形態(tài)選擇性卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射治療梗阻性無(wú)精子癥1例報(bào)告

李然，連方，郭穎

（山東中醫(yī)藥大學(xué) 1.針炙推拿學(xué)院，濟(jì)南 250014；2.附屬醫(yī)院生殖與遺傳中心，濟(jì)南 250014）

梗阻性無(wú)精子癥是由于輸精管道梗阻使精子的運(yùn)輸發(fā)生障礙而導(dǎo)致精液中無(wú)精子的疾病。外科獲取精子技術(shù)和卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射技術(shù)（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）的誕生和優(yōu)化成熟，使梗阻性無(wú)精子癥患者獲得了擁有親血緣關(guān)系后代的機(jī)會(huì)。形態(tài)選擇性卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic morphologically selected sperm injection，IMSI）是將活精子細(xì)胞器形態(tài)學(xué)檢測(cè)和ICSI結(jié)合，在6 000倍以上的放大倍數(shù)下，無(wú)需染色，實(shí)時(shí)、高分辨地觀察精子細(xì)微結(jié)構(gòu)，挑選出精子頭部空泡較少且各部分形態(tài)均正常的活動(dòng)精子進(jìn)行受精［1］。研究［2］顯示，梗阻性無(wú)精子癥患者行IMSI后，與傳統(tǒng)ICSI相比受精率顯著提高。本文總結(jié)了我科采用IMSI治療1例梗阻性無(wú)精子癥患者的療效，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行回顧分析。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

患者女，27歲，體質(zhì)量指數(shù)19.5 kg/m2。14歲月經(jīng)初潮，平素月經(jīng)規(guī)律，周期26～30 d，7 d經(jīng)凈，量中、色紅、質(zhì)可，無(wú)痛經(jīng)。2017年與丈夫同居，性生活正常（1～2次/周），未避孕。2018年10月于外院就診，基礎(chǔ)內(nèi)分泌檢查示卵泡刺激素10.50 mmol/L，黃體生成素3.73 mmol/L，雌二醇55.00 mmol/L，孕酮0.34 mmol/L，催乳素13.33 ng/mL，睪酮0.83 ng/mL，抗米勒管激素5.35 ng/mL。經(jīng)陰道超聲檢查示雙側(cè)卵巢各可見(jiàn)5～7枚竇卵泡，子宮、附件無(wú)明顯異常。甲狀腺功能正常，免疫檢查正常（抗核抗體譜、抗心磷脂抗體兩項(xiàng)、抗卵巢抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體均陰性），染色體正常。診斷為原發(fā)性不孕癥。

2018年男方于外院就診，2次精液常規(guī)檢查示精液中無(wú)精子，藥物治療無(wú)明顯改善，否認(rèn)外傷手術(shù)和生殖器官疾病史，附睪、輸精管、精索靜脈無(wú)明顯病變，男性第二性征正常。性激素、染色體未見(jiàn)異常，精漿果糖陰性，葡萄糖甘酶明顯偏低，睪丸穿刺見(jiàn)成熟精子。診斷為原發(fā)性不育癥，梗阻性無(wú)精子癥。

2018年底于外院行輔助生殖技術(shù)助孕，取卵6枚，行經(jīng)皮附睪穿刺取精結(jié)合卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection，PESA-ICSI）受精，形成3枚可移植胚胎，其中2枚第3天（D3）卵裂期胚胎，1枚第5天（D5）卵裂期胚胎。先后分2次移植，均未孕，無(wú)剩余胚胎。

2020年5月于我院生殖中心就診，要求助孕治療。2020年7月于我院行第一周期取卵，拮抗劑方案。月經(jīng)第2天普麗康（荷蘭Organon公司）200 IU 加注射用尿促性素（中國(guó)上海麗珠）75 IU啟動(dòng)促排卵，第7天開(kāi)始加用思則凱（瑞士Merck Serono有限公司）0.25 mg/d至艾澤（瑞士Merck Serono有限公司）250 μg扳機(jī)日（包括扳機(jī)日）。促性腺激素（gonadotropin，Gn）用量2 400 IU，使用時(shí)間9 d，卵泡數(shù) 14個(gè)，扳機(jī)日雌二醇3 110 pg/mL，黃體生成素1.48 mIU/mL，孕酮0.78 ng/mL，于2020年11月18日獲卵11枚。女方未見(jiàn)明顯異常，因“男方梗阻性無(wú)精子癥，原發(fā)性不育癥”行PESA-ICSI，正常受精6枚，形成3枚D3胚胎。新鮮胚胎移植2枚D3胚胎未孕，余1枚凍存。

2020年11月行第二周期取卵，因患者上個(gè)周期卵巢反應(yīng)較好，本次仍使用拮抗劑方案。月經(jīng)第2天果納芬（瑞士Merck Serono有限公司）150 IU加賀美奇（德國(guó)Ferring GmbH制藥有限公司）75 IU啟動(dòng)，第7天加用思則凱0.25 mg/d至艾澤250 μg扳機(jī)日（包括扳機(jī)日）。Gn用量2 400 IU，使用時(shí)間9 d，卵泡數(shù)15個(gè)，扳機(jī)日雌二醇＞5 010 pg/mL，黃體生成素2.65 mIU/mL，孕酮1.04 ng/mL。于2020年7月16日獲卵14枚?？紤]到與附睪穿刺相比，睪丸穿刺對(duì)患者睪丸內(nèi)生精小管功能的影響小，能夠避免醫(yī)源性附睪梗阻的發(fā)生［3］，且2種方式ICSI在安全性和療效方面無(wú)顯著差異［4］。為了取得更好的效果，本周期行經(jīng)皮睪丸穿刺取精結(jié)合形態(tài)選擇性卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（testicular epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic morphologically selected sperm injection，TESA-IMSI）受精。

1.2 TESA-IMSI實(shí)驗(yàn)室方法

1.2.1 卵母細(xì)胞收集和處理：將獲得的卵母細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱（Labotect C200，德國(guó)Labotect公司）培養(yǎng)4～6 h，放入含透明質(zhì)酸酶（80 IU/mL，美國(guó)Irvine Scientific公司）的培養(yǎng)液中，脫去周圍的顆粒細(xì)胞，選擇成熟的卵母細(xì)胞培養(yǎng)備用。

1.2.2 精液收集和處理：常規(guī)消毒陰囊皮膚、鋪無(wú)菌巾，注射2%利多卡因穿刺側(cè)精索阻滯麻醉，用手固定睪丸，使用30 mL注射器沿睪丸橫軸方向多個(gè)小角度反復(fù)進(jìn)針3～4次，負(fù)壓吸取少量睪丸組織，加入緩沖培養(yǎng)液（瑞典Vitrolife公司）中研磨，在400倍倒置顯微鏡（Nikon Ti-U，日本尼康株式會(huì)社）下仔細(xì)尋找精子，洗滌后獲得睪丸精子。

1.2.3 顯微操作：用緩沖培養(yǎng)液于玻璃底的平皿（353037，美國(guó)FALCON公司）中做數(shù)個(gè)5 μL液滴，在其中1個(gè)液滴中加入精子，無(wú)菌石蠟油（瑞典Vitrolife公司）覆蓋。用精子放大系統(tǒng)于6 000倍顯微鏡（Nikon Ti2-U，日本尼康株式會(huì)社）下觀察精子的外部形態(tài)以及精子頭部有無(wú)空泡（圖1），挑選未見(jiàn)頭部空泡且形態(tài)活動(dòng)正常的精子，用顯微操作儀NTX（日本Narishige公司）制動(dòng)精子，行ICSI。

圖1 活精子細(xì)胞器形態(tài)學(xué)檢測(cè)精子形態(tài) ×6 000

1.2.4 胚胎培養(yǎng)和質(zhì)量評(píng)估：準(zhǔn)備胚胎序貫培養(yǎng)液，卵裂期胚胎用G-1序貫培養(yǎng)液（瑞典Vitrolife公司），囊胚用G-2序貫培養(yǎng)液（瑞典Vitrolife公司），將顯微注射后的卵子置入，在培養(yǎng)箱37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。注射16～20 h后于顯微鏡下觀察受精情況，出現(xiàn)兩原核為正常受精。只有質(zhì)量良好的胚胎才能移植。本實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量良好的D3胚胎的特征是至少達(dá)到6細(xì)胞階段且碎片率＜20%。囊胚采用Gardner評(píng)分法［5］評(píng)估胚胎質(zhì)量。

2 結(jié)果

D3觀察胚胎情況：正常受精 9枚，可用胚胎9枚；取5枚胚胎培養(yǎng)囊胚，最終獲得5枚胚胎（4枚D3胚胎，1枚D5胚胎），包括2枚優(yōu)質(zhì)D3胚胎和1枚囊胚（圖2）。

圖2 胚胎鏡下圖像 ×200

取卵后因患者雌二醇過(guò)高，為預(yù)防卵巢過(guò)度刺激綜合征取消移植。2021年1月行凍融胚胎移植周期助孕，采用激素替代方案調(diào)整子宮內(nèi)膜。因患者要求移植D3胚胎，本周期解凍移植2枚D3胚胎。獲宮內(nèi)單胎妊娠，2021年10月5日足月順產(chǎn)一女孩，現(xiàn)健康狀況良好。

3 討論

梗阻性無(wú)精子癥病因主要包括先天性雙側(cè)輸精管缺如、輸精管炎癥導(dǎo)致阻塞、輸精管結(jié)扎術(shù)后及腹股溝疝、隱睪手術(shù)誤扎、誤切輸精管等［6］。有些梗阻性無(wú)精子癥患者可以通過(guò)手術(shù)疏通或重建輸精管恢復(fù)生育力，有些因手術(shù)失敗或者無(wú)法進(jìn)行手術(shù)疏通的患者則選擇輔助生殖技術(shù)助孕。

IMSI是一種非侵入性技術(shù)，可以在更高放大倍數(shù)（6 600～13 000倍）下對(duì)精子的頂體、頂體后致密層、頸部、線粒體、尾部和細(xì)胞核等6個(gè)細(xì)微亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)，挑選細(xì)微形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、頭部無(wú)空泡、活力良好的精子進(jìn)行顯微注射，以獲得更好的助孕結(jié)局。目前人們對(duì)IMSI的臨床應(yīng)用存在爭(zhēng)議，有研究［7-8］報(bào)道該技術(shù)對(duì)臨床妊娠率和活產(chǎn)率無(wú)有利影響，而基于不同的不孕原因分類的研究［9-12］結(jié)果表明，IMSI對(duì)臨床結(jié)果有積極的影響。研究［9］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IMSI用于男性因素不育癥和反復(fù)植入失敗的患者時(shí)，受精率顯著提高。研究［10］顯示，在對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠^察性研究進(jìn)行的薈萃分析中，IMSI與ICSI相比，活產(chǎn)率升高，流產(chǎn)率降低。BALABAN等［11］在一項(xiàng)前瞻性隨機(jī)研究中發(fā)現(xiàn)，在未按不孕原因進(jìn)行分類的不孕人群中，IMSI組的胚胎植入率、妊娠率和活產(chǎn)率都有上升的趨勢(shì)，而在嚴(yán)重男性因素不育夫婦中（如男方梗阻性無(wú)精子癥或嚴(yán)重少弱畸精子癥），IMSI組的胚胎植入率顯著高于ICSI組。研究［13］顯示，IMSI中正常細(xì)胞比例越高，妊娠率越高；而正常細(xì)胞比例較高的患者有足夠的正常精子受精，因此在男方因素不占主導(dǎo)地位時(shí)，IMSI與ICSI相比并無(wú)顯著差異。同時(shí)，尚無(wú)證據(jù)表明IMSI會(huì)增加先天性畸形的風(fēng)險(xiǎn)［8］。HERSHKO-KLEMENT等［14］的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，IMSI不增加畸形率，并可能降低胎兒缺陷、出生缺陷和染色體異常率。

目前IMSI最相關(guān)的適應(yīng)證仍有待確定，一般認(rèn)為其適用于以下情況：（1）前次ICSI失敗原因不明者；（2）試管嬰兒治療反復(fù)多次失敗、無(wú)明顯原因的反復(fù)流產(chǎn)者；（3）嚴(yán)重精子畸形患者（＞90%，傳統(tǒng)評(píng)估方法）；（4）從睪丸或附睪取精患者；（5）多次流產(chǎn)且活精子細(xì)胞器形態(tài)學(xué)檢測(cè)評(píng)估中精子頭部空泡比例高者；（6）≥35歲的男性，以往無(wú)卵子因素的周期治療失敗者；（7）多次試管周期中沒(méi)有或較少優(yōu)質(zhì)胚胎者（排除卵子因素）；（8）受精率低于25%或無(wú)受精患者［15］。IMSI是國(guó)內(nèi)新發(fā)展的技術(shù)，在我國(guó)進(jìn)行相關(guān)臨床試驗(yàn)的生殖中心較少，該技術(shù)更多用于實(shí)驗(yàn)研究中。因此，總結(jié)其適應(yīng)證尚無(wú)大量數(shù)據(jù)和研究支撐，但不可否認(rèn)其具有相當(dāng)?shù)呐R床價(jià)值，應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步探索。

綜上所述，IMSI可在更高倍數(shù)顯微鏡下選出形態(tài)和運(yùn)動(dòng)功能更好的精子，對(duì)于精液參數(shù)顯著異常、反復(fù)ICSI失敗的患者可顯著提高胚胎受精率、臨床妊娠率，并降低流產(chǎn)率。由于IMSI儀器價(jià)格比較昂貴、觀察時(shí)間長(zhǎng)、技術(shù)成本高、人員培訓(xùn)難度較大，尚未廣泛推廣。本例患者2個(gè)周期、多次移植未孕，最終通過(guò)IMSI成功妊娠，推測(cè)IMSI可作為梗阻性無(wú)精子癥患者嘗試助孕的有效方法。本例患者是單一案例，偶然性較大，目前已有多個(gè)國(guó)家開(kāi)展IMSI研究，未來(lái)需更多的臨床研究繼續(xù)探討IMSI的臨床應(yīng)用范圍和價(jià)值。