高漸飛，周 瑋，楊 艷

(1.貴州科學(xué)院，貴州省山地資源研究所，貴州貴陽 550001；2.貴州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州貴陽 550008；3.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州貴陽 550014)

黑老虎(Kadsuracoccinea)又名冷飯團(tuán)、布福娜、大葉五味子等，為木蘭科(Magnoliaceae)南五味子屬(Kadsuralongipedunculata)植物，分布于貴州、廣西、云南等地。黑老虎是一種重要的中藥材，主要以根入藥，用于治療胃潰瘍、十二指腸潰瘍、急性腸胃炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打腫痛等疾病[1-3]?，F(xiàn)代生物和醫(yī)學(xué)研究表明，黑老虎還具有抗腫瘤、抗人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)、抗炎、保肝、抗氧化等作用[4-7]，從而受到人們廣泛關(guān)注。木脂素類化合物是黑老虎的主要化學(xué)成分之一，被認(rèn)為是主要藥效成分和重要化學(xué)標(biāo)志物。三萜類化合物是從黑老虎分離得到的另一類主要成分，因其結(jié)構(gòu)多樣和新穎逐漸成為研究熱點[8-12]。然而，這兩類主要成分在植株不同部位的分布和積累差異還鮮有報道。廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)通過高通量化學(xué)對生物樣品中代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，已得到廣泛認(rèn)可[13-15]。基于此，本研究對黑老虎葉、莖、根中代謝物進(jìn)行鑒定，并根據(jù)其結(jié)構(gòu)配置進(jìn)行歸類，解析其中的木脂素和萜類化合物在植株不同部位的分布與積累差異，闡明其高度積累和特有成分，為進(jìn)一步研究與挖掘黑老虎的利用價值提供支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與預(yù)處理

黑老虎植株為人工栽培，生長在覆蓋80%遮陽網(wǎng)的塑料大棚，位于貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)下壩鎮(zhèn)普渡村。植株定期修剪管理、長勢良好，栽培6 a，藤蔓已木質(zhì)化。于2020年7月29日，選3株長勢較為接近的植株取樣，用小鏟子輔助刨開土壤，每株剪下2-3條主根及細(xì)根作為根部樣品，2-3條地上約10 cm的主蔓之一為莖，5-6片中下部長勢較好的成熟葉片為葉。分別用10 mL凍存管取3個重復(fù)，分別標(biāo)記為根(KR)、莖(KS)和葉(KL)，迅速置于液氮中，隨后用干冰保存轉(zhuǎn)運至實驗室-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品放置于凍干機(jī)(Scientz-100F，寧波新芝凍干設(shè)備有限公司)中真空冷凍干燥，用研磨儀(MM 400，德國Retsch公司)研磨(30 Hz，1.5 min)至粉末狀。準(zhǔn)確稱取100 mg粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中，每30 min渦旋1次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6次，樣本置于4℃冰箱過夜。在12 000 r/min離心10 min后，吸取上清液，用微孔濾膜(0.22 μm)過濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中，用于高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析。

1.2 色譜質(zhì)譜采集條件

采用UPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)對樣本進(jìn)行物質(zhì)鑒定，液相條件設(shè)置如下。①色譜柱：Agilent SB-C18 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)。②流動相：A相為超純水(加入0.1%的甲酸)，B相為乙腈(加入0.1%的甲酸)。③洗脫梯度：0.00 min B相比例為5%；9.00 min內(nèi)B相比例線性增加到95%，并在95%維持1 min；10.00-11.10 min，B相比例降至5%，并以5%平衡至14 min。④流速為0.35 mL/min，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為4 μL。

利用AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系統(tǒng)(配備ESI Turbo離子噴霧接口)檢測電噴霧離子源(ESI)，由Analyst 1.6.3軟件(AB Sciex)控制運行。ESI操作參數(shù)如下：離子源，渦輪噴霧；源溫度550℃；離子噴霧電壓(IS)分為正離子模式和負(fù)離子模式，分別為5 500 V和-4 500 V；離子源氣體Ⅰ(GSⅠ)、氣體Ⅱ(GSⅡ)和簾氣(CUR)分別設(shè)置為50 psi、60 psi和25.0 psi，參數(shù)設(shè)置為高。

1.3 質(zhì)控樣本

質(zhì)控樣本(Quality Control Samples，QC)由樣本提取物混合制備而成，用于分析樣本在相同處理方法下的重復(fù)性。在儀器分析過程中，每3個檢測分析樣本中插入1個質(zhì)控樣，以監(jiān)測分析過程的穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

基于武漢邁特維爾生物科技有限公司的MVDB V2.0數(shù)據(jù)庫和代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫，根據(jù)二級譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性，采用三重四極質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式(Multi Reaction Monitor，MRM)對代謝物進(jìn)行定量。獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，利用軟件Analyst 1.6.3對物質(zhì)質(zhì)譜峰進(jìn)行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正[16]。

通過對樣本進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，判別黑老虎根、莖、葉各樣本組之間及組內(nèi)木脂素和萜類成分變異度大小。根據(jù)正交偏最小二乘法判別分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA)代謝組數(shù)據(jù)，進(jìn)一步展示各部位間的差異。模型的預(yù)測參數(shù)及解讀參照方賢勝等[15]和Thévenot等[17]所述。基于OPLS-DA結(jié)果，從獲得的多變量分析OPLS-DA模型的變量重要性投影(Variable Importance in Projection，VIP)，選取VIP≥1，fold change≥2和fold change≤0.5的差異代謝物(Differentially Accumulating Metabolites，DAMs)。

2 結(jié)果與分析

2.1 木脂素類成分

黑老虎植株中共鑒定出木脂素類化合物39個，其中葉和莖中各含24個，根中最多，有32個，3個部位含17個相同的木脂素類化合物(表1)。葉中特有2個，分別為7S,8R-蘇式-3′,4,9′-三羥基-3-甲氧基-7,8-二氫苯并呋喃-1′-丙醇基新木脂素-9-O-鼠李糖苷和7R,8S-赤式-3′,4,9,9′-四羥基-3-甲氧基-8-O-4′-新木脂素-7-O-葡萄糖苷。根中特有13個，如日本南五味子木脂素H、五味子木脂素J、五味子木脂素N等，木脂素類化合物種類較豐富。

以代謝物質(zhì)譜峰面積或累計值表示該成分或該類成分的豐度。黑老虎根中木脂素類化合物豐度(114.62×106)遠(yuǎn)高于葉(23.37×106)和莖(25.96×106)，17個相同的木脂素類化合物在葉、莖和根中豐度分別為16.02×106、24.70×106和74.00×106，說明不同部位差異較大。莖中特有成分豐度為1.20×106，根部為36.95×106。由此可見，根部與葉、莖所含的相同成分及特有成分豐度都較高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，根部日本南五味子木脂素G、乙酰表戈米辛R、Kadusurain C、狹葉南五味子素E、異五味子醇乙和五味子醇乙豐度排名靠前，這6個化合物的豐度累計值(97.83×106)占根中木脂素類化合物總量的85.3%；其中日本南五味子木脂素G豐度高達(dá)32.98×106，占總量的28.8%，單個物質(zhì)已超過了葉和莖中木脂素類化合物總豐度。

表1 黑老虎葉、莖、根中木脂素類化合物

續(xù)表

2.2 萜類成分

在黑老虎植株中共鑒定出萜類化合物41個，數(shù)量上以三萜類化合物占主導(dǎo)(表2)。葉和莖中都含36個，根中39個，3個部位含有34個相同的萜類化合物。葉中特有1個萜類成分，為蒲公英萜醇；根中特有4個，分別為馬達(dá)積雪草酸、2α,3β,19α,23-四羥基熊果-12-烯-28-酸、Kadcoccilactone M和Kadcoccilactone A。

黑老虎根部萜類化合物豐度(74.16×106)遠(yuǎn)高于葉(37.06×106)和莖(17.36×106)，不同部位成分差異也較大，但占比最高的均為三萜類化合物。34個相同萜類成分在葉、莖、根中豐度分別為3.696×106、17.33×106和56.87×106，根中特有萜類成分豐度為14.20×106，可見，根與葉、莖相同成分豐度較高，加之特有部分使萜類豐度遠(yuǎn)高于葉和莖。根部豐度最高的為Kadcoccilactone F，其次為Kadcoccilactone A，二者豐度累計值(44.83×106)占根中萜類總量的60.5%，已超過葉和莖中萜類成分總量。此外，南五味子酸D、Kadcoccitone C、Kadcoccilactone N和Kadcoccilactone H在3個部位中豐度都較高。

表2 黑老虎葉、莖、根中萜類成分

續(xù)表

2.3 差異成分分析

2.3.1 PCA結(jié)果分析

PCA得分圖顯示，LC-MS分析所得原始數(shù)據(jù)在PC1、PC2兩種主成分中呈現(xiàn)良好(圖1)。由圖1可知，第1主成分的貢獻(xiàn)率為59.2%，第2主成分的貢獻(xiàn)率為29.0%，2個主成分的貢獻(xiàn)率之和為88.2%，代表這兩個主成分能夠基本反映檢測樣的主要特征信息，各樣本表現(xiàn)出明顯的分離趨勢，表明數(shù)據(jù)處理結(jié)果可信，各樣本組間存在明顯差異。

圖1 樣本PCA得分圖

2.3.2 OPLS-DA結(jié)果分析

OPLS-DA得分結(jié)果顯示，模型具有很好的預(yù)測能力和可靠性，能夠很好地表現(xiàn)各組間木脂素和萜類化合物的變化趨勢。對OPLS-DA模型進(jìn)行200次排列驗證，P<0.005表示模型有意義，可根據(jù)VIP值分析篩選DAMs (表3)。

表3 OPLS-DA模型驗證值

2.3.3 差異代謝物篩選

基于OPLS-DA結(jié)果，根據(jù)DAMs篩選標(biāo)準(zhǔn)，KL與KR之間共篩選出51個DAMs (木脂素36個、萜類15個)，24個木脂素類化合物和9個萜類化合物在根中豐度顯著高于葉，以上調(diào)模式為主導(dǎo)。KS與KR之間有54個DAMs，21個木脂素類化合物和12個萜類化合物在根中豐度顯著高于莖，亦是上調(diào)模式占主導(dǎo)(表4)。

表4 2個對比組中差異代謝物數(shù)量

兩個對比組中差異倍數(shù)排在前12的主要為木脂素類化合物(圖2)。其中，乙酰表戈米辛R、Kadcoc-cilactoneA、異五味子醇乙、狹葉南五味子素Ⅰ在根部豐度顯著上升，而1-羥基松脂醇-1-O-葡萄糖苷、7S,8S-蘇式-3′,4,7,9-四羥基-3-甲氧基-8-O-4′-新木脂素-9′-O-鼠李糖苷、落葉松脂素-4′-O-葡萄糖苷豐度顯著下降。

圖2 差異倍數(shù)最大的12個成分

3 討論

木脂素類化合物被認(rèn)為是黑老虎藥用部位的主要化學(xué)成分、主要藥效成分和重要化學(xué)標(biāo)志物，目前主要從根部(少量于莖中)分離得到[11,12]。代謝組檢測顯示，黑老虎根中含有32個木脂素類化合物，其數(shù)量約是葉和莖的1.3倍，豐度分別約是葉、莖的4.9倍和4.4倍；根部特有木脂素類化合物數(shù)量達(dá)13個，根部與葉、莖所含的相同成分及特有成分豐度均較高。豐度排名前6的木脂素類化合物(4個為根部特有)是根部木脂素豐度最主要的貢獻(xiàn)者，這些化合物及其他豐度較高的木脂素類化合物有多個被證實具有活性作用。例如，日本南五味子木脂素G(豐度最高)具有抗一氧化氮(NO)生成活性[18]；Kadusurain C對4種人腫瘤細(xì)胞(A549、HCT116、HL-60、HepG2)具有抗增殖作用[19]；狹葉南五味子素E對HIV-1有抑制活性[20]。

黑老虎根部萜類化合物數(shù)量略多于莖和葉，其中葉中豐度約為莖的2.1倍，根部豐度約為葉的2.0倍，在數(shù)量和豐度上均以三萜類化合物為主導(dǎo)。三萜類化合物被認(rèn)為是黑老虎的另一類主要成分，近十年已分離得到40余種，成為天然產(chǎn)物的研究熱點之一[11]。本研究鑒定出的豐度較高的三萜類化合物有多個被證實具有生物活性。如Kadcoccinone A-F對6種人類癌癥細(xì)胞系(HL-60、SMMC7721、A-549、MCF-7、SW-480、Hela)具有細(xì)胞毒活性[21]，Kadcotrione A具有抗HIV-1活性，半最大效應(yīng)濃度(EC50)值為47.91 μg/mL[22]，Kadcoccitone B抗HIV活性的EC50值為30.29 μg/mL[23]。

現(xiàn)代研究表明，五味子木脂素類成分是五味子傳統(tǒng)功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，與五味子具有的功能活性一致[12]。黑老虎主要以根入藥，根部木脂素豐度遠(yuǎn)高于莖和葉，其傳統(tǒng)藥用功效可能與上述研究有關(guān)。此外，三萜類化合物作為黑老虎的另一類主要成分，其在根部的豐度也遠(yuǎn)高于莖和葉，是否也是傳統(tǒng)功效的主要物質(zhì)有待進(jìn)一步研究。本研究檢測到的木脂素和萜類化合物只有少數(shù)被報道過，而前期鑒定得到的化合物也只有部分被廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)鑒定出來，可能由于次生代謝物受植物生長微環(huán)境及外界復(fù)雜環(huán)境等綜合影響，今后還需擴(kuò)大測試樣本進(jìn)行比較分析，探究黑老虎化學(xué)成分，為進(jìn)一步明確藥效物質(zhì)、質(zhì)量控制體系建立提供支持。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，黑老虎根部特有木脂素類化合物較多，根部木脂素類化合物數(shù)量遠(yuǎn)多于莖和葉；以三萜類化合物為主導(dǎo)的萜類化合物，在數(shù)量上根部略多于莖和葉；根部與葉、莖相同及特有的木脂素和萜類化合物豐度均較高，使兩類物質(zhì)豐度遠(yuǎn)高于莖和葉。以上研究結(jié)果為黑老虎的綜合利用和開發(fā)提供了參考。