強(qiáng)鑫華，王若南，鄭書發(fā)，陳曉，陳瑜

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，杭州 310003；2.湖州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江湖州313000)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種革蘭陰性嗜鹽桿菌，是常見(jiàn)的導(dǎo)致食物中毒的病原菌，在海水和海產(chǎn)品中分布極廣。該菌感染后可引起腹瀉、嘔吐、全身痙攣、循環(huán)衰竭，甚至死亡[1]。由該菌引起的食源性疾病在全球范圍內(nèi)均有報(bào)道[2]。本研究對(duì)湖州地區(qū)腸道門診來(lái)源的副溶血弧菌進(jìn)行毒力基因、遺傳標(biāo)志物基因及血清分型和抗菌藥物耐藥性試驗(yàn)，以了解本地區(qū)副溶血弧菌的流行特征，為臨床治療和疾病防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集2017年1月—2020年12月浙江省湖州市第一人民醫(yī)院及其轄區(qū)(縣)南潯區(qū)人民醫(yī)院、德清縣人民醫(yī)院、安吉縣人民醫(yī)院和長(zhǎng)興縣人民醫(yī)院腸道門診就診的腹瀉患者分離的副溶血弧菌，采用甘油肉湯凍存于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院微生物室-80 ℃冰箱，共計(jì)181株。

1.2儀器與試劑 Vitek 2 Compact微生物鑒定儀(法國(guó)生物梅里埃公司)，Biofuge Primo R離心機(jī)(德國(guó)DB公司)，HB-100熱裂解儀(中國(guó)博日公司)，DNA Engine PCR擴(kuò)增儀、Mini-Protean 3電泳儀水平(美國(guó)Bio-Rad公司)，凝膠成像系統(tǒng)GDEQ(日本SONY公司)，100 bp DNA marker、dNTP、10×buffer、Taq DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)，副溶血弧菌血清型O、K兩種血清試劑(日本株式會(huì)社)，藥敏紙片(英國(guó)Oxoid公司)。

1.3菌種鑒定 菌株分離培養(yǎng)依據(jù)《浙江省食源性致病菌監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》進(jìn)行，細(xì)菌菌種鑒定采用Vitek 2 Compact微生物鑒定儀鑒定到種。

1.4血清分型 采用副溶血弧菌血清型O、K兩種血清試劑對(duì)181株副溶血弧菌進(jìn)行血清分型。

1.5毒力基因檢測(cè) 采用熱裂解法提取細(xì)菌DNA。挑取火柴頭大小菌落溶于500 μL滅菌水中，振蕩10 s，100 ℃金屬浴10 min，13 000 r/min 4 ℃離心10 min，上清液即為DNA模板。單重PCR進(jìn)行tdh、trh、tlh、toxRS/new、orf8基因檢測(cè)，多重PCR進(jìn)行T3SS1、T3SS2α、T3SS2β基因檢測(cè)。所有引物由上海生工生物公司合成，引物設(shè)計(jì)依據(jù)參考文獻(xiàn)[3-4]，引物序列及大小見(jiàn)表1。反應(yīng)體系共25 μL，包括上、下游引物(濃度為10 μmol/L)各0.5 μL，DNA模板3 μL，Taq酶12.5 μL，10×buffer 2.5 μL，用滅菌水補(bǔ)足至25 μL。單重?cái)U(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。多重PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否有對(duì)應(yīng)長(zhǎng)度的擴(kuò)增條帶。

表1 副溶血弧菌PCR檢測(cè)目的基因引物序列[3-4]

1.6藥敏試驗(yàn) 采用K-B法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選取8類20種抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)控菌株，結(jié)果判讀依據(jù)美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI) M45(2015版)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用WHONET 5.6進(jìn)行藥敏結(jié)果統(tǒng)計(jì)，采用Excel進(jìn)行季節(jié)、年齡數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1不同季節(jié)及年齡檢出率 副溶血弧菌感染有明顯的季節(jié)分布，6月份12株，7月份(48株)開(kāi)始升高，8月份(54株)達(dá)到高峰，之后慢慢減少，秋季(9月—11月)、冬季(12月—次年2月)檢出很少，只有零星病例檢出，檢出呈明顯的集中分布。按照副溶血弧菌感染的患者年齡，分9個(gè)年齡段進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，以>20歲且≤30歲組、>30歲且≤40歲組以及>50歲且≤60歲組檢出較多，分別為43例、40例、38例，≤20歲和>60歲人群檢出很少。

2.2血清分型結(jié)果 181株副溶血弧菌中，O型血清有O2、O3、O4、O5、O7、O8、O10、OUT，主要以03為主，占69.6%(126/181)；其次為O4，占19.9%(36/181)。K型血清有K3、K6、K8、K63、KUT，主要以K6為主，占55.8%(101/181)。流行菌株以O(shè)3∶K6型占比最高，為53.6%(97/181);其次為O3∶KUT型，占15.5%(28/181)。

2.3毒力基因檢測(cè)結(jié)果 181株副溶血弧菌均攜帶tlh，164株攜帶tdh，1株攜帶trh，179株攜帶T3SS1，167株攜帶T3SS2α基因，未檢測(cè)到攜帶T3SS2β基因，未檢出同時(shí)攜帶tdh和trh基因的菌株。部分菌株毒力基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳條帶見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

注：M，100 bp DNA marker；1～2、5～7，trh基因陰性、tdh基因陽(yáng)性菌株；3，tdh、trh基因均陰性菌株；4，tdh陰性、trh基因陽(yáng)性菌株。圖1 部分菌株tdh、trh基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析

注：M，100 bp DNA marker；1～3、5～7，陽(yáng)性基因條帶，分別為VP1670、VP1686、VP1689、VP1694；4，T3SS1陰性菌株。圖2 部分菌株T3SS1基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析

注：M，100 bp DNA marker；1～7，T3SS2α基因陽(yáng)性菌株VP1362、VP1339、VP1335基因陽(yáng)性。圖3 部分菌株T3SS2α基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析

2.4遺傳標(biāo)志物基因檢測(cè)結(jié)果 181株副溶血弧菌中，142株攜帶toxRS/new基因，119株攜帶orf8基因，其中116株攜帶以上2種標(biāo)志基因，37株未攜帶以上2種基因，部分菌株遺傳標(biāo)志物基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳條帶見(jiàn)圖4、圖5。

注：M，2 000 bp DNA marker；1～4、6～7，該基因陽(yáng)性菌菌株；5，該基因陰性菌株。圖4 部分菌株toxRS/new基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析

注：M，2 000 bp DNA marker；1、3、5～7，該基因陰性菌株；2、4，該基因陽(yáng)性菌株。圖5 部分菌株orf8基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析

2.5溶血素及遺傳標(biāo)志基因、血清型分布 將181株副溶血弧菌的溶血素基因及遺傳標(biāo)志物基因、血清分型進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)，大流行菌株(tdh+、trh-、toxRS/new+和orf8+/-的菌株)占所有菌株的71.8%(130/181)；非大流行菌株指除了大流行菌株以外的菌株，占所有菌株的28.2%(51/181)。見(jiàn)表2。

表2 副溶血弧菌溶血素及遺傳標(biāo)志基因分布特點(diǎn)

2.6藥敏試驗(yàn)結(jié)果 181株副溶血弧菌對(duì)氨芐西林(AMP)、哌拉西林(PRL)、阿米卡星(AK)、慶大霉素(CN)、頭孢呋辛(CXM)耐藥性相對(duì)較高，分別為100%、25.44%、20.12%、11.83%、10.06%，對(duì)哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、亞胺培南(IPM)、美羅培南(MEM)、環(huán)丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)、四環(huán)素(TE)、氯霉素(C)均100%敏感，見(jiàn)表3。

表3 181株副溶血弧菌對(duì)抗菌藥物的藥敏結(jié)果(%)

3 討論

副溶血弧菌是一種嗜鹽細(xì)菌，常寄居在貝殼類、蝦、蟹等水產(chǎn)內(nèi)，是重要的食源性腹瀉疾病的病原菌。有報(bào)道，東南沿海副溶血弧菌是急性腹瀉感染患者中第二常見(jiàn)的病原菌[5]。近幾年，水產(chǎn)品被副溶血弧菌污染，是導(dǎo)致該菌感染的一個(gè)重要因素。吳曉芳等[6]近期的報(bào)道表明，湖州地區(qū)副溶血弧菌檢出率為5.31%，位居第二。從本研究可以看出，湖州三縣兩區(qū)均有副溶血弧菌引起的腸道感染發(fā)生。從月份分布來(lái)看，該菌有的感染存在明顯的季節(jié)分布，每年的4月份開(kāi)始出現(xiàn)感染病例，7、8月份達(dá)到高峰，秋冬季節(jié)又開(kāi)始變?yōu)榱阈歉腥静±?。分析原因，與該菌最適生長(zhǎng)溫度在20 ℃以上，在15 ℃以下時(shí)生長(zhǎng)會(huì)受到抑制的生存環(huán)境要求有關(guān)。從感染的年齡段分布來(lái)，主要集中在20～40歲的青壯年身上，因?yàn)樘幱谠撃挲g段的人，大多都是生活節(jié)奏快、應(yīng)酬多、飲食不固定的生活習(xí)慣，從而導(dǎo)致食源性感染癥狀頻發(fā)，副溶血弧菌感染率也居高。

副溶血弧菌對(duì)人體細(xì)胞的致病過(guò)程主要包括粘附、侵襲、繁殖、產(chǎn)生毒素等，其中目前已經(jīng)公認(rèn)的毒力因子包括：由tdh基因編碼的耐熱直接溶血素(TDH)、由trh基因編碼的相關(guān)溶血素(TRH)以及Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)[7]。其中，TDH是一種細(xì)胞毒素，具有溶血活性、細(xì)胞毒性和腸毒素活性。TRH與TDH類似，可以引起紅細(xì)胞溶解以及產(chǎn)生致死腸毒素。T3SS存在于副溶血弧菌毒力島上，是一種除TDH和TRH外的潛在毒力因子，其中T3SS1具有細(xì)胞毒性，T3SS2具有腸毒性。本研究發(fā)現(xiàn)，湖州地區(qū)食源性腹瀉患者分離的181株副溶血弧菌，164株攜帶tdh，1株攜帶trh，179株攜帶T3SS1，167株攜帶T3SS2α基因，未檢測(cè)到攜帶T3SS2β基因，表明分離的副溶血弧菌普遍攜帶毒力基因，致病性強(qiáng)。而作為遺傳標(biāo)志物基因的toxRS/new、orf8，142株攜帶toxRS/new基因，119株攜orf8基因。其中,116株攜帶以上2種標(biāo)志基因，37株未攜帶以上2種基因。另外，擁有tdh+、trh-、toxRS/new+和orf8+/-的大流行菌株，占所有菌株的71.8%；非大流行菌株占所有菌株的28.2%，說(shuō)明湖州地區(qū)副溶血弧菌是以大流行菌株為主。

副溶血弧菌目前已知的血清型有13種O抗原和71種K抗原，約有75種血清型與人類腹瀉有關(guān)。引起湖州地區(qū)食源性腹瀉的副溶血弧菌血清型多樣，主要以O(shè)3:K6為主，占53.6%(97/181)。這與煙臺(tái)[8]、寧波[9]等地報(bào)道一致，而與天津(O1:K3為主)[10]報(bào)道不一致，說(shuō)明各地流行的血清型存在差異。

在抗菌藥物方面，副溶血弧菌對(duì)于許多抗菌藥物目前還沒(méi)出現(xiàn)耐藥菌株，本研究可以看出，湖州地區(qū)分離的副溶血性弧菌對(duì)AMP表現(xiàn)出全耐藥，其次為PRL、AK。查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)目前中國(guó)的大流行株在耐藥譜方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)AMP表現(xiàn)為全耐藥，其次為對(duì)CXM等頭孢菌素和AK等氨基糖苷類抗菌藥物部分耐藥，對(duì)其他大部分常用抗菌藥物如MEM、TE、LEV等敏感，其中未發(fā)現(xiàn)多耐藥菌株[11]。這與本地區(qū)的耐藥譜基本相同。

本研究可以看出湖州地區(qū)引發(fā)食源性腹瀉的副溶血弧菌有地域性特征，而且存在明顯的季節(jié)分布特色和年齡段分布特色，毒力基因主要攜帶tdh、trh、T3SS1、T3SS2α，流行菌株以大流行菌株為主，血清型以O(shè)3:K6為主，對(duì)AMP 100%耐藥，對(duì)多數(shù)抗菌藥物敏感，臨床應(yīng)根據(jù)湖州地區(qū)副溶血弧菌的特征譜進(jìn)行治療。