范 瑾, 喬 昀, 程 斌
(1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院檢驗科,上海 200021;2.上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院檢驗科,上海 201266)
目前,臨床對由陰道毛滴蟲引起的滴蟲性陰道炎(trichomonal vaginitis,TV)已有有效的治療方法,但若治療不徹底,極易復發(fā)[1],嚴重影響女性身心健康。TV與胎膜早破、不孕等不良圍產結局有關[2-3],早期有效、徹底地進行治療有較大的臨床意義。本研究擬通過了解已婚育齡TV患者陰道內微生物群組成特征,為TV的臨床診治和預防復發(fā)提供參考。
選取2017年5月—2021年3月在上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院診治的TV患者54例(TV組)。TV診斷標準:陰道分泌物0.9% NaCl溶液懸滴液可見活滴蟲,伴或不伴相應外陰瘙癢、陰道分泌物增多且有異味、下腹痛等臨床癥狀[3]。納入標準:(1)<45歲,平時月經正常,未妊娠;(2)陰道無出血,3 d內無性生活、陰道局部用藥或陰道操作者;(3)2周內未使用抗菌藥物;(4)自愿參加本研究,并簽署知情同意書。排除標準:(1)患自身免疫性疾病等系統性疾??;(2)3個月內口服避孕藥等性激素;(3)臨床資料不全。54例患者中,卵泡期42例、黃體期12例;陰道分泌物清潔度Ⅲ度39例、Ⅳ度15例。另選取同期體檢健康女性64例(健康對照組),年齡27~44歲,平素月經正常,無陰道炎癥表現;其中卵泡期48例、黃體期16例;陰道分泌物清潔度Ⅰ度56例、Ⅱ度8例;排除外陰陰道滴蟲、念珠菌病患者。本研究經上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院倫理委員會審核批準。
1.2.1 婦科常規(guī)檢查 對所有研究對象進行婦科常規(guī)檢查,用無菌棉簽采集其陰道上1/3處分泌物,稀釋后勻涂抹于潔凈的載玻片上,制成陰道分泌物濕片和懸滴片,鏡下觀察是否存在滴蟲、陰道加德納菌、霉菌、念珠菌,并觀察細胞形態(tài)、線索細胞情況,觀察病原菌形態(tài)和活動情況,評估白帶清潔度。陰道分泌物(白帶)清潔度評估標準:微生物以陰道桿菌為主,鏡下可見大量上皮細胞,判定為Ⅰ度;鏡下出現部分陰道桿菌和上皮細胞,判定為Ⅱ度;鏡下膿細胞和雜菌數量多,陰道桿菌和上皮細胞量稀少,判定為Ⅲ度;鏡下幾乎全為膿細胞和大量雜菌,無陰道桿菌,判定為Ⅳ度。
1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR) 收集所有研究對象陰道拭子,采用SYBER Green I Premix Ex Taq Ⅱ熒光定量檢測試劑盒(貨號DRR081A,北京賽百盛公司)提取基因組DNA,-70 ℃冷凍保存。以細菌的保守通用區(qū)序列設計引物作為樣本的內參[4](由上海英俊生物公司合成),參照文獻[4]報道的21種陰道常見細菌的特異引物序列合成特異性引物,采用美國ABI公司7500 Fast儀進行RT-qPCR擴增,嚴格按說明書要求進行操作。
1.2.3 菌群密集度分級 菌群密集度主要通過細菌分布和排列情況直接判斷并分級[5]。將所有研究對象陰道分泌物樣本均勻涂片并革蘭染色,于100倍油鏡下觀察30個視野,每個視野細菌平均數為 1~9判定為1級,10~99判定為2級,≥100判定為3級,細菌密集成團等無法計算判定為4級。
采用Metastats 16.0軟件進行統計分析,采用Graph Prism 9.0軟件作圖。對所有陰道分泌物樣本中細菌的豐度進行主成分分析(principal component analysis,PCA)。以P<0.05為差異有統計學意義。
TV組陰道分泌物中的優(yōu)勢菌為革蘭陰性短桿菌,密集度為Ⅲ級;健康對照組陰道分泌物中的優(yōu)勢菌為革蘭陽性乳桿菌,密集度為Ⅱ級。見圖1。
圖1 TV組和健康對照組革蘭染色結果(×100)
21種常見微生物分析結果顯示,64名健康對照者陰道分泌物中的微生物主要為Lactobacillus iners、Lactobacillus crispatus、Gardnerella vaginalis,其中16名優(yōu)勢菌為Lactobacillus iners,24名優(yōu)勢菌為Lactobacillus iners和Lactobacillus crispatus,18名優(yōu)勢菌為Lactobacillus crispatus,以Gardnerella vaginalis厭氧性型為優(yōu)勢菌的6名(B2、B18)。除Gardnerella vaginalis外,B18還存在組成表現為多樣化的其他菌群,如Bacterial Vaginosis-Associated Bacteria(BVABla、BVAB2a、BVAB3a);見圖2。54例TV患者陰道分泌物微生物主要為Lactobacillus iners、Prevotella、Leptotrichia amnionii、Sneathia sanguinegens,其中以Lactobacillus iners為優(yōu)勢菌的有4例(A13、A14),以Prevotella為優(yōu)勢菌的有25例,以Leptotrichia amnionii為優(yōu)勢菌的有17例,以Sneathia sanguinegens為優(yōu)勢菌的有8例;見圖2。Metastats比較結果顯示,2個組陰道分泌物21種常見微生物組成差異有統計學意義(P<0.05);PCA結果顯示,2個組21種細菌的豐度差異有統計學意義(P<0.05)。
圖2 2個組陰道分泌物微生物組成情況
TV是全球范圍內最普遍的寄生蟲所致婦科炎癥性疾病,有研究結果顯示,女性孕期發(fā)生TV會明顯增加早產、胎膜早破、分娩低體質量兒、新生兒智力殘疾等不良妊娠結局的發(fā)生率,且滴蟲感染與宮頸癌也存在一定關聯[6]。世界衛(wèi)生組織統計數據顯示,全球每年新增TV患者約1.7億例,其中北美地區(qū)人群感染率高達60%,為高發(fā)區(qū),主要通過性傳播感染;因不能較好地認知后遺癥和經濟條件限制,TV易被患者忽視,通常發(fā)展中國家貧困地區(qū)婦女發(fā)病率高,發(fā)達國家發(fā)病率低;毛滴蟲感染與患者性別、年齡、種族息息相關,以女性為主,同時有多個性伴侶、吸毒、淋球菌感染等也是TV的危險因素[7-8]。育齡期女性體內激素水平適宜滴蟲生存,且處于性活躍期,較易發(fā)生毛滴蟲感染。有研究發(fā)現,配偶感染是毛滴蟲感染最主要的感染因素,提示性生活的間接或直接接觸是已婚育齡女性不可忽視的感染途徑[10]。另外,發(fā)生TV的育齡期女性也易合并單純皰疹病毒、支原體、梅毒等其他性傳播疾病。因此,早診斷、早治療TV非常重要。
目前,臨床診斷毛滴蟲感染一般采用傳統的濕片法顯微鏡檢查,快捷、經濟,檢測陰道分泌物標本特異性較高,但敏感性僅為60%~70%[3];檢測男性樣本的敏感性更低。培養(yǎng)法作為診斷的金標準,耗時較長,一般需2~7 d才能出具報告,且培養(yǎng)法易受培養(yǎng)基、標本質量、鏡檢者技術水平影響。RT-qPCR可以明顯提高TV診斷的敏感性、特異性[10-11]。TV患者陰道內微生物種類繁多,相互共生與拮抗,若受到外界毛滴蟲入侵,內環(huán)境發(fā)生變化,會有利于毛滴蟲進一步在宿主機體內寄生和侵襲,導致陰道內環(huán)境的糖原被陰道毛滴蟲大量分解吸收,引起陰道物質組成部分缺失,菌群穩(wěn)態(tài)失衡[12]。有研究發(fā)現,TV患者的陰道分泌物涂片中乳桿菌數量明顯減少,其他菌成為優(yōu)勢菌[13-14]。另有研究發(fā)現,健康女性陰道微生態(tài)主要由乳酸桿菌、棒狀桿菌、表皮葡萄球菌、陰道加德納菌等多種菌屬組成,其中乳酸桿菌所占比例最高;而部分陰道菌群失調者優(yōu)勢乳酸桿菌所占比例下降,陰道加德納菌和其他厭氧菌所占比例增加,最終引發(fā)細菌性陰道病,并誘發(fā)各類臨床癥狀[15]。本研究結果顯示,TV患者陰道分泌物主要是革蘭陰性短桿菌,密集度為Ⅲ級,而健康對照者陰道分泌物主要以革蘭陽性乳桿菌為優(yōu)勢菌,密集度為Ⅱ級,與相關研究結果[16]一致。本研究中,64名健康對照者陰道分泌物微生物組成主要為Lactobacillus iners、Actobacillus crispatus和Gardnerella vaginalis,而54例TV患者陰道分泌物微生物組成主要為Lactobacillus iners、Prevotella、Leptotrichia amnionii和Sneathia sanguinegens。Metastats比較結果顯示,2個組陰道分泌物21種常見微生物組成差異和豐度差異均有統計學意義(P<0.05),提示TV患者的陰道分泌物微生物組成與健康對照者存在明顯差異,TV患者陰道中厭氧性Prevotella和Leptotrichia amnionii菌群與健康對照者檢出率有明顯差異,與相關研究結果[17]一致。
綜上所述,分析育齡期TV患者的陰道微生物群組成和感染狀況,可為臨床TV對癥治療提供參考,有利于改善TV患者陰道內環(huán)境。