05)，AMC、MLR水平則無(wú)明顯變化；疾病進(jìn)展組治療后ANC、AMC、NLR、MLR水平均較治療前明顯升高，ALC水平則明顯降低(P均<0.05)，并且經(jīng)4周期治療后疾病進(jìn)展組ANC、AMC、NLR、MLR水平明顯高于疾病控制組(U值分別為244.5、385.5、372，P均<0.001)，而ALC水平則明顯降低(U值為552.5，P<0.05)。

表5 不同療效晚期肺癌組患者化療前后血漿IL-6、IL-8、TNF-α水平變化[M(P25，P75)]

表6 不同療效晚期肺癌組患者化療前后ANC、ALC、AMC、NLR、MLR水平變化[M(P25，P75)]

3 討論

TME主要由腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、T/B淋巴細(xì)胞)以及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子等所構(gòu)成，彼此間相互作用，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，從而影響機(jī)體的免疫狀態(tài)[7-8]。細(xì)胞因子在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、宿主防御等機(jī)制中扮演重要角色，其中IL-6作為多效性細(xì)胞因子廣泛表達(dá)于單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中，IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-17主要由淋巴細(xì)胞分泌，IL-1β、IL-8、IL-12主要來(lái)源于單核/巨噬細(xì)胞，IFN-α、IFN-γ作為IFN家族成員代表主要由淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌[9]。本研究結(jié)果顯示，SCLC組、NSCLC組和對(duì)照組3組間血漿IL-2、IL-5、IL-6、IL-8和TNF-α水平差異顯著，其余7種細(xì)胞因子水平3組間比較則無(wú)明顯差異，預(yù)示前5種細(xì)胞因子可能是肺癌相關(guān)細(xì)胞因子。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SCLC組僅血漿IL-6、IL-8、TNF-α 3種細(xì)胞因子水平發(fā)生變化，明顯高于對(duì)照組；NSCLC組血漿IL-5、IL-6、IL-8和TNF-α水平明顯高于對(duì)照組，IL-2水平明顯低于對(duì)照組，另見(jiàn)SCLC組血漿IL-6水平明顯高于NSCLC組，肺鱗癌組血漿IL-2和IL-6水平明顯高于肺腺癌組，這些結(jié)果均表明，血漿IL-2、IL-5和IL-6的表達(dá)因肺癌的組織病理學(xué)類型不同而異。IL-2作為T(mén)h1型細(xì)胞因子，在NSCLC患者表達(dá)受抑制可能與患者外周血Th1細(xì)胞數(shù)目減少有關(guān)。IL-5主要由Th2型細(xì)胞分泌，Th2型細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫抑制Th1型細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，使腫瘤細(xì)胞更易發(fā)生免疫逃逸[8]，Th1/Th2型細(xì)胞的失衡所致的Th1/Th2漂移可能與NSCLC發(fā)生發(fā)展的病理學(xué)機(jī)制有關(guān)。SCLC患者血漿IL-6水平和NSCLC患者血漿IL-5、IL-6、IL-8水平均隨肺癌分期的升高而升高，表明IL-5、IL-6、IL-8協(xié)同作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。肺癌晚期患者經(jīng)4個(gè)周期系統(tǒng)化療后，病情控制組血漿IL-6、IL-8和TNF-α水平較治療前明顯降低，而病情進(jìn)展組三者不僅沒(méi)有降低反而又進(jìn)一步明顯升高，綜上表明，多種細(xì)胞因子參與了肺癌的疾病發(fā)生和發(fā)展。有資料表明IL-6廣泛表達(dá)于包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中，通過(guò)與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞表面IL-6受體結(jié)合，激活下游JAK/STAT3信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤促進(jìn)因子、VEGF等的表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，也可直接作用于腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)其 STAT3 靶基因的表達(dá)，從而驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活[2-3,10]。IL-8可通過(guò)自分泌和旁分泌的形式作用于肺癌細(xì)胞，主要通過(guò)IL-8通路或EGFR的反式激活發(fā)揮促肺癌細(xì)胞有絲分裂作用，以及通過(guò)CXCL8和VEGF協(xié)同作用促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和腫瘤血管生成[11-13]。腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞刺激TME中的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量TNF-α，高表達(dá)的TNF-α激活TNF-α/TNFR2信號(hào)通路，上調(diào)的TNFR2通過(guò)激活NF-κB誘導(dǎo)多種激酶活化從而引起腫瘤生長(zhǎng)[2，14]，同時(shí)TNF-α表達(dá)增加進(jìn)一步促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-6，IL-6和TNF-α又可增加肺泡上皮細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成[13]。IL-2通過(guò)刺激T細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用[15]，腫瘤進(jìn)展時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)失衡出現(xiàn)免疫抑制，IL-2表達(dá)受到抑制[8]，本研究也發(fā)現(xiàn)NSCLC組肺癌患者血漿IL-2水平明顯低于對(duì)照組，也可能是IL-2表達(dá)受到抑制所致。IL-5參與B細(xì)胞的分化及嗜酸性粒細(xì)胞的活化[9]，但關(guān)于IL-5在腫瘤生物學(xué)中的作用機(jī)制尚不明確。Hayama等[16]發(fā)現(xiàn)NSCLC患者惡性胸腔積液中IL-5過(guò)表達(dá)，且與惡性細(xì)胞數(shù)量相關(guān)，因此推斷IL-5在肺癌的發(fā)展、侵襲等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞增多與NSCLC的進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)[17]，由此可見(jiàn)其機(jī)制可能與IL-5促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞聚集相關(guān)，通過(guò)調(diào)節(jié)有利于腫瘤生長(zhǎng)的TME促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。

本研究有關(guān)外周血炎性細(xì)胞的研究結(jié)果顯示，SCLC組、NSCLC組和對(duì)照組3組間外周血ANC、ALC、AMC、NLR和MLR水平差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明肺癌患者機(jī)體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)和免疫失衡。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SCLC組和NSCLC組外周血ANC、AMC、NLR、MLR水平均明顯高于對(duì)照組，ALC水平明顯低于對(duì)照組。與NSCLC組比較，SCLC組NLR、MLR水平明顯升高，ALC水平明顯降低；另見(jiàn)肺鱗癌組ANC、AMC、NLR、MLR水平明顯高于肺腺癌組，以上結(jié)果均說(shuō)明不同病理學(xué)分型肺癌患者的外周血炎性細(xì)胞的表達(dá)存在差異，提示TME中免疫細(xì)胞分布比例也可能存在差異。隨肺癌分期的升高，SCLC患者NLR、MLR水平升高，而ALC水平降低，NSCLC患者ANC、AMC、NLR、MLR水平均升高，表明炎性細(xì)胞在SCLC和NSCLC疾病進(jìn)展中的參與機(jī)制不盡相同。SCLC進(jìn)展主要與淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力減弱相關(guān)，而NSCLC進(jìn)展則與中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞發(fā)揮促腫瘤作用更密切，肺癌晚期患者經(jīng)4個(gè)周期系統(tǒng)化療后，病情控制組ANC、ALC、NLR水平較治療前明顯降低，而病情進(jìn)展組ANC、AMC、NLR、MLR水平明顯升高，ALC水平明顯降低，進(jìn)一步反映了肺癌的發(fā)生發(fā)展與炎癥反應(yīng)密不可分。有資料表明淋巴細(xì)胞作為腫瘤免疫應(yīng)答的核心，其中主要以T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和所釋放的細(xì)胞因子抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移[8，17]；在腫瘤發(fā)生早期中性粒細(xì)胞在CXCL8等的刺激下活化并滲透到TME中形成腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(TANs)，TANs通過(guò)抑制免疫反應(yīng)及產(chǎn)生炎癥因子、蛋白酶等衍生物來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和存活；外周血單核細(xì)胞是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)的主要來(lái)源，TAMs通過(guò)分泌促有絲分裂的相關(guān)因子促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及增強(qiáng)免疫抑制作用，同時(shí)通過(guò)釋放VEGF等促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞的侵襲[7，17-18]。

綜上所述，細(xì)胞因子IL-2、IL-5、IL-6、IL-8和TNF-α和炎性細(xì)胞ANC、ALC、AMC、NLR和MLR在不同組織學(xué)分型肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了既相同又相異的作用，檢測(cè)外周血細(xì)胞因子和炎性細(xì)胞可以為肺癌的病理學(xué)分型、TNM分期和療效評(píng)估提供有價(jià)值的參考依據(jù)。