湄潭白茶多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性及其穩(wěn)定性

宋姍姍，楊艾華，王小敏，龍 婉，王微微,

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州遵義 563000）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起食品污染和食物中毒的重要和常見(jiàn)細(xì)菌[1]，該細(xì)菌污染食品后，可導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)，降低食用價(jià)值，且能產(chǎn)生腸毒素，引起毒素型食物中毒[2]。在我國(guó)，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中占有較大的比例，食物中毒事件時(shí)有發(fā)生[3-4]。由于金黃色葡萄球菌在自然界中無(wú)處不在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到，食品受到污染的機(jī)會(huì)很多，因此為保證食品品質(zhì)以及防腐、保鮮和加工工藝的要求，需在食品中添加防腐劑[5]。目前，在食品工業(yè)上廣泛使用的防腐劑為化學(xué)防腐劑，但研究顯示，若化學(xué)防腐劑用量超過(guò)一定限度后可能對(duì)人體健康有一定毒副作用[6-8]，故來(lái)源廣泛、種類繁多、安全健康且具有較好抑菌效果的天然防腐劑有望取代化學(xué)防腐劑[9-10]。

白茶（white tea）屬于輕微發(fā)酵的茶類，具有外形芽毫完整、湯色淡黃、滋味清純、香氣清雅等品質(zhì)特點(diǎn)，是我國(guó)茶類中的特殊珍品，深受廣大消費(fèi)者的認(rèn)可[11-12]。白茶因其獨(dú)特的加工工藝，很大程度上保留了茶葉中的營(yíng)養(yǎng)成分，主要包括初級(jí)代謝產(chǎn)物蛋白質(zhì)、糖類、脂肪以及次級(jí)代謝產(chǎn)物多酚類、茶氨酸、生物堿、芳香類等物質(zhì)[13-16]。其中茶多糖（tea polysaccharide）作為茶葉中的多糖類復(fù)合物，是僅次于茶多酚的功能性物質(zhì)[17-20]。茶多糖除具有抑菌作用外[21-22]，還能清除自由基，提高抗氧化指標(biāo)，因此將茶多糖用于食品防腐保鮮具有廣闊的應(yīng)用前景。

我國(guó)貴州省湄潭縣因其具有“低緯度、高海拔、多云霧、少日照、無(wú)污染”的地理?xiàng)l件，為白茶的生長(zhǎng)提供了優(yōu)質(zhì)的條件[11]。目前，對(duì)茶多糖的研究主要集中于普洱茶多糖、綠茶多糖、烏龍茶多糖等[23-25]，湄潭白茶多糖作為一種安全無(wú)毒的活性物質(zhì)，關(guān)于其抗菌性能的研究鮮有報(bào)道。因此，本文以湄潭白茶為原材料，通過(guò)水提醇沉法制備湄潭白茶多糖，并對(duì)湄潭白茶多糖體外抑制金黃色葡萄球菌活性及其穩(wěn)定性進(jìn)行研究，為其開(kāi)發(fā)成高效、無(wú)毒、穩(wěn)定的食品天然防腐劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

湄潭白茶 購(gòu)于貴州省湄潭縣沁園春茶業(yè)，將其在55 ℃烘箱中烘至恒重，粉碎過(guò)篩（40目），自封袋密封保存；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC26003） 遵義醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；苯酚、濃硫酸、三氯甲烷、正丁醇、無(wú)水乙醇、無(wú)水葡萄糖、濃鹽酸 均為分析純，成都化學(xué)試劑廠；檸檬酸鈉、氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；雙蒸水實(shí)驗(yàn)室自制。

BCM-1000A超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HH·W21·600S恒溫水浴鍋、HH-B11·600BY電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；TD5M-WS高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；ELx800酶標(biāo)儀 美國(guó)博騰儀器有限公司；LGJ-10D真空冷凍干燥機(jī) 四環(huán)科儀（天津）有限公司；TS-110/LE407 pH檢測(cè)儀 上海闊思電子有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 湄潭白茶多糖的制備 準(zhǔn)確稱取10.0 g白茶粉末，按1:20 g/mL料液比加入雙蒸水，90 ℃水浴中提取4 h，3500 r/min離心15 min得到粗多糖提取液。按體積比1:1加入Sevage試劑（氯仿:正丁醇=4:1, v/v），混勻后靜置20 min，上清液即為脫蛋白的多糖提取液。向上述提取液中加入4倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜，3500 r/min離心15 min收集醇沉物。經(jīng)真空冷凍干燥處理，得湄潭白茶多糖樣品。采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[26]。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取0.1 g葡萄糖配制成0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再用蒸餾水調(diào)節(jié)溶液濃度，配制成系列不同濃度的溶液。在6支試管中分別加入不同濃度（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL）葡萄糖溶液1 mL，再各加入6%的苯酚水溶液0.5 mL，迅速加入5 mL濃硫酸混勻，沸水浴15 min顯色，冷水浴冷卻，以空白管為對(duì)照，在490 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。

1.2.3 金黃色葡萄球菌的活化及菌懸液的制備 從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取金黃色葡萄球菌單菌落，接種到3 mL新鮮的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)整細(xì)菌密度為1.5×106CFU/mL。

1.2.4 湄潭白茶多糖對(duì)金黃色葡萄球菌體外抑菌活性的測(cè)定 采用牛津杯法檢測(cè)湄潭白茶多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性。取100 μL菌懸液，均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，靜置5 min后，將已滅菌的牛津杯置于平板表面，輕輕按壓固定，分別吸取100 μL溶液（實(shí)驗(yàn)組：100 mg/mL湄潭白茶多糖溶液；對(duì)照組：無(wú)菌雙蒸水）加入牛津杯中，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，37 ℃培養(yǎng)18 h觀察抑菌圈的形成，測(cè)量抑菌圈直徑[27]。

1.2.5 湄潭白茶多糖對(duì)金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 采用微量肉湯稀釋法測(cè)量湄潭白茶多糖的最小抑菌濃度。將100 μL茶多糖溶液與100 μL菌懸液混合。實(shí)驗(yàn)組：不同濃度茶多糖溶液（100、80、60、40、20、10、8、6、4、2、1 mg/mL）；陰性對(duì)照組：菌懸液100 μL+營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基100 μL。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，37 ℃培養(yǎng)18 h，隨后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD600，確定湄潭白茶多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC[27]。

1.2.6 湄潭白茶多糖抑菌穩(wěn)定性的測(cè)定 采用1.5×106CFU/mL金黃色葡萄球菌為指示菌、終濃度為8 mg/mL茶多糖溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中未處理組為未經(jīng)處理的茶多糖溶液與菌懸液等體積混合；對(duì)照組為不加茶多糖溶液的菌懸液。設(shè)置3次平行實(shí)驗(yàn)，采用96孔板法檢測(cè)不同條件對(duì)白茶多糖抑菌活性的影響。

1.2.6.1 溫度對(duì)湄潭白茶多糖抑菌活性的影響 實(shí)驗(yàn)組分別為20、40、60、80和100 ℃下處理30 min的茶多糖溶液。

1.2.6.2 p H對(duì)湄潭白茶多糖抑菌活性的影響 實(shí)驗(yàn)組分別為使用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為4.0、6.0、8.0和10.0的茶多糖溶液。

1.2.6.3 紫外線照射對(duì)湄潭白茶多糖抑菌活性的影響 實(shí)驗(yàn)組分別為30 W紫外燈光下照射10、20、30、40和50 min的茶多糖溶液。

1.2.6.4 金屬離子對(duì)湄潭白茶多糖抑菌活性的影響實(shí)驗(yàn)組分別為使用0.1 mol/L NaCl、KCl和CaCl2溶液處理的茶多糖溶液。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019進(jìn)行圖表處理，SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和單因素方差分析，P＜0.05，表明具有顯著性差異；P＜0.01，表明具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

測(cè)定葡萄糖溶液的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示,在波長(zhǎng)490 nm處，每個(gè)梯度重復(fù)3次取平均值，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=2.938x+0.001，R2=0.998，所得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of dextrose density

2.2 湄潭白茶多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性

采用牛津杯法檢測(cè)湄潭白茶多糖抑菌活性，根據(jù)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法[27]進(jìn)行判斷：抑菌圈直徑≤6 mm為無(wú)抑菌活性，＞6 mm判斷為有抑菌活性，10 mm≥抑菌圈直徑＞6 mm視為低度敏感，15 mm≥抑菌圈直徑＞10 mm視為中度敏感，抑菌圈直徑＞15 mm視為高度敏感[28]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100 mg/mL湄潭白茶多糖溶液對(duì)金黃色葡萄球菌具有強(qiáng)抑菌活性，抑菌圈直徑為（15.51±0.12）mm，為高度敏感。

2.3 湄潭白茶多糖MIC測(cè)定

湄潭白茶多糖MIC結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)組均有細(xì)菌生長(zhǎng)，通過(guò)組間單因素方差分析，與對(duì)照組相比，8～100 mg/mL湄潭白茶多糖對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)具有極顯著差異（P＜0.01），且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果呈一定的劑量依賴關(guān)系。MIC為8 mg/mL。

圖2 湄潭白茶多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度Fig.2 The MIC of polysaccharides from Meitan White Tea against Staphylococcus aureus

2.4 湄潭白茶多糖抑菌穩(wěn)定性

2.4.1 溫度對(duì)湄潭白茶多糖抑菌活性的影響 以金黃色葡萄球菌的OD600值為指標(biāo)探討茶多糖的抑菌活性[29]，吸光度值越低，其抑菌活性越強(qiáng)，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)組與未處理組相比較，20～60 ℃處理30 min，其抑菌活性相對(duì)穩(wěn)定；80～100 ℃處理30 min，抑菌活性下降明顯，大約為未處理組的45.8%，分析原因?yàn)闇囟冗^(guò)高茶多糖易發(fā)生分解或轉(zhuǎn)化反應(yīng)，導(dǎo)致抑菌活性下降[30]。但與對(duì)照組相比，其他組均具有極顯著的抑菌活性（P＜0.01）。表明湄潭白茶多糖具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖3 不同溫度對(duì)湄潭白茶多糖抗菌活性的影響Fig.3 Effect of different temperature on the antibacterial activity of polysaccharides from Meitan White Tea

2.4.2p H對(duì)湄潭白茶多糖抑菌活性的影響 湄潭白茶多糖在pH4～10范圍內(nèi)的抑菌活性結(jié)果如圖4所示。與未處理組相比，堿性條件下，抑菌活性略有下降，其中pH10處理的茶多糖，其抑菌活性保留約58.5%，原因可能為茶多糖受到OH-的破壞，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響其抑菌性能。但與對(duì)照組相比，其他組均具有極顯著抑菌活性（P＜0.01）。表明湄潭白茶多糖中的活性物質(zhì)具有良好的酸堿穩(wěn)定性。

圖4 不同pH對(duì)湄潭白茶多糖抗菌活性的影響Fig.4 Effect of different pH on the antibacterial activity of polysaccharides from Meitan White Tea

2.4.3 紫外線對(duì)湄潭白茶多糖抑菌活性的影響 湄潭白茶多糖經(jīng)30 W紫外線處理10～50 min后，抑菌活性相對(duì)穩(wěn)定，結(jié)果如圖5所示。實(shí)驗(yàn)組與未處理組相比較，抑菌活性均保留80.0%以上。與對(duì)照組相比，其他組均具有極顯著抑菌活性（P＜0.01）。說(shuō)明湄潭白茶多糖中的活性物質(zhì)能夠?qū)棺贤饩€的破壞，保證其在自然環(huán)境中也能發(fā)揮較好的抑菌活性。

圖5 紫外線對(duì)湄潭白茶多糖抗菌活性的影響Fig.5 Effect of ultraviolet ray on the antibacterial activity of polysaccharides from Meitan White Tea

2.4.4 金屬離子對(duì)湄潭白茶多糖抑菌活性的影響如圖6所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)0.1 mol/L NaCl和0.1 mol/L KCl處理的茶多糖，仍具有較強(qiáng)的抑菌活性，而經(jīng)0.1 mol/L CaCl2處理的茶多糖，抑菌活性喪失，分析原因?yàn)殁}離子與多糖間存在較強(qiáng)的絡(luò)合作用，對(duì)其結(jié)構(gòu)有一定的影響，從而使其抗菌活性喪失[31]。與未處理組相比較，經(jīng)0.1 mol/L NaCl和0.1 mol/L KCl處理的茶多糖，抑菌活性無(wú)顯著差異（P＞0.05），活性均保留82.0%以上，說(shuō)明湄潭白茶多糖對(duì)鈉離子和鉀離子具有一定的耐受性。

圖6 金屬離子對(duì)湄潭白茶多糖抗菌活性的影響Fig.6 Effect of metal ions on the antibacterial activity of polysaccharides from Meitan White Tea

3 結(jié)論

我國(guó)作為茶葉生產(chǎn)大國(guó)，白茶原料來(lái)源廣泛，同時(shí)，白茶多糖作為一種植物源天然防腐劑，提取工藝流程簡(jiǎn)便，將其運(yùn)用到食品防腐保鮮中，既能夠降低食品企業(yè)的應(yīng)用成本，也利于消費(fèi)者身體健康。因此，本研究采用水提醇沉法制備湄潭白茶多糖，以金黃色葡萄球菌為指示菌，探討湄潭白茶多糖的體外抑菌活性及抑菌穩(wěn)定性。牛津杯實(shí)驗(yàn)表明湄潭白茶多糖具有抑菌活性，微量肉湯稀釋法測(cè)定其最小抑菌濃度為8 mg/mL。抑菌穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，湄潭白茶多糖表現(xiàn)出良好的抑菌穩(wěn)定性，對(duì)20～60 ℃不敏感，耐酸堿，對(duì)紫外線和Na+、K+其抑菌活性比較穩(wěn)定，而Ca2+可使其喪失抑菌作用?？傮w上，湄潭白茶多糖表現(xiàn)出了良好的體外抑菌活性和穩(wěn)定性。在后續(xù)研究中，課題組將探討其抑菌機(jī)理和安全性評(píng)價(jià)，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)湄潭白茶多糖在食品保藏中的應(yīng)用，為我國(guó)食品行業(yè)的發(fā)展及茶葉資源綜合利用奠定理論基礎(chǔ)。