高效液相色譜柱后衍生熒光法測(cè)定柑橘中8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留

杜 鑫

(南充農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，四川 南充 637000)

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是以甲酸酯為前體化合物發(fā)展而來的一類高效、廣譜殺蟲劑，通過抑制昆蟲體內(nèi)乙酰膽堿酶和羧酸酯酶活性，使得昆蟲神經(jīng)功能紊亂而死，具有殘留期短、易代謝、低毒效和擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，主要應(yīng)用于果樹、蔬菜及糧食等農(nóng)作物的蟲害防治[1-2]。目前，這類農(nóng)藥的儀器檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[3-4]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-6]、液相色譜-紫外光度法[7]、液相色譜-柱后衍生熒光法[8-10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]。由于氨基甲酸酯類農(nóng)藥具有熱不穩(wěn)定性，氣相色譜法受到一定限制。液相色譜-紫外光度法檢測(cè)氨基甲酸酯類農(nóng)藥偏少，選擇性較差，靈敏度低、較易出現(xiàn)假陽性。質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)廣泛應(yīng)用于多組分農(nóng)藥的高通量、高靈敏度定性及定量分析，已成為農(nóng)藥多殘留檢測(cè)的主導(dǎo)技術(shù)和未來發(fā)展的趨勢(shì)[14-16]，但因其價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜、尚不便于基層檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用普及。本研究基于液相色譜-柱后衍生熒光檢測(cè)系統(tǒng)，建立了檢測(cè)柑橘中8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的分析方法，優(yōu)化了系統(tǒng)檢測(cè)條件，極大地提高了分析方法的效率、選擇性和靈敏度，以期為基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供技術(shù)參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 試劑耗材 涕滅威亞砜、涕滅威砜、涕滅威、滅多威、三羥基克百威、克百威、甲萘威、異丙威均購(gòu)于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(天津)，濃度均為1 000mg/L，用純甲醇稀釋配制成濃度均為100.0mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光保存于4℃冰箱內(nèi)。柱后衍生試劑為水分解堿液為0.05mol/L NaOH溶液(cat.No CB130)，OPA稀釋劑(cat.No CB910)，鄰苯二甲醛(O-Phthaladehyde，OPA，cat.NO 0120)，巰基乙醇(Thiofluor，cat. NO 3700-2000)，均購(gòu)于美國(guó)Pickering公司。

固相萃取小柱(Agilent，SPE-NH2小柱 500mg/6mL，貨號(hào)5982-1865)，“CNW”陶瓷均質(zhì)子(貨號(hào)CA8A50)和固相萃取裝置(Agilent)；甲醇，乙腈，二氯甲烷等均為色譜級(jí)；NaCl為分析純?cè)噭?0mL離心管，PTFE 0.22μm針筒式微孔濾膜。

1.2 儀器設(shè)備 Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜儀(配有Waters Reagent Manager柱后衍生反應(yīng)裝置)，2475型熒光檢測(cè)器，ML802型分析天平，GD16plus高速研磨均質(zhì)儀，3-18KS型高速冷凍離心機(jī)，RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，VORTEX 3型旋渦混合器，HR386破壁機(jī)。

1.3 樣品制備 取有代表性的柑橘(愛媛、春見、檸檬等)全果樣品帶皮切碎，采用四分法縮分后約1kg，放入破壁機(jī)中，高轉(zhuǎn)速(30 000 r /min)勻漿均質(zhì)后裝入潔凈的聚乙烯塑料樣品盒中，密封后于-18 ℃冰箱保存(使用前先解凍至室溫)。

1.4 樣品提取 稱取10g(精確至0.01g)柑橘樣品于50mL塑料離心管底部，依次加入1顆陶瓷均質(zhì)子，10.00mL乙腈，5 ～ 7g 氯化鈉，擰緊離心管蓋，放入低溫(5℃)高速研磨均質(zhì)儀中3 000r/min均質(zhì)提取3min，然后5 000r/min離心3min。吸取上清液5.00mL至250mL錐形瓶中，40℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，加入4mL甲醇+二氯甲烷(5：95，V：V)溶解殘余物，渦旋混勻后待凈化。

1.5 樣品凈化 將固相萃取氨基小柱(SPE-NH2)用4mL甲醇-二氯甲烷溶液(5：95，V：V)預(yù)淋洗，當(dāng)液面到達(dá)柱篩板頂部時(shí)，立即加入上述待凈化溶液，用50mL茄形瓶收集洗脫液，用3mL甲醇+二氯甲烷(5：95，V：V)涮洗錐形瓶后過柱，并重復(fù)1次，收集的全部洗脫液于30℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，準(zhǔn)確加入2.50mL甲醇-水(4：6，V：V)，渦旋混勻，用0.22μm針孔式微孔濾膜過濾，待測(cè)。

1.6 色譜條件 采用Waters XBridge C18色譜柱(4.6mm×150mm，4.5μm)，柱溫為40℃，樣品室溫度為20℃，進(jìn)樣體積為20.00μL。流動(dòng)相為甲醇(A)、純水(B)和乙腈(C)的混合溶液，按表1中的流動(dòng)相梯度洗脫條件對(duì)8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行洗脫分離。實(shí)樣測(cè)定過程中，如遇樣品中的雜質(zhì)峰對(duì)目標(biāo)物色譜峰有干擾，適當(dāng)調(diào)整流動(dòng)相的梯度洗脫比例，使兩者達(dá)到基線分離。

表1 高效液相色譜流動(dòng)相組成及梯度洗脫條件

1.7 柱后衍生熒光檢測(cè)系統(tǒng) 建立檢測(cè)8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的高效液相色譜-柱后衍生熒光檢測(cè)系統(tǒng)(圖1)，每一種氨基甲酸酯農(nóng)藥被色譜柱梯度洗脫分離后，在較高溫度下與強(qiáng)堿NaOH溶液在水解反應(yīng)盤管中發(fā)生水解反應(yīng)生成甲胺，甲胺與鄰苯二甲醛和巰基乙醇的混合溶液(OPA)在衍生反應(yīng)盤管中反應(yīng)轉(zhuǎn)變成具有強(qiáng)熒光相應(yīng)的異吲哚衍生物，進(jìn)入熒光檢測(cè)器，在激發(fā)波長(zhǎng)330nm，發(fā)射波長(zhǎng)465nm條件下進(jìn)行檢測(cè)。水解試劑和衍生試劑管線的流量均為0.20mL/min，水解反應(yīng)盤管的加熱器溫度為80℃，衍生反應(yīng)盤管溫度為室溫。

圖1 高效液相色譜-柱后衍生熒光檢測(cè)系統(tǒng)

1.8 衍生試劑配制 水解試劑用0.05moL/L NaOH溶液(CB130)，使用前將衍生泵1的吸液管濾頭插入后即可使用。衍生反應(yīng)試劑為OPA溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，稱取0.10g 鄰苯二甲醛固體，加入10mL純甲醇溶解，1.0g巰基乙醇固體用適量OPA稀釋劑(CB910)溶解，將完全溶解后的鄰苯二甲醛和巰基乙醇溶液倒入OPA稀釋劑瓶中，蓋上瓶蓋，輕微振蕩混合均勻，再插入衍生泵2的吸液管。

2 結(jié)果討論

2.1 分離條件優(yōu)化 試驗(yàn)初步選取甲醇(A)、純水(B)和乙腈(C)為流動(dòng)相，試樣定容劑為甲醇-水(5：5，V：V)混合溶液，進(jìn)樣體積為20.00μL，衍生泵流量均為0.30mL/min。由于涕滅威亞砜和的涕滅威砜具有非常強(qiáng)的極性，化學(xué)性質(zhì)非常相似，洗脫分離過程中兩者不容易達(dá)到基線分離，且易與樣品中含有的強(qiáng)極性干擾物的色譜峰重疊，故優(yōu)先選用了極性較強(qiáng)但洗脫能力較弱的甲醇+水(2：8，V：V)作為流動(dòng)相的起始梯度。當(dāng)樣品中的強(qiáng)極性干擾物與目標(biāo)物基線分離后，增加流動(dòng)相中乙腈比例，通過觀察8種農(nóng)藥的保留時(shí)間、峰形、相鄰峰之間的分離度、熒光響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度等來優(yōu)化液相色譜流動(dòng)相的洗脫程序，結(jié)果(表1)。該條件下能夠?qū)?種氨基甲酸酯農(nóng)藥達(dá)到基線分離，圖2為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線色譜圖，22min內(nèi)所有目標(biāo)物全部洗脫分離出來?？梢?，用甲醇-乙腈-水混合體系進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，提高了流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度和效率，有效改善了色譜峰峰形，增加了色譜峰響應(yīng)信號(hào)，提高了色譜峰分離度，極大地縮短了樣品的上機(jī)檢測(cè)時(shí)間。

圖2 8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 樣品提取劑優(yōu)化 氨基甲酸酯類農(nóng)藥難溶于水，較易溶于甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。因柑橘樣品中含有糖類、有機(jī)酸、維生素、色素及大量水分，為更充分地提取待測(cè)藥物，試驗(yàn)選用能與水互溶的乙腈和甲醇為提取劑。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：甲醇提取樣品后，有機(jī)相和水相難于徹底分離；乙腈對(duì)不同極性農(nóng)藥均有很好的提取效果，利用鹽析法又能與水兩相分離，還可以除掉樣品提取液中的有機(jī)酸物、糖類及維生素等大部分雜質(zhì)，有利于下一步凈化。經(jīng)優(yōu)化后，選用10.00mL乙腈為提取劑。

2.3 提取方式優(yōu)化 初步選用超聲振蕩提取、均質(zhì)機(jī)勻漿提取、均質(zhì)儀振蕩提取方式對(duì)樣品進(jìn)行處理。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：用高頻超聲波振蕩提取樣品超過40min后，水溫可升至60℃左右，可能會(huì)導(dǎo)致部分目標(biāo)物農(nóng)藥損失，每小時(shí)僅能處理樣品約40個(gè)；每個(gè)樣品如用高速勻漿機(jī)勻漿提取后，需要用水、丙酮+水(1：1，V：V)、水依次交替清洗勻漿機(jī)刀頭，溶劑耗損量大，過程耗時(shí)長(zhǎng)，不便于快速提取大批量樣品，也容易造成樣品間的交叉污染；采用高速研磨均質(zhì)儀提取后，避免了樣品間的交叉污染，每小時(shí)可處理約200個(gè)樣品，極大地提高了樣品提取效率。綜合考慮，選用高速振蕩均質(zhì)儀振蕩提取樣品。

2.4 洗脫劑優(yōu)化 據(jù)文獻(xiàn)研究[9-10]，SPE-NH2小柱可有效地除掉提取液中的碳水化合物、有機(jī)酸、糖分、酚類、色素及極性化合物等干擾雜質(zhì)。用相同空白基質(zhì)配制目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用SPE-NH2對(duì)其進(jìn)行凈化，以用不同體積比(1：99、3：97、5：95、7：93、10：90)的甲醇+二氯甲烷混合溶液為洗脫劑，考察了其對(duì)目標(biāo)物洗脫效果的影響。結(jié)果表明：當(dāng)洗脫劑中甲醇體積分?jǐn)?shù)增加，回收率基本穩(wěn)定。當(dāng)用6mL甲醇-二氯甲烷(5：95，V：V)為洗脫劑，分2次洗脫，目標(biāo)藥物附近的干擾峰較少且回收率接近100%。

2.5 樣品溶劑優(yōu)化 樣品溶劑不僅要完全溶解樣品中的待測(cè)農(nóng)藥，也要有利于減少溶解樣品中的干擾物，便于上機(jī)分析檢測(cè)。以純甲醇為樣品溶劑時(shí)，所得的色譜圖(圖3)?？梢园l(fā)現(xiàn)，較早洗脫出的涕滅威亞砜和涕滅威砜的色譜峰扭曲和變形了，而其余較之晚出峰的其他6種農(nóng)藥組分的色譜峰正常。涕滅威亞砜和涕滅威砜濃度越低，色譜峰展寬、扭曲、變形和分叉越嚴(yán)重，這是因?yàn)橛脧?qiáng)溶劑純甲醇溶解樣品時(shí)，樣品溶劑在柱內(nèi)可以看作流動(dòng)相的一部分，溶解于強(qiáng)溶劑的洗脫帶，一部分樣品會(huì)被強(qiáng)溶劑迅速洗脫出色譜柱，另一部分在洗脫過程中溶于流動(dòng)相，被流動(dòng)相洗脫出，從而造成了色譜峰的展寬、扭曲和分叉，導(dǎo)致分析方法的準(zhǔn)確度和精密度下降。這種現(xiàn)象符合溶劑效應(yīng)[17]，當(dāng)樣品溶液的溶劑強(qiáng)度強(qiáng)于流動(dòng)相強(qiáng)度時(shí)，造成較早洗脫的峰前沿、扭曲或開叉，而較晚洗脫的色譜峰則正常。

圖3 樣品溶劑對(duì)8種氨基甲酸酯農(nóng)藥色譜峰的影響(0.050mg/L)

另外，采用減小試樣進(jìn)樣體積或用流動(dòng)相梯度洗脫的初始比例溶液來溶解樣品可以減小或者消除“溶劑效應(yīng)”。當(dāng)進(jìn)樣體積減小后，目標(biāo)物的熒光響應(yīng)信號(hào)值減小，方法靈敏度降低；用流動(dòng)相的初始比例甲醇+水(2：8，V：V)溶解樣品時(shí)，由于氨基甲酸酯類農(nóng)藥易溶于有機(jī)溶劑，不易溶于水，可能導(dǎo)致樣品溶劑不能完全溶解樣品中的強(qiáng)保留目標(biāo)物，導(dǎo)致重現(xiàn)性變差及回收率降低。經(jīng)優(yōu)化，選用甲醇+水(4：6，V：V)為樣品溶劑，不僅有效改善了加標(biāo)樣品中涕滅威亞砜和涕滅威砜的峰形，還降低了基線噪音，提高了分離度和熒光響應(yīng)值。

2.6 水解反應(yīng)溫度優(yōu)化 考察了柱后衍生系統(tǒng)中水解反應(yīng)盤管的加熱器(圖1)在30℃～100℃溫度范圍內(nèi)對(duì)目標(biāo)物熒光響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明，當(dāng)加熱器溫度>70℃時(shí)，8種農(nóng)藥的熒光響應(yīng)值均達(dá)到最大值并趨于穩(wěn)定，表明色譜梯度洗脫分離后的目標(biāo)物與水解試劑NaOH完全反應(yīng)，最終確定水解反應(yīng)加熱器溫度為80℃。

2.7 衍生試劑流量及穩(wěn)定性 當(dāng)衍生試劑濃度一定時(shí)，其流量不僅決定從色譜柱中洗脫出的目標(biāo)物與衍生試劑的反應(yīng)程度，還會(huì)影響目標(biāo)物的峰展寬、峰高、分離度及分析速度。在0.10～0.50mL/min范圍內(nèi)，考察了衍生試劑流量的影響，結(jié)果表明：當(dāng)流量為0.20～0.40mL/min時(shí)，8種氨基甲酸酯農(nóng)藥與衍生試劑均完全反應(yīng)，產(chǎn)物的熒光響應(yīng)信號(hào)基本不變，峰形和分離度很好，為節(jié)省衍生試劑，確定衍生試劑流量均為0.20mL/min。另外，當(dāng)衍生試劑OPA使用時(shí)間超過5d，溶液略微發(fā)黃，目標(biāo)物的熒光響應(yīng)值也會(huì)降低，故OPA衍生試劑一定要現(xiàn)配現(xiàn)用，且避免陽光直射，建議放入瓦楞紙箱中，并在旁邊放入冰袋。

2.8 線性范圍和檢出限 分別準(zhǔn)確吸取一定體積的8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成10.0mg/L工作液，用甲醇+水(4：6，V：V)逐級(jí)稀釋成濃度為0.010、0.020、0.050、0.10、0.50、1.0mg/L一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，熒光響應(yīng)信號(hào)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性擬合，結(jié)果(表2)，所擬合的直線線性相關(guān)系數(shù)r為0.999 3～0.999 9，線性很好。為計(jì)算儀器信噪比(Signal-to-noise ratio，S/N)，在目標(biāo)物最低質(zhì)量濃度附近添加了一系列已知濃度的雙份樣品，測(cè)定其響應(yīng)信號(hào)，用S/N=3計(jì)算方法的檢出限為2～5μg/kg。

表2 8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限

2.9 回收率、精密度及定量限 選取篩選后的檸檬、春見、愛媛空白基質(zhì)，添加0.010、0.020、0.50mg/kg 3個(gè)濃度水平混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)試樣做3個(gè)平行質(zhì)控樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。為模擬實(shí)樣檢測(cè)，向樣品中加入農(nóng)藥后，輕微渦旋振蕩離心管，密封過夜，次日按照1.3～1.7節(jié)條件進(jìn)行檢測(cè)，分別計(jì)算回收率和精密度。柑橘空白基質(zhì)加標(biāo)色譜圖(圖4)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表3)，試樣加標(biāo)回收率均介于82.3%～105.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation，RSD)為2.7%～6.2%，回收率和精密度均符合“實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)”的分析要求[18]，滿足實(shí)樣檢測(cè)要求。經(jīng)加標(biāo)回收率試驗(yàn)驗(yàn)證，確定方法的定量限為0.010mg/kg。

圖4 柑橘空白基質(zhì)加標(biāo)色譜圖(0.010mg/kg)

表3 柑橘加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果(n=3)

續(xù)表

2.10 實(shí)樣檢測(cè) 應(yīng)用該方法對(duì)40個(gè)柑橘樣品進(jìn)行篩查檢測(cè)，有2個(gè)批次樣品檢出克百威，其他7種農(nóng)藥組分均未檢出。為進(jìn)一步確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果，用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法GB 23200.121-2021[19]對(duì)陽性樣品進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果(表4)。兩種方法測(cè)定的樣品含量基本一致，相對(duì)誤差均<7%。查限量標(biāo)準(zhǔn)[20]，克百威在柑橘類水果中的最大允許殘留限量值為0.02mg/kg，第2個(gè)檸檬樣品超標(biāo)，后續(xù)跟進(jìn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該種植戶使用了農(nóng)藥丁硫克百威，丁硫克百威易代謝生成克百威[21]，導(dǎo)致樣品中克百威殘留超標(biāo)。

表4 方法對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜柱后衍生熒光法檢測(cè)柑橘中8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的分析方法，樣品經(jīng)乙腈提取、SPE-NH2固相凈化，利用柱后光化學(xué)熒光衍生系統(tǒng)極大地提高了方法的選擇性、靈敏度和抗干擾能力。該方法具有分離效果好、選擇性高、通用性強(qiáng)及檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，回收率、精密度和定量限均能滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，適宜柑橘中多種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的同時(shí)檢測(cè)，也可為基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供技術(shù)參考和借鑒。