環(huán)境中毒死蜱的酶聯免疫分析方法研究

魏茂瓊，蘭珊珊，王 麗，林 昕，張玉玲，劉宏程

（1.云南省農業(yè)科學院質量標準與檢測技術研究所，云南 昆明 650222；2.農業(yè)農村部農產品質量安全風險評估實驗室（昆明），云南 昆明 650223；3.大理州煙草公司祥云縣分公司芮家煙站，云南 大理 672100）

【研究意義】環(huán)境中殘留的農藥直接影響人體健康［1］。有機磷農藥使用量大［2-3］，且毒性強，是環(huán)境中殘留農藥檢出較高的農藥之一［4］。毒死蜱，即O,O－二乙基-O-（3,5,6-三氯-2-吡啶基）硫代磷酸酯，又名氯吡硫磷，是一種中等毒性的有機磷農藥。由于毒死蜱廣泛使用及具有較好的穩(wěn)定性，因此在很多國家和地區(qū)的環(huán)境介質中均已檢測到其殘留［3］，可見，快速檢測毒死蜱對保障人類身體健康非常重要?！厩叭搜芯窟M展】土壤是毒死蜱的主要環(huán)境介質［5］，在土壤中毒死蜱可以發(fā)生吸附作用及光降解、微生物降解等作用。土壤中毒死蜱的半衰期為6.3 h 至100 d，半衰期期間帶來了毒死蜱在環(huán)境中的積累。農藥在田間施用后約10%作用于作物，80%～90%將進入土壤。曾阿瑩等［6］研究了我國福州某蔬菜基地43 個土壤樣品中有機磷類農藥殘留，檢測結果顯示，毒死蜱的最大殘留量為9.77 mg/kg，檢出率高達97.7%。在美洲附近的海洋沉積物，甚至在北極圈土壤樣品中均檢出毒死蜱［7-8］。毒死蜱可通過地表徑流或田面主動排水進入河流湖泊，從而造成水體污染。調查發(fā)現，太湖水體的毒死蜱質量濃度區(qū)間為nd（未檢出）～13.6 μg/L，平均值達4.8 μg/L［9］。我國《生活飲用水衛(wèi)生標準》（GB5749-2006）規(guī)定毒死蜱的限值是0.03 mg/L。目前，毒死蜱農藥的檢測方法主要有色譜法［10-11］、色譜-質譜聯用法［12］、光譜分析法［13］、電化學法［14-15］、免疫分析法［16-17］和酶抑制法［18］等。這些檢測方法存在一些缺點，如色譜法儀器成本高、操作復雜、對專業(yè)人員要求高、檢測周期長、前處理復雜等［19］，不能應對田間地頭等檢測場景；光譜分析法雖然操作簡單，但儀器設備昂貴；電化學法檢測靈敏快速，但檢測物中的氨基酸、蛋白質等成分會干擾農藥檢測效果［20］?！颈狙芯壳腥朦c】酶聯免疫吸附法（ELISA）以血清和抗原的特異性結合為基礎，方法靈敏度高、反應時間短、專一性強，對檢測人員專業(yè)性和環(huán)境的要求不高，檢測裝置價格低，更加適合現場大量樣品的篩查?！緮M解決的關鍵問題】本研究采用ELISA 方法快速檢測環(huán)境中的毒死蜱，從靈敏度、交叉反應及有機溶劑對抗體的影響等方面研究建立間接競爭ELISA 酶聯免疫檢測法。通過快速檢測方法實現對土壤、水體等基質中毒死蜱殘留的現場監(jiān)測，保障環(huán)境質量安全，為環(huán)保部門提供一種低成本、快速簡便的分析方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甲醇（色譜純，德國Merck 公司），96 孔板（Costar 公司），TMB 雙組份顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），活性炭（DIKMA 公司），毒死蜱抗原、毒死蜱抗體（深圳市科捷實業(yè)發(fā)展有限公司），羊抗鼠IgG-HRP（Biosharp 公司），毒死蜱標準品（農業(yè)農村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，100 μg/mL），無水醋酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、無水硫酸鈉、氯化鈉、硫酸、吐溫-20、乙酸乙酯、二氯甲烷、二甲基亞砜、乙酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。標準溶液配制：用無水甲醇溶解毒死蜱原藥，配制成1 000 mg/L 儲備液，用PBS 緩沖液稀釋成1 000、500、100、10、5、1 μg/L 的梯度工作溶液。

主要儀器設備：PL-9602G 酶標儀（北京普朗新技術有限公司），QY-300 電動勻漿機（江蘇江陰周莊科研器械廠），N-EVAP 氮吹儀（Organomation 公司），DNP-9162 型恒溫箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

土壤樣品采集布點、采樣要求依據《土壤環(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范》（HJ/T166），采集樣品后密封、避光，可于冷凍條件下保存40 d。除去樣品中的異物（枝棒、葉片、石子等）后完全混勻，過孔徑250 μm 篩備用。地下水的采集及保存參考《地下水質分析方法 第2 部分：水樣的采集和保存》（DZ/T0064.2-2021），飲用水的采集及保存參考《生活飲用水標準檢驗方法 水樣的采集和保存》（GB/T5750.2 -2006）。采集的水樣保存于4℃冰箱中，存儲時間在3 d 以內。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品中毒死蜱的提?。?）土樣中毒死蜱的提?。和翗訛槲次廴镜氖卟颂锿寥?。樣品前處理與檢測供試土壤為潮土，供試土壤中毒死蜱未檢出。稱取土壤樣品15 g，置于250 mL 錐形瓶中，加入50 mL 乙酸乙酯-乙酸混合液（體積比99 ∶1），振蕩1 h，收集上清液于250 mL 錐形瓶中，加入20% NaCl 溶液20 mL，振蕩10 min，靜置30 min 后取上層有機相，使用無水硫酸鈉脫水并濃縮至10 mL，濃縮液置于50 mL 離心管中并加入40 mg 活性炭。振蕩一定時間，用濾紙過濾、濃縮至近干，用含有5%甲醇的PBS溶液定容至2.0 mL，備用。

（2）水樣中毒死蜱的提?。喝∷畼?00 mL于500 mL 分液漏斗中，加入二氯甲烷30 mL，振蕩提取3 min。靜置分層，取下層提取液用無水硫酸鈉玻璃漏斗過濾，收集。重復上述提取步驟，合并兩次萃取液。將二氯甲烷萃取液置于旋轉蒸發(fā)器中40 ℃水浴蒸發(fā)至近干，用含有5%甲醇的PBS 溶液定容至2.0 mL，備用。

1.2.2 ELISA 操作 采用間接競爭酶聯免疫方法檢測。將包被抗原稀釋，加100 μL/孔，4 ℃冷藏過 夜；洗 滌3 次，250 μL/ 孔（下 同），加入封閉液200 μL/ 孔，37 ℃恒溫放置2 h；洗滌，加稀釋好的不同梯度毒死蜱工 作溶液（待測樣本液）50 μL/ 孔，加一定稀釋倍數的抗血清50 μL/ 孔，37 ℃反應1 h；洗滌，加入稀釋的酶標二抗100 μL/孔，37 ℃放置30 min；洗滌，加入顯色液100 μL/孔，室溫避光顯色10 min；加50 μL/孔終止液，測定OD450nm吸光值。加樣孔（加有競爭物）測得的OD450nm值（B）與空白孔（不加競爭物）測得的OD450nm值（B0）之間的比值即為結合率。

1.3 試驗條件優(yōu)化

1.3.1 抗原、抗體最適工作濃度 用方陣試驗法優(yōu)化抗原、抗體最適工作濃度。包被抗原用pH9.6 的碳酸鹽緩沖液稀釋成不同質量濃度，包被于酶標板，同一個包被質量濃度對應不同的一抗質量濃度，每個處理3 次重復。

1.3.2 最佳包被條件 包被抗原吸附于酶標板的穩(wěn)定程度與時間、溫度有關，時間增加和溫度升高在一定區(qū)間內能增加固定效果。但若過長時間的高溫孵育會造成蛋白變性，可能降低包被抗原的固定效果。雖然低溫不利于包被原與酶標板之間的固定效果，但低溫下延長包被時間，既不影響蛋白活性，又可以增加固定效果。本試驗選擇了4、25（室溫）、37、43 ℃共4 個溫度條件，其中4 ℃包被時間要長，設12、24 h；室溫下包被1、2、4 h；37℃包被 l、2、3 h；43 ℃包被 l、2、3 h。用ELISA 法檢測后測定 OD450nm值，以最高OD450nm值的包被條件作為最佳包被溫度和時間。

1.3.3 最佳封閉時間及競爭反應時間 為了減少非特異性，封閉中的蛋白會非特異性將ELISA 板中沒有結合包被物的位點封閉，這樣后續(xù)加入的抗原或抗體就不會再與ELISA 板發(fā)生非特異性結合，使ELISA 結果更加準確。因此選擇37℃下加入BSA 溶液，封閉30 min、1 h、2 h，經過間接競爭ELISA 法操作，確定最佳封閉時間。競爭反應時間控制為5、15、30、45、60 min 等5 個梯度，測定OD450nm值。

1.3.4 有機溶劑最佳濃度 一抗加入前，添加含有不同體積分數甲醇的PBS 溶液于已包被的酶標板中，對照添加純的PBS 溶液，計算抑制率，通過抑制率分析不同甲醇體積分數對結合反應的影響程度。

式中，ODmax為無甲醇時的吸光度值，ODx為加入甲醇時的吸光度值，ODmin為空白對照孔的吸光度值。

1.3.5 酶標二抗最佳濃度 將抗原、抗體按照最佳稀釋度進行ELISA 操作，酶標二抗用PBS 緩沖液稀釋成不同比例（1∶4 000、1 ∶8 000、1 ∶16 000、1 ∶32 000、1 ∶64 000、1 ∶128 000)。反應結束后通過多功能酶標儀讀取OD450nm，選取吸光度值在1.0 左右的稀釋度為最佳濃度。

1.4 方法的準確性與精密度試驗

1.4.1 標準曲線建立、靈敏度及線性范圍確定 在上述優(yōu)化工作條件的基礎上，按照ELISA方法進行操作，建立該方法的標準曲線。經過線性擬合得出該方法的標準曲線及檢測限（靈敏度）和線性范圍。

1.4.2 添加回收試驗 將毒死蜱標準品分別添加到3 種土壤、3 種水樣中，使毒死蜱最終質量濃度在土壤中為10、100、1 000 μg/kg。用建立的方法和LC-MS/MS 測定樣品中的毒死蜱質量濃度，計算回收率和變異系數。

1.4.3 精密度測定 由兩個試驗人員使用相同的儀器設備，在1 d 內向土壤、水、蔬菜中添加100 μg/L 標樣并測定3 次。由相同試驗人員使用相同的試劑盒，在添加農藥的當天及第1、3、5、7 天，通過向3 種土壤、3 種水樣中添加100 μg/L標樣并測定3 次。

1.4.4 特異性測定 對5 種毒死蜱的類似結構化合物（甲基毒死蜱、2-羥基-3,4,6-三氯-吡啶、殺螟硫磷、對硫磷、馬拉硫磷）進行試驗，以明確本試驗方法的特異性。

1.5 方法的穩(wěn)定性試驗

將同一次配制的抗體及包被了抗原的板分別保存于4 ℃和-20 ℃，于保存0、1、l0、20、30、60、90、120、150、180 d 進行間 接競爭ELISA檢測，OD450nm變化值＜0.05，則檢測結果有效。

2 結果與分析

2.1 試驗條件優(yōu)化結果

2.1.1 抗原、抗體最適工作濃度 以OD450nm值在1.0 附近的數值作為選擇，同時參考抗原、抗體用量相對較少的質量濃度組合，作為抗原、抗體的最優(yōu)工作質量濃度。根據試驗結果（表1），確定包被抗原質量濃度為3.56 mg/L，抗血清（抗體）的稀釋倍數為3 200 倍。在進行實際樣本測定時，樣品前處理的提取液可能會影響ELISA 測定結果。

表1 抗原、抗體最適工作濃度優(yōu)化結果（OD450mm）Table 1 Optimized working concentrations of antigen and antibody (OD450mm)

2.1.2 最佳包被條件 采用ELISA 法測定 OD450nm值，選擇最高OD450nm值的包被條件作為最佳包被溫度和時間。其中，4 ℃下包被12 h 的OD450nm值為1.132，室溫下包被4 h 的OD450nm值為0.936，37 ℃下包被3 h 的OD450nm值為0.985，可見，抗原包被效果最好的是4 ℃下包被12 h。

2.1.3 最佳封閉時間及競爭反應時間 進行封閉處理時，OD450nm值隨著封閉時間的延長先增加后急速降低，這可能因為蛋白在長時間的孵育溫度下發(fā)生變性。吸光度值在封閉1 h 和1.5 h 的吸光度值較高，分別為1.208、1.214，考慮到時間因素，以封閉1 h 較合適?？刂聘偁幏磻獣r間，測定各孔OD450nm值。由圖1 可知，當反應時間超過60 min，OD450nm值基本趨于穩(wěn)定，因此選擇60 min為最佳反應時間。

圖1 競爭反應時間的選擇Fig.1 Selection of competitive reaction times

2.1.4 有機溶劑最佳濃度 結果（表2）顯示，甲醇濃度超過5%時，抗原抗體結合反應發(fā)生明顯的抑制作用，說明過量的甲醇會抑制抗體抗原結合。因此，選擇5%為最佳甲醇濃度。

表2 甲醇濃度對抗原抗體結合反應抑制作用的影響Table 2 Effect of methanol concentration on inhibition of on antigen-antibody binding reaction

2.1.5 酶標二抗最佳濃度 根據抗原最佳包被質量濃度與血清最佳稀釋度的確定結果，反應結束后通過多功能酶標儀讀取OD450nm，選取吸光度值在1.0 左右的稀釋度為最佳質量濃度。當酶標二抗稀釋度為64 000 時，吸光度值為1.089，以該稀釋度為二抗工作質量濃度。

2.2 方法的準確性及精密度

2.2.1 標準曲線及靈敏度 在上述優(yōu)化的體系條件下，將一系列毒死蜱標準溶液進行間接競爭抑制試驗。本方法毒死蜱的標準工作曲線在質量濃度范圍5.0～1 000 μg/L 間均呈良好的線性關系。以結合率B/B0為縱坐標，以不同標準溶液的質量濃度對數為橫坐標，繪制標準曲線（圖2）并進行回歸分析，回歸方程為B/B0=-24.87 logC +97.55，相關系數R2＞0.99，毒死蜱的IC50=81.65 μg/L，檢出限IC20為5.1 μg/L。

圖2 競爭反應時間的選擇Fig.2 Selection of competitive reaction times

2.2.2 樣品添加回收試驗 選擇不含毒死蜱的土壤和水，添加10、100、1 000 μg/L 毒死蜱標準品，經過簡單前處理后進行回收試驗。結果（表3）顯示，采用ELISA 方法測定土壤空白與PBST 空白得到的OD 值無顯著差異，說明基質空白對抗原抗體結合反應不產生干擾，回收率在70%～110%之間，相對偏差在11%以內，符合檢測方法的需求。同樣的樣品經過前處理后，用常規(guī)氣相色譜法進行測定，結果回收率在70%～115%之間，相對偏差在11%以內?？梢姡珽LISA 方法結果準確，操作簡單，適用于土壤、水中毒死蜱的檢測。

表3 樣品添加回收試驗結果Table 3 Recovery test results of samples

2.2.3 精密度分析 由兩個試驗人員使用相同的測定方法，在1 d 內通過向土壤和純凈水中添加100 μg/kg 的標樣，測定3 次。不同人員重復測定土壤和水基質中的毒死蜱，相對偏差為4.04%和2.82%（表4）。從表5 可以看出，不同時間重復性測定不同土壤中毒死蜱的相對標準偏差在3.37%～8.23%之間；不同時間重復性測定不同水質毒死蜱的相對偏差在3.01%～6.59%之間。測試結果均符合檢測方法中對相對偏差的規(guī)定。

表4 兩人測定毒死蜱的重復性試驗結果（n=3）Table 4 Replicated test results of chlorpyrifos determination by two detectors (n=3)

表5 連續(xù)7 d 測定毒死蜱的重復性試驗結果（n=3）Table 5 Repeated test results of chlorpyrifos determination in consecutive 7 days (n=3)

2.2.4 特異性分析 在最佳條件下測定5 種毒死蜱的類似結構物，結果顯示，抗體與甲基毒死蜱的交叉反應率為62.58%，與2-羥基-3,4,6-三氯-吡啶的交叉反應率為11.1%，與殺螟硫磷、對硫磷、馬拉硫磷的交叉反應率分別為0.09%、0.14%、0.05%?？梢姡谆舅莉缗c毒死蜱的抗原決定簇結構相近，而其他農藥不會對該抗體造成太明顯干擾。

2.3 方法的穩(wěn)定性

將同一次配制的抗體及包被了抗原的板分別保存于4 ℃和-20 ℃下，隨著保存時間的增加，間接ELISA 法測定結果（表6）顯示，OD450nm的變化值均小于0.05，因此，在180 d 內試劑盒儲存在4 ℃或-20 ℃下都不影響使用。

表6 方法的穩(wěn)定性結果（OD450mm）Table 6 Stability result of the method (OD450mm)

3 討論

酶聯免疫法具有特異性強、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點，但影響因素也很多，因此需要優(yōu)化反應體系中的各種條件。本研究通過優(yōu)化抗原、抗體及酶標二抗的最適濃度，在用量最少的前提下，選擇OD450nm值在1.0 左右的質量濃度組合，抗體濃度過高會造成浪費及結果不穩(wěn)定，濃度過低則反應結果不準確。由于反應體系涉及到蛋白，因此體系反應時間很關鍵，本試驗研究了封閉時間及競爭時間，吸光度值隨著時間的延長先增加后急速降低，這可能是因為蛋白在長時間的孵育溫度下發(fā)生變性，因此選取封閉時間和反應時間均為1 h。樣品提取液中的有機溶劑會影響抗原抗體的結合率，試驗發(fā)現樣品提取液中甲醇體積分數增加，抗原抗體結合反應沒有明顯被抑制，但甲醇體積分數超過5%，抗原抗體結合反應發(fā)生了明顯的抑制作用，這與魏松紅等［21］的研究結果一致。OD450nm在5%體積分數時取得最大值，說明過量的甲醇會降低抗體和包被抗原的結合率，使吸光度降低。TMB 與辣根過氧化物酶的濃度及反應時間對檢測也有影響，后續(xù)試驗將對顯色方面的試劑濃度及反應時間進行研究。

土壤及水等不同基質存在的干擾物質有所差異，需要根據基質間的差異選擇不同的提取方法進行毒死蜱的提取，才能更準確地檢測樣品中的實際農藥含量［22-23］。張超等［24］研究水、土壤中毒死蜱的提取方法，認為水樣采用石油醚提取、土壤采用乙酸乙酯-石油醚提取并凈化為佳。本試驗前期對土壤及水中毒死蜱農藥的提取進行了方法摸索，選擇相對簡單快捷的前處理方法與酶聯免疫法結合，本試驗方法的建立適合黃壤、棕壤、黃棕壤，純凈水、自來水、河水等環(huán)境樣品的毒死蜱檢測。毒死蜱的結構類似物不會干擾檢測體系，保障了方法的特異性；通過保存條件的研究明確了方法的穩(wěn)定性；通過回收試驗、不同人員操作及靈敏度試驗確定方法的精密度。

4 結論

本試驗酶優(yōu)化了可快速檢測環(huán)境中毒死蜱的間接競爭ELISA 試驗條件，選擇甲醇含量5%的PBS 提取液提取環(huán)境樣品，在最佳反應條件（包被抗原質量濃度為3.56 mg/L，抗血清（抗體）的稀釋倍數為3 200 倍，抗原包被效果最好的是4 ℃下包被12 h、封閉1 h，酶標二抗稀釋度為64 000）基礎上，建立了毒死蜱的標準曲線，毒死蜱質量濃度對數與吸光度值成線性關系，回歸方程為B/B0=-24.87 logC+97.55，相關系數R2＞0.99，毒死蜱的IC50=81.65 μg/L，檢出限IC20為5.1 μg/L。本試驗建立的間接競爭ELISA 法具有一定的特異性、穩(wěn)定性和精確性，可應用于檢測不同類型的土壤及水樣中的毒死蜱，能夠實現快速、靈敏的毒死蜱農藥殘留檢測。