王小娟，劉 慧，王良瑄，吳文晞，趙 峰*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建恒正檢測技術(shù)有限公司，福建 福州 350199；3.福建省中藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

白茶屬于微發(fā)酵茶，是中國六大茶類之一，其不經(jīng)殺青與揉捻，具有外形芽毫完整，滿身披毫，滋味清甜回甘等特點(diǎn)。白茶主產(chǎn)于福建福鼎、政和、松溪等地［1］，可分為白毫銀針、白牡丹、壽眉、貢眉四個(gè)品類［2］。白茶的藥性價(jià)值好，具有解酒醒酒、清熱潤肺、平肝益血、消炎解毒、降壓減脂、消除疲勞等功效［3］。

目前對于白茶功效性成分研究多集中于茶多酚，咖啡堿以及多糖等物質(zhì)。寡肽是一種小分子量的蛋白質(zhì)，是由2～10個(gè)氨基酸連接而成，分子量在2000 Da以內(nèi)?，F(xiàn)代研究表明，寡肽具有易吸收的特點(diǎn)，而且不同氨基酸序列的寡肽具備潛在的抗氧化、降血壓、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等作用［4-8］。近年的研究顯示，白茶加工過程中長時(shí)間的萎凋有利于茶葉蛋白質(zhì)的降解和寡肽的富集［9］。最新的研究顯示，白茶中寡肽含量達(dá)6%～8%，超過游離氨基酸總量，高于其他參試茶類（紅茶、綠茶、黃茶和烏龍茶）［9,10］。但目前尚未見任何對白茶寡肽活性的實(shí)驗(yàn)性研究。本研究旨在通過白茶寡肽的制備、測序和抗氧化活性研究，進(jìn)一步了解白茶寡肽對白茶保健功效貢獻(xiàn)的作用，以期為寡肽活性的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，也為將來相關(guān)功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白茶（一級白牡丹，福建政和，2021年5月產(chǎn)，購自福州水木年茶文化傳播有限公司）；無水乙醇、硫酸亞鐵、過氧化氫、叔丁基過氧化氫（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；3,5-二硝基水楊酸、Western及IP細(xì)胞裂解液（分析純，上海源葉生物技術(shù)有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；胎牛血清［依科賽生物科技（太倉）有限公司］；0.25%胰酶、雙抗（博士德生物工程有限公司）；蛋白濃度（BCA）測定試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（南京建成生物研究工程所）；正戊烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀、二甲基亞砜（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）。

電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HY-2漩渦混勻儀（上海儀分科學(xué)儀器有限公司）；P5型紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；BHS系列水浴鍋（寧波群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；分液漏斗振蕩器（上海佳邦電子有限公司）；CO2培養(yǎng)箱［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；多功能微孔板酶標(biāo)儀［帝肯（上海）貿(mào)易有限公司］；FD-1C-50型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；FlowMem0021-HP三聯(lián)高壓平板膜（廈門福美科技有限公司）。

1.2 白茶寡肽制備

參照 MATHIAS S［11］和劉慧［12］的方法，制備白茶寡肽。具體步驟如下：白茶粉碎后，以300 mL正戊烷分5次浸泡脫脂，300 mL無水乙醇分5次回流提?。ò被峒肮央目扇苡谝掖?，而多糖、高分子量水溶性蛋白質(zhì)則不溶），合并提取液，濾液40℃下真空旋蒸后，以100 mL純水轉(zhuǎn)溶，再依次分別使用二氯甲烷，乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丁酯進(jìn)行液液萃取（每種溶劑萃取5次，每次200 mL），取水相，40℃下旋蒸去除殘余有機(jī)溶劑后，冷凍干燥，以500 Da超濾膜濃縮后，取截留物（即＞500 Da）凍干后得白茶寡肽，-20℃保存。

1.3 白茶寡肽純度檢驗(yàn)

定量測定白茶寡肽中茶多酚、咖啡堿、游離氨基酸總量和總糖，檢驗(yàn)其純度。具體步驟為：稱取10 mg白茶寡肽，超純水溶解后定容至100 mL；取適量，按照GB/T 8313-2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》、GB/T 8312-2013《茶 咖啡堿測定》、GB/T 8314-2013《茶 游離氨基酸總量的測定》和3,5-二硝基水楊酸（DNS）［13］比色法測定總糖。

1.4 白茶寡肽高通量測序

按照ZHAO F等的方法［9,10］對寡肽進(jìn)行測序。

前處理方法：稱取白茶寡肽0.1 g（精確到0.001 g）于50 mL離心管，加入15 mL 50%（v/v）甲醇，渦旋，放入70℃水浴鍋中15 min，取出，冷卻至室溫，過0.22 μm濾膜，使用Q-Exactive超高壓液相色譜-四極軌道超高分辨質(zhì)譜（Thermo Scientific，USA）鑒定白茶寡肽中的肽段種類。

液相色譜條件：Acquity UPLC CSH C18柱（內(nèi)徑2.1×100 mm，粒徑1.7 μm）；流動相由流動相A［Milli-Q水（含0.2%甲酸）］和流動B［乙腈（含0.2%甲酸）］組成；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：30℃；樣品進(jìn)樣量：10.0 μL；洗脫梯度為：0-5 min 98%A；5-30 min 98%A→ 80%A，30-60 min 80%A→20%A，60-90 min 20%A→5%A，90-95 min 5%A 和 95.1-105 min 98%A。

質(zhì)譜條件：正離子模式；MS/top10 dd-ms2；一級質(zhì)譜分辨率70000；二級質(zhì)譜分辨率，17500；噴霧電壓3.50 kv；毛細(xì)管溫度320℃；輔助氣體加熱器溫度411℃；鞘層氣體流速（N2）40 L·h-1；輔助氣體流速（N2）15 L·h-1。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Xcalibur 2.2 SP2 軟件（Thermo Scientific，USA）采集；寡肽序列拼接，由蛋白質(zhì)組學(xué)軟件Peaks Studio 8.5（Bioinformatics Solutions,Canada）通過一級母離子精確分子量及對應(yīng)二級碎片的a離子，b離子，y離子等的解析完成；茶樹蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫：Tea tree protein.fasta［14］；一級母離子允許偏差，15 ppm；二級碎片離子允許偏差，0.02 Da；肽段篩選，按照ALC（平均置信度）分值≥90且-10logP≥20。

1.5 鑒定肽段活性預(yù)測及溶解性評估

根據(jù)文獻(xiàn)［15］，按照表1標(biāo)準(zhǔn)對所鑒定寡肽活性的抗氧化活性進(jìn)行評分預(yù)測。使用網(wǎng)站工具（http://www.chinapeptides.com/tool.aspx）檢索所鑒定肽段的親水殘基占比和平均親水性，從而評估其溶解性。

表1 抗氧化活性預(yù)測評分規(guī)則Table 1 Guidelines for scoring predicted antioxidant activity

1.6 體外抗氧化能力評價(jià)

1.6.1 DPPH自由基清除能力

參照鄭景如等［16,17］以及劉慧等［17］的方法并略作改進(jìn)，在室溫條件下，向96孔板中逐一加100 μL 0.6 mmol·L-1的DPPH甲醇溶液后，再分別加入100 μL樣液，100 μL甲醇，100 μL DPPH溶液，混勻后，在暗處反應(yīng)30 min，于517 nm波長下測定吸光度（A）。以還原性谷胱甘肽溶液（同等濃度）做對照、純水作空白，根據(jù)公式（1）計(jì)算DPPH自由基清除能力，根據(jù)公式（2）計(jì)算樣品的抗氧化能力（AO值）。每個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

注：IC50（樣品）為樣品的半抑制濃度（半數(shù)清除率）；IC50（谷胱甘肽）為谷胱甘肽的半抑制濃度。

1.6.2 羥自由基清除能力

參照XU Y等［18］的方法并略作改進(jìn)，在10 mL試管中依次加入1 mL 6 mmol·L-1FeSO4溶液、1 mL不同濃度的樣品溶液、1 mL 6 mmol·L-1H2O2溶液，啟動反應(yīng)，于室溫中靜置10 min，再加入1 mL 6 mmol·L-1水楊酸溶液作為捕獲劑，室溫靜置30 min，取200 μL上清液于96孔板中，用酶標(biāo)儀在510 nm波長下測定吸光度。陽性對照組用還原性谷胱甘肽（同等濃度）代替樣品，空白組用超純水代替H2O2，對照組用水代替樣品，根據(jù)公式測定清除羥自由基能力。每個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.6.3 總還原力

參照LU C等［19］的方法并略作改進(jìn)，在10 mL離心管中依次加入0.5 mL不同濃度的樣品溶液，0.5 mL磷酸緩沖溶液（0.2 mol·L-1，pH 6.6），2.5 mL 1%的鐵氰化鉀，于50℃水浴20 min，再加入0.5 mL 10%的三氯乙酸，3000 r·min-1離心10 min。取100 μL上清液與70 μL超純水以及70 μL 0.1%三氯化鐵于96孔板中，室溫反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀在700 nm波長下測定吸光度。陽性對照組用還原性谷胱甘肽（同等濃度）代替樣品，空白組用超純水代替樣品，根據(jù)公式測定總還原力。每個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

總還原力＝A樣品-A空白

1.7 細(xì)胞抗氧化能力評價(jià)

1.7.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2細(xì)胞于37℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行復(fù)蘇，加入一定量的培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)基＋10%胎牛血清＋1%雙抗），1200 r·m-1離心3 min，隨后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長至80%～90%時(shí)，以1∶3進(jìn)行傳代。

1.7.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

參照張燕［20］等方法并略作改進(jìn)，將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于96孔板中，每個(gè)孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)約5×104個(gè)，向每孔中加入100 μL培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，向每孔中加入100 μL用培養(yǎng)基配制的不同濃度的白茶寡肽溶液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，向每孔加入100 μL濃度為1 mg·mL-1的噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）溶液，培養(yǎng)4 h，吸出MTT溶液，向每孔加入200 μL DMSO溶液，震蕩10 min，在490 nm波長下測定吸光度，空白組不加細(xì)胞，對照組用培養(yǎng)基替代樣品，重復(fù)以上操作，并按照以下公式測定細(xì)胞存活率：

1.7.3 氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的建立

參照CHANG X［21］等的方法并略作修改，選擇不同濃度的H2O2對于HepG2細(xì)胞處理4 h，以細(xì)胞存活率為指標(biāo)，選擇細(xì)胞存活率為60%的H2O2濃度作為誘導(dǎo)條件，細(xì)胞存活率采用MTT測定法。

1.7.4 HepG2細(xì)胞中SOD活性的測定

參照SOD試劑盒說明書，向上述的96孔板中加入一定量的細(xì)胞裂解液，用微量移液器吸出待測。另取一96孔板，分別加入20 μL待測樣本，20 μL酶工作液以及200 μL底物應(yīng)用液。混勻，37℃孵育20 min，450 nm處酶標(biāo)儀測定。對照組用蒸餾水代替待測樣本，對照空白組用蒸餾水代替待測樣本，酶稀釋液代替酶工作液，每個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.8 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，采用Excel 2019和SPSS 25.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析及單因素方法分析，以O(shè)rigin 2021進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白茶寡肽純度

白茶寡肽的得率為3%，純度檢驗(yàn)結(jié)果顯示，茶多酚含量＜0.9 mg·g-1，咖啡堿含量＜1.5 mg·g-1，游離氨基酸含量＜1.5 mg·g-1，總糖未檢出（DNS法的檢出限為2.0 mg·g-1）。即，白茶寡肽中茶多酚、咖啡堿、游離氨基酸以及總糖的殘留量均小于0.2%。

2.2 白茶寡肽測序及活性預(yù)測

根據(jù)肽段鑒別標(biāo)準(zhǔn)［平均局部置信區(qū)間（ALC≥90）及-10logP≥20］，從白茶寡肽中共鑒別到44條肽段，其對應(yīng)的質(zhì)譜信號強(qiáng)度、親水殘基占比、平均親水性和抗氧化力預(yù)測值如表2所示。結(jié)果可知，上述寡肽中疏水性基團(tuán)的占比較高，特別是亮氨酸（L）和異亮氨酸（I）的占比較高，表明其潛在較強(qiáng)的抗氧化能力［22,23］。此外，已知規(guī)律顯示，當(dāng)氨基酸序列中含有天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、酪氨酸（Y）以及甘氨酸（G）時(shí)，肽鏈會具有突出的抗氧化潛力。表2的評分結(jié)果顯示，經(jīng)篩選的白茶寡肽氨基酸序列的抗氧化活性評分多處于4.5～5.5分，其中抗氧化評分最高的氨基酸序列為LLILLIIII，為7.5分。

表2 白茶寡肽序列質(zhì)譜信號強(qiáng)度、親水殘基占比、平均親水性和抗氧化力預(yù)測值Table 2 Relevant information on identification of white tea oligopeptides

注：1親水殘基比例指多肽序列中親水性氨基酸殘基數(shù)占總殘基數(shù)的百分比。2平均親水性是根據(jù)多肽序列中各氨基酸殘基以及不同修飾的親/疏水值來得到的。從一條肽的平均親水性值，可以判斷其在水的溶解性如何。

2.3 白茶寡肽鏈長以及分子量分布

對全部鑒定到的寡肽的鏈長和分子量分布區(qū)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，由圖1可知，全部44條肽中最短的肽為四肽，最長的肽為十三肽。從肽段的數(shù)量和占比上看，以四肽最多，共12條，占比28.6%；其次為九肽，共9條，占比21.4%。從分子量分區(qū)區(qū)間看，所提取的白茶寡肽多集中于300～500 Da區(qū)間，其次為900～1100 Da區(qū)間。

圖1 鑒定肽段構(gòu)成特征分析Fig. 1 Characterization of identified peptides

2.4 白茶寡肽的體外抗氧化能力評價(jià)

2.4.1 DPPH自由基清除能力

DPPH在無水乙醇中呈深紫色，當(dāng)DPPH自由基被清除，其最大吸收波長517 nm處的吸光值隨之減小，可以評價(jià)供試樣品提供電子對能力的強(qiáng)弱，進(jìn)而表征其抗氧化能力［19］。由圖2可知，在0～0.5 mg·mL-1的測試濃度范圍內(nèi)，其對自由基的清除能力呈快速直線上升，至0.5 mg·mL-1時(shí)為最高（達(dá)91.86%），之后隨濃度增加，清除率未見明顯改變。

圖2 白茶寡肽對DPPH自由基的清除能力Fig. 2 DPPH free radical scavenging ability of white tea oligopeptides

白茶寡肽的IC50為0.170 mg·mL-1，谷胱甘肽的IC50為0.126 mg·mL-1，即，白茶寡肽的DPPH自由基清除能力基本接近于谷胱甘肽。根據(jù)GB/T 39100-2020《多肽抗氧化性測定 DPPH和ABTS法》計(jì)算白茶寡肽AO值，得出白茶寡肽的AO值為1.350。

2.4.2 羥自由基清除能力

羥自由基是人體在形成代謝過程中產(chǎn)生最活潑、危害最大的自由基之一，可使氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)遭受氧化性損傷和破壞，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷［24］。圖3顯示，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，白茶寡肽的羥自由基清除能力平穩(wěn)上升，呈現(xiàn)濃度依賴性。當(dāng)寡肽粗提物濃度達(dá)到1.2 mg·mL-1時(shí)，其羥自由基清除能力為54.93%。計(jì)算后可知，白茶寡肽的羥自由基清除能力的IC50為0.850 mg·mL-1，而谷胱甘肽的羥自由基清除能力的IC50為1.816 mg·mL-1，說明白茶寡肽的羥自由基清除活性遠(yuǎn)超谷胱甘肽。

圖3 白茶寡肽對羥自由基的清除能力Fig. 3 Hydroxyl radical scavenging ability of white tea oligopeptides

2.4.3 總還原力

還原力的大小可以表示抗氧化物質(zhì)供給電子的能力，還原能力大的樣品就是很好的電子供體。通過提供電子可使自由基轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的物質(zhì)，進(jìn)而可中斷自由基的連鎖反應(yīng)［25］。利用鐵氰化鉀還原法測定白茶寡肽的總還原力，且還原力與吸光度成正相關(guān)，即吸光度越大，白茶寡肽總還原力越強(qiáng)，抗氧化能力也越強(qiáng)。由圖4得知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，白茶寡肽的總還原力呈現(xiàn)一定的增長趨勢，當(dāng)濃度為500 μg·mL-1時(shí)，吸光度最大（達(dá)1.033），總還原力最強(qiáng)，表明其抗氧化能力也最強(qiáng)。

圖4 白茶寡肽的總還原力Fig. 4 Total reducing power of white tea oligopeptides

2.5 白茶寡肽在細(xì)胞水平的抗氧化能力評價(jià)

2.5.1 白茶寡肽作用于HepG2細(xì)胞的濃度篩選

由圖5可知，白茶寡肽濃度為100～1000 μg·mL-1范圍時(shí)，HepG2細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)了先下降再上升最后下降的趨勢。白茶寡肽濃度為100～800 μg·mL-1的范圍內(nèi)，HepG2細(xì)胞存活率均大于80%，說明白茶寡肽濃度在100～800 μg·mL-1范圍內(nèi)對細(xì)胞無明顯毒性。當(dāng)白茶寡肽濃度為1000 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率為74.47%，細(xì)胞增長受到明顯抑制。因此選用白茶寡肽濃度為100、300、500 μg·mL-1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 不同濃度白茶寡肽對HepG2細(xì)胞的毒性作用Fig. 5 Toxicity of white tea oligopeptides in varied concentrations on HepG2 cells

2.5.2 HepG2氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的建立

由圖6可知，隨著H2O2濃度的不斷上升，細(xì)胞存活率總體趨勢是不斷下降的（P＜0.05）。在一般細(xì)胞模型的藥物篩選中，選擇細(xì)胞存活率為50%～70%的濃度為誘導(dǎo)濃度。當(dāng)H2O2的濃度為500 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞存活率為61.37%。與對照組相比，當(dāng)H2O2的濃度為600 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞存活率僅為40.98%（P＜0.01），存活率顯著下降，H2O2濃度太高可能會對細(xì)胞產(chǎn)生不可逆損傷，因此確定以500 μmol·L-1為誘導(dǎo)濃度，開展后續(xù)試驗(yàn)。

圖6 不同濃度H2O2對HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig. 6 Effects of hydrogen peroxide in varied concentrations on viability of HepG2 cells

2.5.3 白茶寡肽對HepG2氧化應(yīng)激模型的保護(hù)作用

圖7所示是不同濃度白茶寡肽處理后的HepG2細(xì)胞形態(tài)，從形態(tài)角度可以直觀地觀察到H2O2損傷及寡肽的保護(hù)作用。具體地看，圖7-B中正常組細(xì)胞呈梭形狀，排布均一；而圖7-A中模型組細(xì)胞形態(tài)變圓，細(xì)胞間隙變大且有部分細(xì)胞脫落；圖7-C為白茶寡肽100 μg·mL-1給藥組，與模型組相比，其細(xì)胞形態(tài)幾乎一致，但其細(xì)胞間隙變小，且無細(xì)胞脫落現(xiàn)象，表明低濃度白茶寡肽，未能對H2O2誘導(dǎo)HepG2氧化應(yīng)激細(xì)胞模型產(chǎn)生明顯保護(hù)。圖7-D、7-E分別為白茶寡肽300 μg·mL-1和500 μg·mL-1的給藥組，與模型組比較發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)樗笮危挪家仓饾u緊密，表明上述濃度的寡肽，開始對H2O2誘導(dǎo)HepG2氧化應(yīng)激細(xì)胞模型產(chǎn)生明顯的保護(hù)。

圖7 不同濃度白茶寡肽處理經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞形態(tài)Fig. 7 Morphology of HepG2 cells induced by H2O2 and treated with white tea oligopeptides in varied concentrations

SOD是生物體系中抗氧化酶的重要組成部分，其可保護(hù)細(xì)胞、機(jī)體免受氧化損傷。因此，本研究還測定了細(xì)胞體系的SOD酶活性（圖8）?？芍?，與正常組相比，模型組的SOD活力顯著降低（P＜0.05）。即，細(xì)胞在500 μg·mL-1H2O2處理下發(fā)生了氧化損傷。但隨后，伴隨白茶寡肽給藥濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)的SOD活力也開始上升；當(dāng)寡肽濃度為300、500 μg·mL-1時(shí)，與模型組相比，其抗氧化水平呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），且與正常組相比，已不存在顯著性差異（P＞0.05）。表明白茶寡肽對H2O2誘導(dǎo)的HepG2氧化應(yīng)激細(xì)胞模型具有保護(hù)作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性。

圖8 不同濃度白茶寡肽對H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中SOD的影響Fig. 8 Effects of white tea oligopeptides in varied concentrations on SOD activity of H2O2-induced HepG2 cells

3 討論與結(jié)論

近年來，白茶因其有助于人體健康的特性受到人們的關(guān)注。最近的研究表明［26,27］，白茶具有獨(dú)特的抗氧化活性，飲用白茶可以減輕氧化應(yīng)激作用。本研究通過分析白茶寡肽的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，白茶寡肽的氨基酸排布會影響白茶寡肽的抗氧化活性，疏水性氨基酸以及酸性氨基酸能增強(qiáng)白茶寡肽的抗氧化能力。并且通過體外抗氧化評價(jià)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)白茶寡肽的抗氧化能力總體呈現(xiàn)濃度依賴性。

ZHAO F［10］等研究了白茶萎凋過程中寡肽的變化，發(fā)現(xiàn)白茶長時(shí)萎凋有助于寡肽的富集，且鑒定的白茶寡肽多集中于短肽。分子量小的寡肽因?yàn)楸旧硇再|(zhì)使其更易被人體所吸收，能夠直接參與人體代謝活動［28］。白茶寡肽構(gòu)成以低分子量為主，表明其潛在的優(yōu)異抗氧化能力。本研究結(jié)果表明，白茶寡肽有著顯著的抗氧化能力，擁有較強(qiáng)的DPPH自由基清除率以及羥自由基清除率，總還原能力實(shí)驗(yàn)也表明了白茶寡肽具有優(yōu)良的抗氧化能力，并且通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了白茶寡肽的抗氧化能力。

肽的結(jié)構(gòu)特性、電子分布、氫鍵等分子特征都可能影響到肽段的抗氧化活性［29］。GIMENEZ B［30］等報(bào)道了酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）可以通過金屬螯合能力進(jìn)而增強(qiáng)肽的抗氧化能力。ZHU Z［31］等報(bào)道了甘氨酸因其側(cè)鏈擁有一個(gè)氫離子，可以與金屬產(chǎn)生螯合作用，所以可能在抗氧化活性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。TSOPMO A［32］等報(bào)道了酪氨酸結(jié)構(gòu)中含有芳香環(huán)以及額外的-OH，有助于其與金屬離子的螯合作用以及增強(qiáng)自由基清除能力，可能使酪氨酸擁有較強(qiáng)的抗氧化能力。FENG L［33］等研究表明當(dāng)酪氨酸位于肽鏈中的C-端或N-端時(shí)，酪氨酸能夠通過從酚基團(tuán)中提供一個(gè)氫原子，從而使擁有酪氨酸的肽鏈表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。本研究結(jié)果表明，從白茶寡肽中鑒定出的氨基酸序列中存在天冬氨酸、酪氨酸以及甘氨酸時(shí)，肽鏈的抗氧化能力會增強(qiáng)，推測白茶寡肽的抗氧化能力與其氨基酸序列有著密切的關(guān)系。未來可從白茶寡肽的氨基酸構(gòu)成層面上，進(jìn)一步研究白茶寡肽的抗氧化能力。

本研究首次成功制備了白茶寡肽，通過高分辨質(zhì)譜探究了白茶寡肽的構(gòu)成氨基酸序列，并進(jìn)一步通過DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)、羥自由基清除實(shí)驗(yàn)、總還原力實(shí)驗(yàn)和HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激保護(hù)能力實(shí)驗(yàn)，揭示白茶寡肽具備優(yōu)異的抗氧化能力。上述研究結(jié)果將有助于我們從寡肽構(gòu)成的角度進(jìn)一步了解白茶活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)而推動白茶醫(yī)藥和功能性產(chǎn)品的開發(fā)。