張心雨，吳紅霞，王 濤，潘 力，付 強(qiáng)，孫 元*，仇華吉*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

自從人類(lèi)首次發(fā)現(xiàn)痘苗病毒可以用于預(yù)防天花以來(lái)，疫苗一直在疾病防控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。隨著免疫學(xué)與分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，疫苗的安全性、有效性、穩(wěn)定性等得到全面提高?；诨蚬こ碳夹g(shù)的病毒載體疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比，安全性、靶向性和可控性更高，且適于研制多價(jià)或多聯(lián)疫苗，因此成為疫苗研發(fā)的熱點(diǎn)。但該類(lèi)疫苗存在免疫效力低等問(wèn)題，仍需改進(jìn)。本文分別通過(guò)對(duì)目的基因和病毒載體的改造，以及免疫策略的改進(jìn)等方面總結(jié)了幾種提高病毒載體疫苗免疫效力的策略，為相關(guān)疫苗的研究提供參考。

1 病毒載體概述

病毒載體是指利用基因工程技術(shù)對(duì)自然弱毒疫苗株或野生型病毒株進(jìn)行一系列改造，以提高其安全性，并能容納一定范圍的外源基因，借助病毒的天然感染性，將外源基因?qū)氚屑?xì)胞的運(yùn)輸載體。例如利用慢病毒作為運(yùn)輸載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人造血干細(xì)胞用于開(kāi)展基因治療；復(fù)制缺陷型腺病毒或腺聯(lián)病毒作為一種低免疫原性的病毒載體，是目前基因治療的首選遞送工具，并且已應(yīng)用于一些疾病的臨床治療中。許多DNA 病毒和RNA 病毒均可作為遞送外源基因的載體，用于研制活載體疫苗，常見(jiàn)病毒載體的特性及優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表1。艾滋病、非洲豬瘟等一些傳染病目前尚無(wú)商品化疫苗，正在研制的弱毒疫苗侯選株由于反復(fù)接種傳代，可能會(huì)出現(xiàn)毒力返強(qiáng)。且傳統(tǒng)的滅活疫苗免疫原性較差，基于基因工程技術(shù)的新型疫苗如病毒載體疫苗將成為候選疫苗。病毒載體疫苗的作用機(jī)制見(jiàn)圖1。

圖1 病毒載體疫苗誘導(dǎo)宿主特異性免疫反應(yīng)的機(jī)制

表1 病毒載體疫苗的分類(lèi)及優(yōu)缺點(diǎn)

1.1 DNA 病毒載體及其應(yīng)用

大多數(shù)DNA 病毒基因組容量較大，具有多個(gè)復(fù)制非必需基因和非編碼區(qū)，可提供多個(gè)外源基因插入的位點(diǎn)，同時(shí)具有穩(wěn)定性好、增殖滴度高和宿主范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，非常適合作為載體用于表達(dá)外源基因。常見(jiàn)的DNA 病毒載體有皰疹病毒（Herpesvi?rus）、痘病毒（Poxvirus）、桿狀病毒（Baculovirus）和腺病毒（Adenovirus，AdV）。

皰疹病毒具有潛伏感染的特性，單次免疫后可為宿主提供持久保護(hù)，并且可以誘導(dǎo)其特異性的黏膜免疫[1]。目前，皰疹病毒載體已經(jīng)應(yīng)用于口蹄疫、禽流感和牛病毒性腹瀉等疫苗的研制；偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）SA215 株和BUK-d13 株以及雞馬立克氏病活疫苗FC-126 株和YT-7 株等皰疹病毒載體疫苗也已完成新獸藥注冊(cè)。痘病毒是在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中完成復(fù)制過(guò)程，不會(huì)與宿主基因組整合，安全性好，可誘導(dǎo)持久的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答[2]。已開(kāi)發(fā)的減毒痘病毒載體如金絲雀痘病毒ALVAC、復(fù)制缺陷型牛痘病毒安卡拉株MVA 和NYVAC、復(fù)制型痘苗病毒天壇株MVTT 和復(fù)制缺陷型痘苗病毒天壇株NTV 等是制備一些新發(fā)感染性疾病病原如埃博拉病毒、中東出血熱病毒等活載體疫苗常用的選擇[3]。腺病毒具有細(xì)胞嗜性廣、穩(wěn)定性好、安全性高、有多種血清型可供選擇等優(yōu)點(diǎn)[4]?？迪ＶZ生物股份公司與軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所團(tuán)隊(duì)合作研發(fā)的以腺病毒為載體的新型冠狀病毒疫苗，在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中宿主的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率高達(dá)95%以上，且并未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，證明其良好的安全性和免疫原性[5]，該疫苗已于2021年被國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市?；谥亟M腺病毒載體的埃博拉病毒疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答以及高水平的特異性抗體，且已在臨床實(shí)驗(yàn)中顯示出良好的安全性和免疫原性[6]。綜上所述，DNA 病毒作為活載體疫苗具有很高的科研和臨床應(yīng)用價(jià)值。

1.2 RNA 病毒載體及其應(yīng)用RNA 病毒也可以作為載體用于表達(dá)外源基因，其優(yōu)點(diǎn)包括基因組較小，利于改造；不會(huì)與宿主基因組整合，安全性好；在靶細(xì)胞中高效擴(kuò)增及轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生大量特異性蛋白。常見(jiàn)的RNA 病毒載體有新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）和麻疹病毒（Measles virus，MV）等。

NDV 可以在雞胚中增殖，疫苗生產(chǎn)成本較低，所表達(dá)的載體蛋白少，對(duì)宿主細(xì)胞的干擾較小，并且可以誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)[7]。Peeters 等構(gòu)建了基于T7 RNA 聚合酶的NDV 反向遺傳操作系統(tǒng)，并拯救出NDV LaSota 疫苗株。我國(guó)科研人員以LaSota 疫苗株為載體構(gòu)建了表達(dá)H5 亞型禽流感病毒（Avian influen?za virus，AIV）HA 基因的重組NDV，以該重組病毒作為疫苗侯選株研制的重組禽流感、新城疫二聯(lián)活疫苗（rL-H5株）于2007年獲得新獸藥證書(shū)，并得到了廣泛應(yīng)用。VSV作為載體的優(yōu)勢(shì)在于其能夠在Vero 細(xì)胞中高效增殖并在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)高效且持久的保護(hù)性免疫反應(yīng)[8]。自2011 年以來(lái)，我國(guó)陸續(xù)完成了以VSV 為載體的艾滋病、埃博拉疫苗臨床試驗(yàn)的評(píng)估[9]。表達(dá)外源基因的重組MV 安全性好，可以誘導(dǎo)良好的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，且生產(chǎn)成本低，可以大規(guī)模生產(chǎn)[10]。利用MV 作為載體開(kāi)發(fā)的若干重組病毒載體疫苗已開(kāi)展了多項(xiàng)臨床前研究，如今在世界范圍內(nèi)廣泛使用的MV 疫苗株主要有AIK-C 株、Edmonston 株 衍 生 的Schwarz 株 和Moraten 株 以 及“滬191”[11]。MV 作為一種很有應(yīng)用前景的即插即用型載體疫苗平臺(tái)，可用于快速開(kāi)發(fā)針對(duì)病毒和其他病原的有效疫苗。

將保護(hù)性抗原基因插入到病毒載體基因組構(gòu)建的重組病毒，經(jīng)肌肉注射后在宿主體內(nèi)表達(dá)外源蛋白，樹(shù)突狀細(xì)胞將外源蛋白降解為小肽后被MHC-I或MHC-II 類(lèi)分子遞呈至CD8+和CD4+T 細(xì)胞，從而激活CD8+和CD4+T 細(xì)胞，通過(guò)MHC-II 類(lèi)分子遞呈給B細(xì)胞后促進(jìn)其分化為漿細(xì)胞從而產(chǎn)生抗體。

2 病毒載體疫苗免疫效力增強(qiáng)的策略

為了應(yīng)對(duì)已知和新出現(xiàn)病原體帶來(lái)的挑戰(zhàn)，基于病毒載體疫苗的研究已成為當(dāng)下的熱點(diǎn)。但這類(lèi)疫苗在應(yīng)對(duì)某些疾病時(shí)并不能提供高效的免疫保護(hù)，其免疫效力還有待進(jìn)一步提高。通過(guò)對(duì)目的基因和病毒載體改造，以及改進(jìn)免疫策略可以進(jìn)一步提高病毒載體疫苗的免疫效力。

2.1 改造目的基因

2.1.1 啟動(dòng)子的優(yōu)化 啟動(dòng)子能增加或降低基因轉(zhuǎn)錄的速率。不同的啟動(dòng)子對(duì)外源基因表達(dá)的影響不同，優(yōu)化病毒啟動(dòng)子可以提高重組病毒載體表達(dá)外源抗原的水平。最常見(jiàn)的啟動(dòng)子包括病毒的內(nèi)源性啟動(dòng)子、猿猴病毒來(lái)源的SV40 啟動(dòng)子和組合型啟動(dòng)子等。

外源基因的表達(dá)強(qiáng)度和時(shí)間長(zhǎng)短會(huì)影響機(jī)體免疫應(yīng)答的水平。構(gòu)建重組PRV 時(shí)主要選用的是結(jié)構(gòu)獨(dú)特且活性較強(qiáng)的內(nèi)源性啟動(dòng)子，如gG、gE、gD 啟動(dòng)子和巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）啟動(dòng)子等。當(dāng)內(nèi)源性啟動(dòng)子不足以滿(mǎn)足外源基因的表達(dá)時(shí)，可以對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行優(yōu)化或?qū)⑵涮鎿Q為外源性啟動(dòng)子。因此，篩選最佳的啟動(dòng)子以提高抗原的表達(dá)水平已成為提高重組病毒載體疫苗免疫效力的重要策略。與含有CMV 啟動(dòng)子的腺病毒載體相比，勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus，RSV）啟動(dòng)子可以使外源基因的表達(dá)水平提高近10 倍[13]。有研究表明，在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（BEVS）中，異源IE1 啟動(dòng)子是表達(dá)外源蛋白的強(qiáng)啟動(dòng)子。采用白斑桿狀病毒（White spot baculovirus，WSBV）IE1 啟動(dòng)子的重組桿狀病毒與使用CMV 啟動(dòng)子的重組桿狀病毒相比，前者誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平更高[14]。相比于合成的啟動(dòng)子，天然痘病毒啟動(dòng)子PrMVA13.5L 所轉(zhuǎn)錄的ASFV p30 誘導(dǎo)了機(jī)體產(chǎn)生了更高水平的p30 抗體[15]。將天然啟動(dòng)子PrMVA13.5 串聯(lián)后免疫小鼠在加強(qiáng)免疫后，能夠誘導(dǎo)其產(chǎn)生顯著的T 細(xì)胞免疫應(yīng)答以及高水平抗體[16]。利用啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)并合成的痘苗病毒（Vaccinia virus，VACV）早晚期啟動(dòng)子（LEO），可以在體外顯著提高外源抗原的表達(dá)水平，同時(shí)增強(qiáng)小鼠體內(nèi)特異性CD8+T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答水平。由此可見(jiàn)，人工合成的啟動(dòng)子在提高外源抗原表達(dá)水平方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值[17]。

因此，優(yōu)化啟動(dòng)子可以從以下方面著手：利用非必需開(kāi)放閱讀框的內(nèi)源性啟動(dòng)子；將啟動(dòng)子串聯(lián)；對(duì)啟動(dòng)子活性核心區(qū)域氨基酸逐個(gè)替換后，比較其對(duì)各重組抗原表達(dá)水平的影響；將病毒啟動(dòng)子早晚期元件核心序列串聯(lián)以形成多拷貝序列。利用最佳啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因的表達(dá)可以提高載體疫苗的免疫原性和機(jī)體免疫應(yīng)答的能力[18]，因此啟動(dòng)子的優(yōu)化對(duì)于研制高效的載體疫苗至關(guān)重要。

2.1.2 密碼子優(yōu)化 優(yōu)化外源基因的密碼子可以增強(qiáng)其在生物體內(nèi)的表達(dá)水平。病原使用的密碼子通常與哺乳動(dòng)物不同，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)較弱的基因可以通過(guò)密碼子優(yōu)化來(lái)提高其表達(dá)量，通常采用的策略是避開(kāi)稀有密碼子，選擇高頻率使用的密碼子；或是從GC 含量、mRNA 次級(jí)結(jié)構(gòu)和順式調(diào)控元件等因素優(yōu)化密碼子。密碼子的改變會(huì)影響病毒基因組中免疫刺激基序CpG 和病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）增強(qiáng)子基序的組成，從而影響宿主干擾素（Interferons，IFNs）的應(yīng)答以及疫苗的免疫原性[19]。

密碼子的使用頻率在密碼子優(yōu)化的過(guò)程中尤為重要，因?yàn)槊總€(gè)生物都有自己首選的編碼特定氨基酸的密碼子。優(yōu)化外源基因的密碼子可以增強(qiáng)其表達(dá)水平。例如，新冠疫苗Ad5-S-nb2 是將SARSCoV-2 S 蛋白編碼的基因序列插入人5 型腺病毒（AdV5）載體的E1 區(qū)域，通過(guò)優(yōu)化S 基因的密碼子，S 蛋白能夠在人源細(xì)胞中高效表達(dá)[20]。研究證實(shí)，優(yōu)化外源基因的密碼子能夠增強(qiáng)其免疫效果。在腺病毒載體中插入經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的H5N1 亞型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）HA 基因免疫雞后可以更有效地抵抗同源AIV 的攻擊。RNA 病毒則可以通過(guò)增加其基因組CpG 基序的含量，從而增強(qiáng)宿主的先天性免疫應(yīng)答[21]。例如，呼吸道合胞體病毒（Re?spiratory syncytial virus，RSV）F 蛋 白 開(kāi) 放 閱 讀 框（Open reading frame，ORF）僅含有12 個(gè)CpG，經(jīng)優(yōu)化密碼子后，該ORF CpG 的含量顯著增加，免疫后機(jī)體的先天免疫反應(yīng)增強(qiáng)，而病毒的復(fù)制能力下降。經(jīng)密碼子優(yōu)化后的甲型流感病毒基因組CpG 含量升高，其致病性下降的同時(shí)，增強(qiáng)了感染小鼠的先天性及適應(yīng)性免疫反應(yīng)[22]。

在疫苗研發(fā)中，優(yōu)化密碼子可以使外源基因的表達(dá)和病毒毒力的減弱之間達(dá)到平衡，也可以提高活病毒疫苗和DNA 疫苗的免疫原性[23]。然而，密碼子優(yōu)化并不總是與疫苗的免疫效果呈正相關(guān)，需要相關(guān)研究人員對(duì)密碼子優(yōu)化前后的疫苗免疫效果比較后再判斷該策略的可行性。

2.2 改造載體

2.2.1 增強(qiáng)病毒載體的復(fù)制能力 在疫苗研制中，由于具有復(fù)制能力的病毒可能會(huì)引發(fā)機(jī)體的安全性問(wèn)題，因此通常首選復(fù)制缺陷型病毒作為疫苗載體。但病毒的復(fù)制能力強(qiáng)弱與外源抗原在宿主體內(nèi)表達(dá)的時(shí)間、表達(dá)水平以及所誘導(dǎo)機(jī)體的免疫保護(hù)效果有關(guān)。即病毒載體的復(fù)制能力與其誘導(dǎo)的免疫保護(hù)有一定的相關(guān)性。在黑猩猩模型中，分別注射復(fù)制型腺病毒和復(fù)制缺陷型腺病毒為載體表達(dá)HIV抗原的重組病毒，結(jié)果顯示，接種復(fù)制型重組腺病毒后，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了更強(qiáng)的免疫應(yīng)答[24]。分別以復(fù)制型疫苗病毒MVTT 與復(fù)制缺陷型牛痘病毒MVA為載體表達(dá)SARS-CoV 株刺突蛋白S，注射MVTT-S后，機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體水平比注射MVA-S 后高20倍～100 倍[25]。相比于復(fù)制缺陷型的NYVAC，復(fù)制型的NYVAC KC 株免疫動(dòng)物后，誘導(dǎo)了機(jī)體更廣泛的免疫應(yīng)答[26]。在小鼠攻毒模型中，復(fù)制能力弱的單純皰疹病毒1（HSV-1）ICP0 株為小鼠提供了免疫保護(hù)，而不具備復(fù)制能力的HSV-1 ICP4 株并未對(duì)其提供相應(yīng)的免疫保護(hù)[27]。有研究將野生型HSV-1 GS3株和HSV GS7 株的一兩個(gè)復(fù)制必需基因置于熱休克蛋白（HSP）基因的啟動(dòng)子之后，構(gòu)建的重組病毒可以通過(guò)接種部位熱處理后激活其復(fù)制[28]，與復(fù)制缺陷型HSV-1 KD6 株相比，接種了該重組病毒后誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)更高水平的免疫應(yīng)答，且經(jīng)過(guò)兩次免疫后，能夠?qū)γ庖咝∈筇峁┑挚怪滤佬詮?qiáng)毒攻擊的抵抗力，表明復(fù)制型載體擴(kuò)大了免疫應(yīng)答的種類(lèi)。這些研究表明病毒復(fù)制能力越強(qiáng)所引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)越強(qiáng)，而這些炎癥反應(yīng)可以有效地激活機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)強(qiáng)烈而持久的免疫反應(yīng)。

病毒復(fù)制能力的強(qiáng)弱對(duì)于機(jī)體誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答至關(guān)重要。因此，疫苗的安全性并不是簡(jiǎn)單通過(guò)減弱病毒載體的復(fù)制能力而獲得，或許可以通過(guò)控制病毒的復(fù)制場(chǎng)所以及復(fù)制持續(xù)的時(shí)間來(lái)確保其安全性。

2.2.2 刪除病毒基因組中的免疫調(diào)節(jié)基因 提高病毒載體疫苗免疫效力的另一種策略是增強(qiáng)病毒載體自身的免疫原性。病毒載體基因組中存在一些免疫調(diào)節(jié)基因用于逃避宿主的免疫反應(yīng)，可以通過(guò)刪除這些免疫調(diào)節(jié)基因來(lái)提高病毒載體的免疫原性。

可以通過(guò)逐步缺失VACV Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）抑制基因如A46R、A52R來(lái)提高NY?VAC 重組載體疫苗對(duì)宿主的特異性免疫反應(yīng)[29]。缺失VACV 載體中的K7R和B15R基因后，雖未增強(qiáng)其對(duì)機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)，但明顯減弱了其抗載體的免疫反應(yīng)[30]。在動(dòng)物模型中證實(shí)，缺失MVA 載體不同的免疫調(diào)節(jié)基因后，機(jī)體的免疫反應(yīng)得到了增強(qiáng)或減弱了抗載體免疫反應(yīng)。

病毒進(jìn)入機(jī)體后所引起的急性炎癥和細(xì)胞凋亡會(huì)激活宿主的先天性免疫反應(yīng)，這是引起宿主抗病毒反應(yīng)的主要原因。病毒已經(jīng)進(jìn)化出多種機(jī)制來(lái)逃避宿主的免疫防御系統(tǒng)，如編碼一些蛋白質(zhì)，通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、阻礙細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、產(chǎn)生干擾素和促炎性細(xì)胞因子及趨化因子等。因此研究病毒基因組中的免疫調(diào)節(jié)基因及其作用，有助于研制安全、高效的病毒載體疫苗。

2.2.3 提高病毒載體的細(xì)胞或組織靶向性 高效地將抗原運(yùn)送到特異性抗原遞呈細(xì)胞（APC）是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生CD8+T 細(xì)胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。為了提高免疫效果，可以將病原抗原高效地靶向樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）或通過(guò)外泌體遞呈給T 細(xì)胞。

DC 是APC 高度分化的亞群，是最有效的APC，一旦被激活，則可攜帶抗原遷移到次級(jí)淋巴組織，激活特異性T 細(xì)胞應(yīng)答，在病毒誘導(dǎo)機(jī)體引發(fā)的先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[31]。DC 的成熟狀態(tài)與其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)類(lèi)型及程度密切相關(guān)，靶向DC 亞群有利于誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)[32]。有研究報(bào)道構(gòu)建腺病毒靶向DC 的策略，顯著提高了DC 遞呈抗原的效率，從而增強(qiáng)了機(jī)體特異性CD8+T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答，因此將抗原靶向DC 可以顯著提高疫苗的免疫效力[33]。單域抗體（Single-domain antibodies，sdAbs）是一類(lèi)在駱駝科動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的天然缺失抗體輕鏈和重鏈恒定區(qū)的重鏈抗體，與普通抗體一樣，具有高親和性和特異性，可以利用其改變腺病毒載體疫苗的趨向性[34]。采用包膜顯示技術(shù)將sdAbs 整合到慢病毒中，能夠?qū)⒙《据d體靶向人類(lèi)和小鼠的APC 亞群，包括DC 和巨噬細(xì)胞[35]。

外泌體是一種由多種類(lèi)型的細(xì)胞分泌的囊泡，內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)、核酸、糖類(lèi)、脂質(zhì)等物質(zhì)。通過(guò)體液可以將其運(yùn)送到機(jī)體各個(gè)部位，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞間的信息交流以及機(jī)體的免疫反應(yīng)[36]。腫瘤細(xì)胞激活DC 后，產(chǎn)生的外泌體可以通過(guò)MHC-I 依賴(lài)的方式促進(jìn)CD8+T 細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞[37]；也有研究表明，T 細(xì)胞的狀態(tài)同時(shí)受到來(lái)自肥大細(xì)胞、上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等分泌的外泌體的影響，包括細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（Cytotoxic T lymphocytes，CTL）反應(yīng)、細(xì)胞因子的表達(dá)以及細(xì)胞活性[38]。將EGFP 與外泌體富集蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域（乳粘蛋白的C1C2 結(jié)構(gòu)域）融合后插入到復(fù)制缺陷型AdV 載體中，將其注射到小鼠體內(nèi)，抗原可以靶向外泌體表面表達(dá)，通過(guò)MHC-I 遞呈途徑處理后，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了高水平的CD8+T 細(xì)胞免疫應(yīng)答[39]。

為了解決機(jī)體內(nèi)存在的AdV 中和抗體的問(wèn)題，研究人員正在逐步使用稀有物種或非人源AdV 代替AdV5 作為載體，雖然這些AdV 作為載體誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫效力低，但可以通過(guò)以上策略提高其的免疫原性及穩(wěn)定性。

2.3 免疫/遞送策略

2.3.1 佐劑的使用 細(xì)胞因子主要調(diào)控Th1/Th2 細(xì)胞的免疫效應(yīng)，同時(shí)影響各細(xì)胞間的信息交流[40]。有研究表明，白介素、干擾素或干細(xì)胞生長(zhǎng)因子等免疫調(diào)節(jié)因子可以作為佐劑[41]，與外源基因同時(shí)插入病毒載體中，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的免疫反應(yīng)，并且可以減弱載體本身所引起的免疫抑制反應(yīng)。

恒定鏈（Invariant chain，Ii），是一種非多態(tài)性II型跨膜蛋白，具有多個(gè)功能域，在哺乳動(dòng)物中高度保守，并在不同類(lèi)型的免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)。Ii 與MHC-Ⅱ類(lèi)分子結(jié)合形成MHC-II 類(lèi)肽復(fù)合物，在抗原遞呈中起關(guān)鍵作用。以腺病毒、慢病毒和MVA 為載體將鼠Ii（Murine Ii，MIi）和人類(lèi)Ii（Human Ii，HIi）序列與外源基因融合，可以增強(qiáng)機(jī)體的T 細(xì)胞免疫應(yīng)答[42-43]。表明，Ii 增加了T 細(xì)胞免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和種類(lèi)。近年發(fā)現(xiàn)信號(hào)分子也可以作為佐劑配合疫苗使用。研究發(fā)現(xiàn)組織型纖溶酶原激活物（Tissue plas?minogen activator，tPA）信號(hào)序列增強(qiáng)了重組MVA 中Ag85B-TB10.4 的表達(dá)并提高了機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[44]。TLRs 在先天免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，細(xì)菌菌影（Bacterial ghosts，BGs）是基于TLRs 激動(dòng)劑的一種佐劑。為了提高基于AdV 和甲病毒復(fù)制子嵌合載體的豬瘟疫苗（rAdV-SFV-E2）對(duì)豬的免疫保護(hù)效果，研究人員將BG 作為佐劑與rAdV-SFV-E2聯(lián)合免疫后，誘導(dǎo)豬產(chǎn)生了更高水平的特異性抗體和中和抗體[45]。佐劑IC31（TLR9 激動(dòng)劑）與表達(dá)HIV包膜gp120.1 的NYVAC CN54 株共同免疫小鼠后，疫苗免疫原性得到了提高，并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了持久的免疫應(yīng)答[46]。聚丙烯酸聚合物Carbopol 具有佐劑特性，與改良的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine re?productive and respiratory syndrome virus，PRRSV）活疫苗配合使用后，可以促進(jìn)豬體內(nèi)T 細(xì)胞的分化以及IFN-γ 的產(chǎn)生[47]。將病毒載體疫苗與佐劑配合使用，產(chǎn)生的持久性免疫保護(hù)或許可以應(yīng)對(duì)病原的慢性感染和癌癥。

2.3.2 不同類(lèi)型疫苗的聯(lián)合免疫 某些疫苗需要多次免疫才能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)。與使用針對(duì)相同抗原的同種類(lèi)型疫苗（同源初免-加強(qiáng)免疫）相比，使用不同類(lèi)型疫苗初免和加強(qiáng)免疫（異源初免-加強(qiáng)免疫），其免疫原性及誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答均更強(qiáng)[48-49]。異源初免-加強(qiáng)免疫策略有以下優(yōu)勢(shì)：使用不同類(lèi)型疫苗遞呈抗原，能夠使機(jī)體更多地針對(duì)抗原誘導(dǎo)更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，有利于抗原的遞呈；不同類(lèi)型疫苗免疫可以增加機(jī)體免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和種類(lèi)；誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生效應(yīng)記憶T 細(xì)胞的數(shù)量增加[50]。

登革熱病毒（DENV）和中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）的研究表明，機(jī)體存在低水平的中和抗體和高水平的非中和抗體會(huì)導(dǎo)致病毒潛在的抗體依賴(lài)性增強(qiáng)效應(yīng)（ADE），從而有利于病毒的感染。例如將登革熱減毒活疫苗DENVax 與TAK 003 株通過(guò)異源初免-加強(qiáng)免疫策略免疫即可以消除ADE 的影響[51]。與單次免疫COVID-19 滅活疫苗相比，先接種AdV5 載體疫苗再接種相應(yīng)滅活疫苗或mRNA 疫苗，可顯著提高機(jī)體誘導(dǎo)的中和抗體水平[52]。相比于單獨(dú)使用載體疫苗免疫獼猴，MVA 和牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（Lumpy skin disease virus，LSDV）的組合免疫誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了更強(qiáng)烈的T 細(xì)胞免疫應(yīng)答[53]。因此，異源初免-加強(qiáng)免疫策略可以作為提高疫苗效力的有效方法。

2.3.3 接種途徑 最佳免疫方案除了與免疫劑量和加強(qiáng)免疫間隔時(shí)間有關(guān)以外，疫苗的接種途徑也是一個(gè)重要因素。常見(jiàn)的接種方式有肌肉注射、皮內(nèi)注射和皮下注射等。不同接種途徑所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)強(qiáng)度也不同。肌肉組織中只含有少數(shù)常駐的免疫細(xì)胞。但肌肉注射疫苗導(dǎo)致免疫細(xì)胞的顯著募集，易產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)[54]；皮膚中富含大量具有免疫功能的細(xì)胞，參與炎癥、修復(fù)和免疫反應(yīng)的起始階段；皮下組織主要由脂肪細(xì)胞組成，僅含有少數(shù)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞[55]。

靜脈注射卡介苗后，在機(jī)體肺實(shí)質(zhì)組織中檢測(cè)到了強(qiáng)烈的T 細(xì)胞免疫反應(yīng)[56]。通過(guò)肌肉注射減毒瘧疾疫苗后，機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)均一定程度的減弱[57]。已有研究表明，不同途徑接種重組禽痘病毒載體HIV 疫苗后，機(jī)體的肺或肌肉組織中的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的量也不同[58]。傳統(tǒng)的疫苗接種途徑有許多不足，例如人力成本高、易造成交叉感染、對(duì)機(jī)體應(yīng)激大等。無(wú)針注射方式可以很好地避免這些不足，并且可以提高APC的遞呈效率從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)。采用無(wú)針注射器經(jīng)獼猴的舌下和頰部注射后，在其體內(nèi)檢測(cè)到了高水平的抗體[59]。通過(guò)單劑量無(wú)針免疫VSV后可以誘導(dǎo)機(jī)體有效的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。Zhang 等通過(guò)無(wú)針免疫的方式注射VSV，可以對(duì)小鼠提供持久的免疫保護(hù)[60]。

總之，疫苗的接種途徑可以影響機(jī)體適應(yīng)性免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和種類(lèi)，對(duì)動(dòng)物免疫時(shí)需要探尋最佳的接種途徑，以便進(jìn)一步探究誘導(dǎo)機(jī)體高效免疫反應(yīng)的機(jī)制，從而更有效地提高病毒載體疫苗的免疫效力。

3 小結(jié)與展望

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，基因工程疫苗逐漸興起，病毒載體疫苗是當(dāng)前疫苗的一個(gè)研究熱點(diǎn)。對(duì)于病毒載體疫苗，可以通過(guò)一些策略來(lái)提高其免疫效力。例如通過(guò)優(yōu)化啟動(dòng)子或外源基因密碼子以提高外源基因的表達(dá)量進(jìn)而提高其的免疫原性，但外源基因的過(guò)量表達(dá)可能會(huì)給細(xì)胞造成一定影響，應(yīng)探究外源基因在機(jī)體內(nèi)的最佳表達(dá)量；還可以通過(guò)控制病毒載體的復(fù)制時(shí)間等保留外源抗原免疫原性的同時(shí)提高載體疫苗的安全性；病毒不斷進(jìn)化形成多種機(jī)制逃避宿主的免疫防御系統(tǒng)，可以通過(guò)敲除病毒的免疫調(diào)節(jié)基因來(lái)增強(qiáng)宿主的抗病毒反應(yīng)；病原抗原靶向DC 與提高疫苗免疫效力之間存在直接相關(guān)性，因此可以通過(guò)改造載體從而提高其靶向DC的能力以提高疫苗的免疫效力；在疫苗中添加相應(yīng)佐劑配合疫苗使用，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更持久的免疫保護(hù)；異源初免-加強(qiáng)免疫策略以及不同的免疫途徑可以影響機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和種類(lèi)，因此優(yōu)化免疫策略及免疫途徑對(duì)于疫苗的免疫效力也至關(guān)重要。

科學(xué)家提出病毒可以作為載體表達(dá)外源基因的思路已有30 多年，病毒載體疫苗的研究雖已取得一定的進(jìn)展，在臨床中也證明其有效，但該類(lèi)商品化疫苗較少。本研究室首創(chuàng)了基于AdV 和甲病毒復(fù)制子嵌合載體的新型豬瘟標(biāo)記疫苗（rAdv-SFV-E2株），該疫苗株能夠穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2 蛋白，并能夠?qū)SFV 強(qiáng)毒的攻擊提供完全的免疫保護(hù)。目前該疫苗共獲得了3 項(xiàng)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利以及轉(zhuǎn)基因安全證書(shū)和臨床試驗(yàn)批件，已經(jīng)完成臨床試驗(yàn)并進(jìn)行了新獸藥注冊(cè)。目前上市的病毒載體疫苗較少，所面臨的挑戰(zhàn)主要有以下幾方面：機(jī)體的抗載體免疫反應(yīng)，病毒載體進(jìn)入機(jī)體后會(huì)引起抗載體免疫反應(yīng)，再次免疫時(shí)會(huì)因?yàn)轶w內(nèi)已經(jīng)有了抗載體免疫力而使疫苗的免疫效果不理想，因此要解決載體本身誘導(dǎo)的抗體問(wèn)題；一些病毒載體疫苗易受母源抗體的影響，從而降低疫苗的免疫效果；如何平衡疫苗的安全性和免疫原性等。由此可見(jiàn)，病毒載體疫苗的研發(fā)技術(shù)還需要不斷改進(jìn)，或許利用不同的血清型病毒構(gòu)建重組載體疫苗、對(duì)重組病毒載體包裝、與其他類(lèi)型疫苗聯(lián)合免疫以及尋找更有效的抗原和最佳的免疫途徑等策略是解決這些問(wèn)題的關(guān)鍵。總之本文對(duì)研制病毒載體疫苗有一定的參考和借鑒意義，為相關(guān)疫苗的研究提供了相關(guān)理論依據(jù)。