金程佳，馬曉曉，常巧呈，高俊峰，王春仁

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319)

華支睪吸蟲病(Clonorchiasis)主要是由于誤食含華支睪吸蟲(Clonorchissinensis)囊蚴的淡水魚、蝦所造成的人獸共患寄生蟲病。華支睪吸蟲成蟲主要寄生于人、犬、貓及豬等多種哺乳類動(dòng)物的肝膽管及膽囊中[1]，引起膽道阻塞、膽囊炎、肝硬化，甚至膽管癌等多種嚴(yán)重的肝膽管疾病[2]。在膽管癌發(fā)生的病例中每10萬(wàn)例中就有約25例～35例是由華支睪吸蟲感染導(dǎo)致的[3]。華支睪吸蟲被國(guó)際癌癥組織列入Ⅰ類生物性致癌影響因子[4]。據(jù)估計(jì)，全世界目前約有2億人會(huì)存在感染華支睪吸蟲的風(fēng)險(xiǎn)，約1 500萬(wàn)人被華支睪吸蟲感染[5]，極大地威脅到人類健康及公共衛(wèi)生安全。我國(guó)感染人數(shù)達(dá)到1 300萬(wàn)[6]，以廣東、廣西、黑龍江最為嚴(yán)重[7]。目前，對(duì)于華支睪吸蟲病的診斷仍然主要采用蟲卵檢測(cè)法，現(xiàn)有免疫診斷方法的效果準(zhǔn)確性不高且成本較高[8]，不適于廣泛使用。篩選出可以檢測(cè)華支睪吸蟲的抗原蛋白并建立免疫學(xué)診斷方法十分重要。

寄生蟲在宿主體內(nèi)寄生過(guò)程中，會(huì)釋放一種可溶性抗原——排泄分泌產(chǎn)物 (excretory secretory products，ESPs)。它是由腸上皮、表皮及其他排泄分泌器官向宿主環(huán)境釋放產(chǎn)生的[9]，具有較好的免疫反應(yīng)原性，可以引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答，是臨床重要的診斷候選抗原。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶7 (gamma-glutamyltransferase 7，GGT7)在華支睪吸蟲發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均呈現(xiàn)高度表達(dá)，其蛋白含量在肝炎、阻塞性黃疸、膽道感染、膽石癥、急性胰腺炎、黃疸性肝炎、肝硬化等多種肝膽系統(tǒng)疾病時(shí)亦明顯升高[10]，所以γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶可預(yù)測(cè)肝膽功能系統(tǒng)疾病，并且有希望應(yīng)用于臨床診斷華支睪吸蟲病。基于此，本研究擬對(duì)華支睪吸蟲ESPs中的主要成分γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶7(GGT7)進(jìn)行原核表達(dá)及反應(yīng)原性分析，旨在探究其作為診斷抗原的潛能，為華支睪吸蟲病診斷試劑的研發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體及血清 華支睪吸蟲的成蟲、人工感染并檢測(cè)出華支睪吸蟲蟲卵的兔血清(陽(yáng)性血清)、未感染華支睪吸蟲兔血清(陰性血清),均來(lái)自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)寄生蟲病研究室。

1.1.2 主要試劑 RNAprep pure Tissue Kit、DNA Marker、ExTaq酶，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；TIANamp Genomic DNA Kit，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；Hind Ⅲ和XhoⅠ，賽默飛科技有限公司產(chǎn)品；大腸埃希氏菌DH5α、BL21 (DE3) ，北京全氏金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的鼠抗兔IgG，AB Clonal公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 低溫離心機(jī)，Eppendorf公司產(chǎn)品；蛋白半干轉(zhuǎn)膜儀、紫外凝膠成像儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；PCR儀，TaKaRa公司產(chǎn)品；渦旋振蕩器(QL-901)，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；SK-O180-E型水平搖床，上?？推潓?shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 GGT7基因的生物信息學(xué)分析 將目的基因序列置入U(xiǎn)niport中，分析其所行使功能、所屬蛋白家族、結(jié)構(gòu)域等；利用DNA Star(7.1) 軟件中的Protean對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu) (α-螺旋和β-折疊等) 及抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；利用在線軟件ExPASy (https://www.expasy.org/) 分析目的蛋白的疏水性；蛋白跨膜區(qū)的分析選用SignalP 4.1Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)[11]；用ExPASy (https://swiss model.expasy.org/) 分析蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)[12]。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及pET-32a-GGT7重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)GenBank中公布的GGT7基因序列，利用Primer 5[13]進(jìn)行分析設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物GGT7-U：5′-AAG CTTGC CCC CAT GGT GCA GTC ATT TCT G-3′；下游引物GGT7-F：5′-CTC GAGTTA AAA TTG TGC GGA ATT CCA TG-3′，下劃線區(qū)域部分為Hind Ⅲ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)，預(yù)期基因片段大小為1 773 bp，引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。

從液氮中取出保存的華支睪吸蟲蟲體，于研缽中充分研碎，按照試劑盒操作提取蟲體總RNA。以總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA，置于-80 ℃保存。以cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到GGT7基因，擴(kuò)增的條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。將所有PCR產(chǎn)物按照膠回收試劑盒說(shuō)明書的操作進(jìn)行回收，并將其克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建pMD18-T-GGT7克隆載體。經(jīng)菌液PCR鑒定后，陽(yáng)性質(zhì)粒由生工生物工程(上海)股份有限公司鑒定，用Hind Ⅲ和XhoⅠ同時(shí)對(duì)pMD18-T-GGT7陽(yáng)性質(zhì)粒及pET-32a空載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-GGT7，經(jīng)菌液PCR鑒定后，生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，即可置-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.2.3 重組蛋白表達(dá)的鑒定 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-32a-GGT7轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，置于具有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600 nm值約為0.6，加入終濃度為0.6 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)重組菌表達(dá)6 h，收集誘導(dǎo)后的菌體，1 200 r/min離心去上層培養(yǎng)液，將下層沉淀加入15 mL的破菌液重懸混勻，將其放在冰板上，置于超聲破碎儀上進(jìn)行超聲破碎，1 200 r/min離心2 min后，分別取100 μL上清與沉淀，加入20 μL的蛋白上樣緩沖液，置于100 ℃ 金屬浴加熱10 min，待其冷卻后用于SDS-PAGE鑒定。

SDS-PAGE電泳后，將膠塊放置在0.2 mol/L KCl溶液中靜置5 min，待能夠清晰的看到銀白色條帶后，用干凈的梳子切下目的條帶所在的位置，用PBS清洗3次，碾碎后放入2 mL離心管，加入1 mL PBS后，置于-20 ℃冰箱中反復(fù)凍融3次，經(jīng)過(guò)高速離心后吸取上清即為純化后的蛋白。將純化好的蛋白濕轉(zhuǎn)于硝酸纖維素薄膜上，用50 g/L的脫脂奶粉浸泡2 h對(duì)其進(jìn)行封閉，以人工感染的兔華支睪吸蟲陽(yáng)性血清作為一抗 (1∶150)，以HRP標(biāo)記的鼠抗兔 IgG為二抗 (1∶4 000)，Western blot鑒定重組蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 GGT7基因的生物信息學(xué)分析

用生物學(xué)軟件DNA Star(7.1)Protean分析預(yù)測(cè)目的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原表位，發(fā)現(xiàn)主要有7個(gè)α-螺旋，分別位于2-17、28-38、132-143、211-234、272-285、303-323、446-455位氨基酸；有6個(gè)主要的β-折疊，分別位于78-104、361-370、411-425、429-438、494-503、517-526位氨基酸；柔韌性在105-108、240-243、373-376位氨基酸較好 (圖1A)；B細(xì)胞抗原表位主要位于59-89、163-191、238-274、287-361、46-551位氨基酸 (圖1B)，推測(cè)GGT7可能具有結(jié)合抗體的能力。

用在線軟件ExPASy分析蛋白的疏水性，大部分曲線位于0點(diǎn)以下，預(yù)測(cè)目的蛋白為包涵體表達(dá) (圖1C)，利用在線軟件SWISS MODEL預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu) (圖1D)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白具備較多的B細(xì)胞抗原表位，推測(cè)其具備免疫反應(yīng)原性。

A.二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；B.GGT7 B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)；C.GGT7疏水性分析；D.GGT7三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以華支睪吸蟲的cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)其進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到GGT7基因，將所有產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，在1 700 bp左右的位置出現(xiàn)目的條帶 (圖2A)，將其與pMD18-T載體進(jìn)行連接，隨后克隆至大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中再次構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-GGT7。測(cè)序得到GGT7基因?yàn)? 773 bp，A+T含量為51%，與GenBank中的華支睪吸蟲GGT7完整基因的核苷酸 (RJW59997.1) 序列的同源性為99.98%，DNA Star軟件預(yù)測(cè)GGT7基因可以進(jìn)行正常翻譯。測(cè)序鑒定正確后，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-GGT7，經(jīng)Hind Ⅲ和XhoⅠ酶雙酶切及測(cè)序鑒定，在3 200 bp處有pET-32a載體條帶，在1 700 bp左右出現(xiàn)酶切后目的基因條帶，與預(yù)期結(jié)果完全相符 (圖2B)，表明pET-32a-GGT7重組質(zhì)粒準(zhǔn)確構(gòu)建。

A.GGT7;B.重組質(zhì)粒;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;M1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.GGT7基因；2.用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ 酶切質(zhì)粒A.GGT7;B.Recombinant plasmid;M.DNA Marker DL 2 000;M1.DNA Marker DL 5 000;1.GGT7 gene;2.Digestion of plasmid by Hind Ⅲ and Xho Ⅰ

2.3 重組蛋白的表達(dá)純化與鑒定

用IPTG誘導(dǎo)測(cè)序正確的pET-32a-GGT7陽(yáng)性菌液。SDS-PAGE結(jié)果表明，目的蛋白是以包涵體形式表達(dá)，目標(biāo)條帶出現(xiàn)在70 ku處，與理論值一致(圖3)。凝膠切割純化后，得到單一目的條帶。Western blot結(jié)果表明，純化蛋白能與兔陽(yáng)性血清反應(yīng)，與陰性血清不反應(yīng)(圖4)，表明蛋白質(zhì)顯示出良好的反應(yīng)原性。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.未誘導(dǎo)重組pET-32a-GGT7；2.用IPTG誘導(dǎo)重組pET-32a-GGT73;3.重組pET-32a-GGT7經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物上清液；4.pET-32a-GGT7表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)IPTG誘導(dǎo)沉淀

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.兔華支睪吸蟲陽(yáng)性血清；2.陰性對(duì)照

3 討論

華支睪吸蟲感染后主要與肝臟和膽道系統(tǒng)疾病有關(guān)，特別是與膽管癌相關(guān)[14]。Kato-Katz技術(shù)[15]應(yīng)用于新鮮糞便樣本，糞便中檢出蟲卵是診斷華支睪吸蟲感染的金標(biāo)準(zhǔn)，也是目前應(yīng)用最廣泛的診斷方法，具有簡(jiǎn)單、成本低，能夠量化感染強(qiáng)度的優(yōu)點(diǎn)。該方法的缺點(diǎn)是靈敏度低，特別是在檢測(cè)低強(qiáng)度感染時(shí)，若在膽道阻塞期間，糞便中則無(wú)法檢測(cè)到蟲卵。華支睪吸蟲病抗原檢測(cè)自20世紀(jì)70年代末引入ELISA就得到廣泛應(yīng)用[16]。由于存在交叉反應(yīng)，所以使用粗抗原進(jìn)行ELISA血清學(xué)診斷并不理想。

華支睪吸蟲病對(duì)公共衛(wèi)生的重要性未引起重視，所以感染和疾病數(shù)量不斷增加。過(guò)去140年來(lái)對(duì)華支睪吸蟲病的臨床和流行病學(xué)研究[17]有助于加深對(duì)寄生蟲、中間宿主和疾病的理解。然而，對(duì)華支睪吸蟲生物學(xué)和華支睪吸蟲病防治的研究落后于鉤端螺旋體病和許多其他寄生蟲病。雖然華支睪吸蟲感染與膽管癌之間的關(guān)系在過(guò)去幾年已經(jīng)得到初步證實(shí)[18]，但其機(jī)制尚未完全闡明，也阻礙了診斷和預(yù)防。此外，目前對(duì)于國(guó)家、區(qū)域和世界范圍的華支睪吸蟲病所造成的影響也僅是推測(cè)。例如，目前越南還沒(méi)有進(jìn)行全國(guó)性的調(diào)查，因此估計(jì)這個(gè)國(guó)家感染華支睪吸蟲的人數(shù)是不準(zhǔn)確的。我國(guó)全國(guó)抽樣調(diào)查只計(jì)算省級(jí)的患病率。時(shí)至今日，華支睪吸蟲γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)在人、畜腎臟中表達(dá)是最高的，其次為胰臟和肝臟。正常哺乳動(dòng)物血清中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶主要來(lái)自于肝臟，當(dāng)肝內(nèi)合成亢進(jìn)或膽汁排出受阻時(shí)，血清中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶就會(huì)明顯升高[19]。因此，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶可用于檢測(cè)多種肝臟系統(tǒng)的疾病。而GGT7重組蛋白作為γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶家族中的一個(gè)成員，在華支睪吸蟲繁殖發(fā)育的各個(gè)重要階段不同時(shí)期都已經(jīng)證實(shí)其存在。我們首次成功地表達(dá)了GGT7重組蛋白，Western blot結(jié)果顯示，該蛋白可以與華支睪吸蟲陽(yáng)性血清特異性結(jié)合，表明其具有良好的反應(yīng)原性。該蛋白具有臨床診斷華支睪吸蟲病的潛力，為研發(fā)華支睪吸蟲病免疫診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。