廣州市沙田檸檬炭疽病病原菌種類(lèi)的分子鑒定

崔一平，彭埃天，宋曉兵，馮冠杰，黃 峰，陳 霞，凌金鋒，程保平

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南果蔬綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.廣州市白云區(qū)沙田檸檬農(nóng)產(chǎn)品專(zhuān)業(yè)合作社，廣東 廣州 510550）

【研究意義】沙田檸檬〔Citrus limon（L.）Burm.f.,Shatian lemon〕又稱(chēng)香水檸檬、香櫞檸檬，是蕓香科柑橘屬常綠小喬木，因主要種植于廣東省廣州市白云區(qū)沙田村而得名。由于沙田村獨(dú)特的氣候條件，該地及所產(chǎn)檸檬已于2009 年通過(guò)無(wú)公害的產(chǎn)地認(rèn)證及產(chǎn)品認(rèn)證，屬于無(wú)公害食品、有機(jī)食品和國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品［1］。檸檬炭疽病是影響檸檬產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害之一，多發(fā)生在高溫多雨地區(qū)，而廣州氣候常年高溫多雨，極易引起該病的發(fā)生；炭疽病主要危害柑橘類(lèi)植物的葉片、樹(shù)梢、花和果實(shí)等部位，潛伏在果實(shí)中的病原菌也可在儲(chǔ)運(yùn)期繼續(xù)對(duì)果實(shí)造成危害［2］。研究表明，不同的炭疽病病原菌對(duì)同一化學(xué)藥劑的敏感性也不同，因此明確引起沙田檸檬炭疽病的病原菌種類(lèi)對(duì)精準(zhǔn)防控該病害具有重要的現(xiàn)實(shí)意義［3-5］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】柑橘炭疽病主要由炭疽菌屬（Colletotrichumsp.）真菌引起。目前已報(bào)道的引起柑橘炭疽病的病原菌主要有炭疽菌屬的膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）、尖孢炭疽菌（C.acutatum）、喀斯特炭疽菌（C.karstii）、果生刺盤(pán)孢菌（C.fructicola）和暹羅刺盤(pán)孢菌（C.siamense）等［4-6］。本課題組調(diào)查發(fā)現(xiàn)，沙田村檸檬種植園沙田檸檬上的主要病害有炭疽病、瘡痂病、黃龍病等，主要害蟲(chóng)有紅蜘蛛、薊馬、葉螨等，除薊馬和炭疽病對(duì)沙田檸檬的產(chǎn)量和品質(zhì)造成一定危害外，其他病蟲(chóng)害危害程度均較輕［7］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)引起沙田檸檬炭疽病的病原菌種類(lèi)缺乏系統(tǒng)研究，而不同種類(lèi)炭疽病對(duì)藥劑敏感性存在差異，明確其病原菌種類(lèi)對(duì)于精準(zhǔn)防控沙田檸檬炭疽病具有至關(guān)重要的作用?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為了研究引起廣州市沙田村沙田檸檬炭疽病的病原菌種類(lèi)，2019—2021 年期間我們采集了具有炭疽病典型癥狀的沙田檸檬葉片和果實(shí)，開(kāi)展病原菌的組織分離、致病性測(cè)定及其分子生物學(xué)鑒定，以期明確引起該地區(qū)檸檬炭疽病的病原菌種類(lèi)，為沙田檸檬炭疽病的防治提供理論基礎(chǔ)和方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病樣：2019—2021 年期間采集自廣東省廣州市白云區(qū)沙田村沙田檸檬上具有炭疽病典型癥狀的葉片和果實(shí)；健康沙田檸檬植株的葉片和果實(shí)也采自沙田村。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、去離子水定容至1 000 mL。

試劑及儀器：植物DNA 提取試劑盒，愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；PCR 擴(kuò)增試劑盒2×EasyTaq PCR SuperMix（-dye），北京全式金生物技術(shù)有限公司。美國(guó)貝克曼Microfuge 20微量離心機(jī)（美國(guó)，Beckman Coulter,Inc.）、T100TMPCR 儀及美國(guó)伯樂(lè)1704487 小型水平電泳槽（美國(guó)，BIO-RAD company）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離與形態(tài)特征觀察 每年選取具炭疽病癥狀的沙田檸檬葉15 片和有白斑的檸檬果實(shí)3 個(gè)，用剪刀在病健交界處剪出0.2 cm 左右的正方形小塊，依次用70%酒精浸泡30 s、2%NaClO 浸泡90 s、無(wú)菌水沖洗4 次，而后置于無(wú)菌濾紙上晾干，最后放置于PDA 培養(yǎng)基上于25 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)。3～5 d 后，通過(guò)挑取單孢子接種在新的PDA 平板上繼續(xù)進(jìn)行純化培養(yǎng)。7～10 d 后，在顯微鏡下對(duì)分離出菌株的菌絲和孢子進(jìn)行鏡檢，每個(gè)菌株觀察視野超過(guò)10 個(gè)，約能看到100 多個(gè)孢子，并統(tǒng)計(jì)其中50 個(gè)孢子的大小。

1.2.2 致病性測(cè)定 對(duì)僅從檸檬病果上分離獲得的真菌菌株命名為ST2，其代表菌株ST2-1、ST2-2 和ST2-3 采用針刺接種菌絲塊的方法分別接種3 個(gè)健康的沙田檸檬果實(shí)（每個(gè)果實(shí)上3 個(gè)接種點(diǎn)），以接種PDA 空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照；同時(shí)在液體PD 培養(yǎng)基中對(duì)菌株ST3-1、ST3-2、ST3-3 以及ST4-1、ST4-2、ST4-3 進(jìn)行培養(yǎng)，制成1×106CFU/mL 的孢子懸浮液，分別噴灑接種在3 株3 月齡的健康沙田檸檬苗的葉片和枝干上；以噴灑無(wú)菌水作為陰性對(duì)照。然后將這些檸檬果實(shí)和植株放置于溫度28 ℃、濕度75%的溫室中進(jìn)行正常培養(yǎng)，光照/黑暗時(shí)間為12 h/12 h；每天對(duì)檸檬葉片和果實(shí)上的病害癥狀進(jìn)行觀察，并拍照記錄。

1.2.3 真菌的分子生物學(xué)鑒定 將培養(yǎng)7 d的菌株ST2-1、ST2-2、ST2-3、ST3-1、ST3-2 和ST3-3以及ST4-1、ST4-2 和ST4-3 的菌絲分別從PDA平板上刮下來(lái)，迅速用液氮研磨。然后依據(jù)Axygen 動(dòng)植物基因組DNA 制備試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行真菌全基因組DNA 的提取，研究中用到的引物合成及PCR 產(chǎn)物測(cè)序服務(wù)均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。選取核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、微管蛋白（β-Tubulin）、延伸因子1α 基因（EF-1α）、肌動(dòng)蛋白Actin（ACT）、鈣調(diào)節(jié)蛋白（CAL）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）、大亞基基因large subunit（LSU）genes 和幾丁質(zhì)合成酶Chitin synthase（CHS1）的檢測(cè)引物為ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b、EF-2/EF-1、ACT-783R/ ACT-512F、CL1/CL2、gpd1/gpd2、LR5/LR0R 和CHS79-F/CHS354-R（表1），以提取的菌株全基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增［8-16］。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；然后對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，將陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物送去測(cè)序。在NCBI 的BLAST 中對(duì)獲得的片段信息進(jìn)行對(duì)比并將部分基因片段提交到NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)利用MegAlign 7.1.0（44）軟件以最大自然法分別建立ST2-1、ST3-1 和ST4-1 的進(jìn)化樹(shù)，根據(jù)菌株之間的聚和程度確定病原菌的分類(lèi)地位。

表1 本研究中用到的引物及其序列Table 1 The primer sequences used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 沙田檸檬炭疽病的危害及田間癥狀

沙田檸檬炭疽病可發(fā)生在檸檬的葉片、枝梢和果實(shí)上。炭疽病危害葉片時(shí)，初期多從葉尖或葉緣進(jìn)行侵入，而后逐漸擴(kuò)展成黃褐色云紋狀病斑，多呈“V”字型，嚴(yán)重時(shí)可造成大量落葉；炭疽病危害枝梢時(shí)多發(fā)生在梢頂，初為淡褐色橢圓形病斑，最后整個(gè)梢頂枯死；炭疽病危害果實(shí)時(shí)，最初為白色小點(diǎn)，在環(huán)境適宜時(shí)病斑逐漸擴(kuò)大至整個(gè)果實(shí)，但這些白色片狀斑點(diǎn)不深入果皮，僅在果實(shí)表面造成危害，嚴(yán)重影響檸檬的外觀和經(jīng)濟(jì)價(jià)值（圖1）。

圖1 沙田檸檬炭疽病的田間癥狀Fig.1 Symptoms of anthracnose disease on Shatian lemon in field

2.2 病原菌的培養(yǎng)特征及形態(tài)特征

通過(guò)對(duì)沙田檸檬炭疽病樣的組織分離和培養(yǎng)，共獲得30 株真菌菌株。經(jīng)過(guò)單胞分離，在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 后，通過(guò)菌株的菌落顏色、菌落形態(tài)和菌絲孢子形態(tài)觀察，可將分離所得的30 株真菌菌株分為3 類(lèi)。第一類(lèi)僅從檸檬病果上分離獲得，命名為ST2，該類(lèi)真菌的分離率為30%（該分離率僅指占在沙田檸檬上分離所得的炭疽菌屬Colletotrichumsp.真菌中的比例）；ST2菌落圓形，淡灰色，菌絲濃密，從平板背面可看到菌落上附有大量黑色孢子堆；菌絲無(wú)色，有分隔和分叉；孢子單胞、透明，梭形，兩端鈍圓，大小為14.0～19.8 μm × 4.4～6.1 μm（n=50）（圖2A～圖2C）。選取其中3 株（ST2-1、ST2-2、ST2-3）作為代表菌株進(jìn)行后續(xù)研究。第二類(lèi)僅從檸檬病葉上分離獲得，命名為ST3，該類(lèi)真菌的分離率為10%；ST3 在PDA 培養(yǎng)基上的菌落邊緣均整齊，最初為白色，而后逐漸變?yōu)榛液稚?，菌絲稀疏至濃密，無(wú)或少剛毛，菌落上附有黑色分生孢子粘孢團(tuán)；菌絲為白色或棕褐色，有間隔和分支，孢子為卵圓形或圓柱形，透明，無(wú)分隔，內(nèi)含1～3 個(gè)油球，大小為14.8～26.3 μm × 3.1～4.5 μm（n=50）（圖2D～圖2F）。選取其中3 株（ST3-1、ST3-2、ST3-3）作為代表菌株進(jìn)行后續(xù)研究。第三類(lèi)命名為ST4，該類(lèi)真菌僅從檸檬病葉上分離獲得、分離率為60%，在PDA 培養(yǎng)基上的菌落邊緣均整齊，最初為白色，之后僅菌落中間變?yōu)闇\灰色和白色相間，菌絲稀疏，無(wú)或少剛毛，菌落上附有橘紅色和黑色分生孢子粘孢團(tuán)；菌絲為透明、有分枝和分隔，分生孢子單胞、橢圓形、透明且無(wú)隔膜，兩端圓形，內(nèi)含1 個(gè)油球，大小為14.5～18.9 μm × 3.7～5.9 μm（n=50）（圖2G～圖2I）。從中選取3 株（ST4-1、ST4-2、ST4-3）作為代表菌株進(jìn)行后續(xù)研究。由于每類(lèi)真菌的生物學(xué)特性幾乎一致，因此文中僅顯示ST2-1、ST3-1 和ST4-1 在PDA 平板上的菌落形態(tài)及在顯微鏡下的孢子和菌絲形態(tài)（圖2）。

圖2 炭疽病菌屬病原菌ST2-1、ST3-1 和ST4-1 在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 后的菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)Fig.2 Colonial and conidial morphology characteristics of Colletotrichum sp.strains ST2-1,ST3-1 and ST4-1 cultured on PDA for 7 days

2.3 病原菌的致病性及分子鑒定

在健康的沙田檸檬果實(shí)上分別針刺接種菌株ST2（ST2-1、ST2-2 和ST2-3）的菌絲塊，PDA空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照接種于檸檬果實(shí)上；將ST3（ST3-1、ST3-2、ST3-3）和ST4（ST4-1、ST4-2、ST4-3）濃度為1×106CFU/mL 的孢子懸浮液分別噴灑于3 月齡的健康檸檬葉片上（整株噴灑），無(wú)菌水作為陰性對(duì)照。7 d 后，接種的檸檬果實(shí)和葉片均出現(xiàn)與田間相似的炭疽病癥狀；而后從發(fā)病的沙田檸檬果實(shí)和葉片上可再分離獲得單一的、與原接種菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征相一致的病原菌，從而進(jìn)一步確定菌株ST2（ST2-1、ST2-2 和ST2-3）、ST3（ST3-1、ST3-2 和ST3-3）以及ST4（ST4-1、ST4-2 和ST4-3）均為沙田檸檬炭疽病的病原菌，圖3 中僅顯示ST2-1、ST3-1及ST4-1的致病性測(cè)定結(jié)果，其他菌株的接種結(jié)果與此相類(lèi)似。

圖3 沙田檸檬炭疽病菌的致病力Fig.3 Pathogenicity of the pathogen causing anthracnose on Shatian lemon

為了對(duì)病原菌ST2、ST3 和ST4 進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，本研究采用引物ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b、ACT-512F/ACT-783R、CL1C/CL2C 和CHS79-F/CHS354-R，以ST2（ST2-1、ST2-2 和ST2-3）全基因組為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別得到540、749、241、265 bp 的ITS、CAL、ACT和CHS1；以ST3（ST3-1、ST3-2 和ST3-3）全基因組為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別得到549、464、233、278 bp 的ITS、TUB2、ACT和CHS1片 段（圖4）。通過(guò)膠回收和測(cè)序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，分別以ST2-1、ST2-2 和ST2-3 為模板擴(kuò)增的同一基因片段相似性達(dá)到100%，而以ST3-1、ST3-2和ST3-3 為模板擴(kuò)增的同一基因片段相似性達(dá)到99%以上。將得到的序列在GenBank 中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株ST2（ITS：OM 698365；ACT：OM 746167；CAL：OM 746165；CHS1：OM746166，此處的基因序列登陸號(hào)是以ST2-1為模板擴(kuò)增獲得的片段信息）與暹羅刺盤(pán)孢C.siamenseMSO（ITS：MK673873.1；ACT：MK674786；CAL：MK674788；CHS1：MK674790）具有99% 以上的同源性；而ST3（ITS：MZ 646051；ACT：OK 086976；TUB：OK 086977；CHS1：OK086977，此處的基因序列登陸號(hào)是以ST3-1 為模板擴(kuò)增獲得的片段信息）則與蘭花刺盤(pán)孢C.cliviicolaLJ2-1（ITS：MT 351121；CHS1：MT 396799；TUB：MT 396863；ACT：MT396767）具有較高的同源性，達(dá)到99%以上。同時(shí)我們也以LR5/LR0R 和EF-2/ EF-1 為引物，對(duì)ST3 基因組進(jìn)行分子鑒定，擴(kuò)增獲得904 bp 的LSU和568 bp 的TEF1基因，通過(guò)NCBI BLAST 發(fā)現(xiàn)ST3 也屬于Colletotrichumsp.（LSU：DQ286216.1，TEF1：GU994315.1）。但由于這2 個(gè)基因在炭疽菌屬內(nèi)小種的分類(lèi)研究中應(yīng)用較少且鑒定效果不穩(wěn)定，因此在后續(xù)建立進(jìn)化樹(shù)時(shí)未予采用［17］。綜上所述，初步判斷ST2 屬于暹羅刺盤(pán)孢（C.siamense），ST3 屬于蘭花刺盤(pán)孢菌（C.cliviicola）。

同時(shí)，選用ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b、EF-2/EF-1、LR5/LR0R、gpd1/gpd2 和CHS79-F/ CHS354-R為引物，以ST4（ST4-1、ST4-2 和ST4-3）全基因組為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別獲得552、443、565、903、638、299 bp 的ITS、TUB2、TEF1、LSU、GAPDH、CHS1序列片段（圖4）；經(jīng)過(guò)測(cè)序和在NCBI BLAST 后發(fā)現(xiàn)，ST4（ITS：MZ645939）與果生刺盤(pán)孢菌（C.fructicola）MSCJ06 的同源性最高，初步確定ST4 屬于果生刺盤(pán)孢菌（C.fructicola）。

圖4 ITS 及其他相關(guān)基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.4 Electrophoregram of the PCR product of ITS and other related genes

2.4 病原菌ST2 的進(jìn)化樹(shù)建立

在對(duì)ST2-1、ST2-2 和ST2-3 進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一個(gè)基因在3 個(gè)菌株中擴(kuò)增得到序列相似性均達(dá)到99%以上。因此，我們僅上傳基于ST2-1 獲得的ITS（OM698365）、ACT（OM746167）、CHS1（OM746166）和CAL（OM746165）序列。然后基于ACT和CHS1基因序列并采用最大自然法構(gòu)建ST2-1 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果（表2、圖5）表明：ST2-1 與暹羅刺盤(pán)孢菌（C.siamense）的遺傳距離最近，聚為一類(lèi)；與隱秘刺盤(pán)孢（C.aenigma）和山茶刺盤(pán)孢（C.camelliae）的遺傳距離最遠(yuǎn)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及分子鑒定結(jié)果，確定引起沙田檸檬炭疽病的病原菌ST2-1 為暹羅刺盤(pán)孢菌（C.siamense）。

圖5 基于ACT 和CHS1 序列以最大自然法建立ST2-1 和ST3-1 及其近緣屬種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of the ST2-1,ST3-1 and their relative strains based on ACT and CHS1 sequences with the maximum natural method

表2 供試參考炭疽菌菌株及其GenBank 登錄號(hào)Table 2 Reference isolates of Colletotrichum used in this study and their GenBank accession No.

2.5 病原菌ST3 的進(jìn)化樹(shù)建立

在 對(duì)ST3-1、ST3-2 和ST3-3 進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一個(gè)基因在3 個(gè)菌株中擴(kuò)增得到序列相似性均達(dá)到100%。因此，我們僅上傳基于ST3-1 獲得的ITS（MZ646051）、ACT（OK086976）、CHS1（OK086977）和TUB（OK086977）序列。然后基于ACT和CHS1序列并采用最大自然法構(gòu)建ST3-1 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明：ST3-1 與蘭花刺盤(pán)孢（C.cliviicola）的遺傳距離最近，聚為一類(lèi)；與果生刺盤(pán)孢菌（C.fructicola）和暹羅刺盤(pán)孢菌（C.siamense）的遺傳距離最遠(yuǎn)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及分子鑒定結(jié)果，確定引起沙田檸檬炭疽病的病原菌ST3-1 為蘭花刺盤(pán)孢菌（C.cliviicola）（表2、圖5）。

2.6 病原菌ST4 的進(jìn)化樹(shù)建立

在對(duì)ST4-1、ST4-2 和ST4-3 進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一個(gè)基因在3 個(gè)菌株中擴(kuò)增得到序列相似性均達(dá)到99%。因此我們僅上傳基于ST4-1 獲得的ITS（MZ645939）、LSU（OK638977）、CHS1（OK667073）、GAPDH（OK667072）和TUB2（OK667071）序列。然后基于GAPDH和CHS1序列并采用最大自然法構(gòu)建ST4-1 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果（圖6）表明：ST4-1 與果生刺盤(pán)孢菌（C.fructicola）的遺傳距離最近，聚為一類(lèi)；與喀斯特炭疽菌（C.karsti）的遺傳距離最遠(yuǎn)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及分子鑒定結(jié)果，確定引起沙田檸檬炭疽病的病原菌ST4-1 為果生刺盤(pán)孢菌（C.fructicola）。

圖6 基于GAPDH 和CHS1 序列以最大自然法建立ST4-1 及其近緣屬種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of the ST4-1 and its relative strains based on GAPDH and CHS1 sequences with the maximum natural method

3 討論

炭疽病在柑橘類(lèi)水果的生長(zhǎng)期和采后期均能夠造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，引起廣東省各柑橘產(chǎn)地炭疽病的病原菌主要為盤(pán)長(zhǎng)孢狀刺盤(pán) 孢（Colletotrichum gloeosporioidesPenz.）。2007 年，盤(pán)長(zhǎng)孢狀刺盤(pán)孢曾在廣東省德慶官圩鎮(zhèn)和馬圩鎮(zhèn)貢柑上引起大面積的炭疽病，僅當(dāng)年的果園損失就高達(dá)2 000 多萬(wàn)元［18］；而后關(guān)于不同炭疽菌小種引起炭疽病的研究也逐漸有報(bào)道，如暹羅刺盤(pán)孢菌（C.siamense）和毛豆炭疽病菌（C.truncatum）能夠分別在肇慶十月桔和龍門(mén)市年橘上引起柑橘炭疽?。?9-20］。目前在廣東還沒(méi)有果生刺盤(pán)孢菌（C.fructicola）在柑橘上引起病害的報(bào)道，而果生刺盤(pán)孢菌能夠在湖南常德石門(mén)甜橙上引起炭疽病。與盤(pán)長(zhǎng)孢狀刺盤(pán)孢相似，該病原菌侵染柑橘果實(shí)，最初可在果實(shí)上造成小而褐色的病斑，隨后病斑會(huì)發(fā)展為各種形狀的大病斑，最后造成果實(shí)腐爛和脫落［4］。

本文從發(fā)病檸檬果實(shí)上分離得到的暹羅刺盤(pán)孢菌引起的病癥與以往報(bào)道的炭疽病在柑橘類(lèi)果實(shí)上引起的病癥截然不同，僅為白色片狀斑點(diǎn)不深入果皮；該病害僅影響沙田檸檬果實(shí)的外觀，不透過(guò)果皮，對(duì)檸檬的品質(zhì)沒(méi)有明顯影響；但在室內(nèi)接種試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，暹羅刺盤(pán)孢菌僅可通過(guò)傷口在果實(shí)上產(chǎn)生危害，由此推斷該病害的侵入有可能與物理傷口或昆蟲(chóng)的危害有關(guān)；對(duì)該類(lèi)病原菌引起的炭疽病的防治應(yīng)結(jié)合控蟲(chóng)，從而達(dá)到最優(yōu)的防治效果。而果生刺盤(pán)孢菌能夠在柑橘上引起病害，為廣東省首次報(bào)道。在我國(guó)，除柑橘外，果生刺盤(pán)孢菌還可對(duì)核桃、櫻桃、蛋黃果等的果實(shí)和葉片造成危害［21-23］。此外，有研究表明，蘭花刺盤(pán)孢僅可在我國(guó)的煙草和雜交狼尾草上引起葉斑病和炭疽?。?4-27］，而本研究發(fā)現(xiàn)蘭花刺盤(pán)孢能夠在沙田檸檬上引起炭疽病為國(guó)際上首次報(bào)道。目前對(duì)于炭疽病的防控，主要采用生物防治和化學(xué)防治的方法，不同小種對(duì)同一種藥劑的敏感性也不同［28-29］。因此，明確引起炭疽病的炭疽菌種類(lèi)對(duì)該病的防治至關(guān)重要。

4 結(jié)論

對(duì)沙田檸檬炭疽病病原菌的研究發(fā)現(xiàn)，引起該病害的病原菌為果生刺盤(pán)孢菌（C.fructicola）、暹羅刺盤(pán)孢菌（C.siamense）和蘭花刺盤(pán)孢（C.cliviicola）。通過(guò)致病性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，果生刺盤(pán)孢菌和蘭花刺盤(pán)孢均能夠在沙田檸檬葉片上引起炭疽病，而暹羅刺盤(pán)孢菌則可以在檸檬的果實(shí)和葉片上引起病害；但從田間沙田檸檬病葉片上僅能夠分離獲得果生刺盤(pán)孢菌和蘭花刺盤(pán)孢，而果實(shí)上也僅能夠獲得暹羅刺盤(pán)孢菌。通過(guò)對(duì)3 個(gè)不同炭疽屬病原菌的分子生物學(xué)鑒定和進(jìn)化樹(shù)建立表明，除ITS 外，鈣調(diào)蛋白（CAL）、肌動(dòng)蛋白（ACT）和幾丁質(zhì)合成酶（CHS1）可以穩(wěn)定應(yīng)用于炭疽菌屬真菌不同小種之間的鑒定。在對(duì)沙田檸檬炭疽病的防治上，要科學(xué)用藥，兼顧到不同的病原菌。但是關(guān)于果生刺盤(pán)孢菌、暹羅刺盤(pán)孢菌和蘭花刺盤(pán)孢菌在沙田檸檬上的致病機(jī)理及侵染途徑仍需進(jìn)一步深入研究。