膠體金免疫層析技術(shù)及其在畜禽疫病診斷中的應(yīng)用

榮 光，徐向東,2，彭維祺，孫衛(wèi)平，夏萬良，張潤峰

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南?？?571101；2.湖北師范大學(xué)，湖北黃石 435000）

膠體金免疫層析技術(shù)（Colloidal gold immunochromatographic assay，GICA)是建立在膠體金、免疫層析、單克隆抗體、新材料、乳膠凝集試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗等方法基礎(chǔ)之上發(fā)展起來的一種新型固相免疫標(biāo)記檢測技術(shù)[1]。該技術(shù)誕生于20 世紀(jì)90 年代初[2]，經(jīng)過30 多年的不斷發(fā)展，該技術(shù)在生物醫(yī)藥學(xué)、植物檢疫、食品安全檢測、農(nóng)牧業(yè)、重金屬殘留檢測以及動物疫病診斷等各大領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[3,4]。與其他技術(shù)領(lǐng)域相比，GICA 在動物疫病診斷方面應(yīng)用起步較晚，卻發(fā)展迅速，已經(jīng)成為當(dāng)前動物疫病診斷中最簡單、快速、敏感的檢測技術(shù)之一。因該技術(shù)具有快速簡便、特異性強、成本低、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點，適合廣大基層技術(shù)人員大批量檢測和普查等，具有巨大的潛力和廣闊的前景[5]。本文就GICA 的原理、特點、分類及在動物疫病診斷中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 膠體金免疫層析技術(shù)

1.1 膠體金免疫層析技術(shù)的原理

膠體金免疫層析技術(shù)是一種以膠體金為示蹤標(biāo)志物檢測特定抗原或抗體的一種新型的固相免疫標(biāo)記檢測技術(shù)。它的原理是以硝酸纖維素膜（NC)作為固相載體，將標(biāo)記了膠體金的抗原或抗體固定在硝酸纖維素膜（NC)上。檢測時，在樣品墊上加入待測樣品，樣品通過毛細(xì)作用沿層析方向向前移動。當(dāng)待測樣品中的待測物泳動至膠體金結(jié)合墊，與膠體金結(jié)合墊上的受體（抗原或抗體)發(fā)生特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，層析過程中免疫復(fù)合物被富集或截留在檢測線，短時間內(nèi)（5～10min)，可通過膠體金的顏色反應(yīng)目測得到試驗結(jié)果[6-8]。

1.2 膠體金免疫層析技術(shù)的特點

膠體金免疫層析技術(shù)在診斷技術(shù)中能夠快速發(fā)展的主要原因是其具有以下特點。

1.2.1 生產(chǎn)成本低

試紙組成結(jié)構(gòu)簡單，生產(chǎn)中使用的設(shè)備及耗材成本低，相對易于制造和進(jìn)行批量生產(chǎn)[9]。

1.2.2 操作簡單、快速

膠體金免疫層析技術(shù)操作簡單，無需專業(yè)的儀器設(shè)備、專業(yè)的人員，樣品也無需處理。一般情況下，5～10min 內(nèi)直接通過目測得到直觀的檢測結(jié)果[10-12]。

1.2.3 應(yīng)用范圍廣

膠體金免疫層析技術(shù)可檢測的樣品多樣，如體液、唾液、尿液、全血、血漿、血清等；該技術(shù)既可以檢測抗體，也可以檢測抗原，目前廣泛用于生物醫(yī)藥、植物檢疫、食品安全檢測、農(nóng)牧業(yè)、重金屬殘留檢測、動物疫病診斷、獸藥殘留檢測等領(lǐng)域[3,9]。

1.2.4 靈敏度、特異性高

該技術(shù)用高質(zhì)量的單克隆抗體標(biāo)記膠體金，診斷下限可達(dá)10pg，并且對組織細(xì)胞的非特異性吸附作用小，故其靈敏度、特異性高[4,13]。

1.2.5 相對穩(wěn)定、安全環(huán)保

膠體金免疫層析試紙條的保質(zhì)期一般為12～24個月，通常不需要冷藏。試劑比較穩(wěn)定，檢測結(jié)果能長時間保存于室溫；無鄰苯二胺等有害物質(zhì)的參與，不會影響操作人員的健康，也不會污染環(huán)境[9,14]。

1.2.6 經(jīng)濟實用，便于運輸

該試紙條檢測時所需的試劑和樣本用量少，其中樣本用量低至1～2mL。同時該試紙條體積小，方便運輸[4,15]。

1.3 膠體金免疫層析技術(shù)的分類

膠體金免疫層析技術(shù)根據(jù)其原理的不同，可分為間接法、夾心法和競爭法。其中，夾心法又分為雙抗原夾心法和雙抗體夾心法。間接法大多用于檢測抗體，常用于病毒或細(xì)菌相應(yīng)血清抗體的檢測；競爭法多用于檢測僅含有一個免疫結(jié)合位點的小分子抗原，例如嗎啡；雙抗體夾心法多用于檢測多表位抗原，常應(yīng)用于病毒的檢測；雙抗原夾心法多用于對病原相應(yīng)抗體的檢測[16-18]。

2 在動物疫病診斷中的應(yīng)用

2.1 在動物病毒性疾病診斷中的應(yīng)用

目前，根據(jù)相關(guān)調(diào)查和分析發(fā)現(xiàn)病毒性疾病是導(dǎo)致畜牧行業(yè)動物出現(xiàn)疫情的主要原因[19]。在預(yù)防和控制疫情發(fā)生方面，準(zhǔn)確快速、簡便安全的膠體金免疫層析技術(shù)顯得尤為重要，該技術(shù)在動物病毒性疫病診斷中也得到廣泛的應(yīng)用。

丁豪杰等[20]用豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2)重組衣殼蛋白（dCap)，研制了檢測PCV2-dCap 抗體的膠體金免疫層析檢測試紙條。結(jié)果顯示，該方法具有良好的特異性、敏感性以及較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。該檢測方法和ELISA 相比較，結(jié)果顯示陽性符合率為90.5%，陰性符合率為100%，總符合率為91%。Yu[21]等利用鴨坦布蘇病毒（DTMUV)的E 蛋白特異性抗體建立了快速檢測鴨坦布蘇病毒（DTMUV)的膠體金免疫層析試紙條，檢測了50 份臨床樣本，該檢測方法與RT-PCR 符合率為93.9%。程婷婷[22]等以O(shè)MP31 與BP26 重組蛋白作為檢測抗原，建立了一種快速檢測布魯氏菌抗體的膠體金免疫層析試紙條。該試紙條與其他不相關(guān)疾病無交叉反應(yīng)，特異性高。經(jīng)檢測，該試紙條與琥紅平板試驗方法符合率為92%，說明其具有良好的使用價值，可在基層推廣使用。李昕等[23]利用雙抗體夾心法建立了檢測口蹄疫O、A、Asia1 型病毒膠體金免疫層析定量檢測試紙卡，其不僅在O、A、Asia1 血清型口蹄疫病毒間無交叉反應(yīng)，與其他非口蹄疫病毒也無交叉反應(yīng)，可應(yīng)用于快速鑒別口蹄疫病毒抗原、146S 定量檢測以及血清分型。

2.2 在動物細(xì)菌性疾病診斷中的應(yīng)用

最近幾年，動物細(xì)菌性疾病在中國部分地區(qū)呈多發(fā)狀態(tài)，在一定程度上嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。膠體金免疫層析技術(shù)在諸如布魯氏菌病等細(xì)菌性疾病的診、監(jiān)測和檢測斷中發(fā)揮了極大作用。

許菲菲等[24]基于BP26 蛋白，將BP26 蛋白包被檢測線（T)，兔BRU-BP26 抗體包被質(zhì)控線（C)，研制出了羊布魯氏菌抗體金標(biāo)檢測試紙條。該方法的特異性和靈敏度分別為94.44%、90.62%，與試管凝集試驗總符合率為92.69%。此外，與大腸桿菌O∶157 等6 種細(xì)菌均無交叉反應(yīng)，說明該試紙條是診斷羊布魯氏病的理想方法。趙越等[25]以重組表位蛋白map0862-2154c 為抗原，建立了牛副結(jié)核分枝桿菌抗體膠體檢測方法。用該方法在臨床樣本血清檢測結(jié)果顯示，其敏感性為91.86%，特異性為94.23%，符合率為93.38%，為檢測牛副結(jié)核病的血清抗體提供了簡便、敏感性高、特異性高的檢測手段。趙肖等[26]研制了可同時檢測Mhp 血清抗體和黏膜抗體的豬肺炎支原體抗體膠體金免疫層析試紙條。該試紙條只需10min 即可得到檢測結(jié)果，其與商品化的Mhp ELISA 試劑盒的檢測符合率為96.1%，對豬肺炎支原體的診斷提供了快速檢測技術(shù)。

2.3 在寄生蟲病診斷中的應(yīng)用

相比于其他疾病，膠體金免疫層析技術(shù)在寄生蟲病診斷的應(yīng)用相對較少，但這方面也有較多的研究成果。

丁豪杰等[27]將膠體金標(biāo)記VHH-48 和VHH-52抗體蛋白并制備金標(biāo)墊，再將日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原（SEA)作為檢測線包被物，羊抗鼠IgG 作為質(zhì)控線包被物，建立了基于抗日本血吸蟲蟲卵抗原納米抗體的膠體金試紙條檢測方法。結(jié)果表明，該方法特異性和敏感性良好。寇金華等[28]利用膠體金標(biāo)記抗弓形蟲表面抗原SAG3 單克隆抗體，制備豬弓形蟲血清循環(huán)抗原免疫膠體金試紙條。該試紙的靈敏度可達(dá)1∶160，在特異性方面，與豬囊蟲陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。該試紙條在室溫條件下，可保存1 個月以上，具有較好的穩(wěn)定性。楊升等[29]建立了新孢子蟲感染牛血清抗體的檢測方法。該試紙條以兔抗SPA 包被為質(zhì)控線，新孢子蟲P40 蛋白包被為檢測線進(jìn)行制備。經(jīng)過測試，該試紙條特異性強、靈敏度高，適用于監(jiān)測牛新孢子蟲的感染。

3 小結(jié)

迄今為止，膠體金免疫層析技術(shù)因具備多種優(yōu)點，是目前最成功的商業(yè)化POCT 產(chǎn)品之一，也是多個領(lǐng)域研究和應(yīng)用的熱點。因此，該技術(shù)一直處于被創(chuàng)新和優(yōu)化狀態(tài)。當(dāng)前，膠體金免疫層析技術(shù)已相對成熟，具有廣闊的發(fā)展前景。但是該技術(shù)還有一些不足之處，如質(zhì)控體系不夠嚴(yán)密；相比于其他技術(shù)，靈敏度低，易導(dǎo)致假陽性的發(fā)生；難以實現(xiàn)定量檢測；不能實現(xiàn)抗原抗體的同步檢測等。所以，膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)充分利用自身優(yōu)點的情況下，朝著實現(xiàn)高通量檢測、提高靈敏度、實現(xiàn)定量檢測以及抗原抗體的同步檢測等方面發(fā)展，發(fā)揮該技術(shù)最大的價值，持續(xù)為中國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展保駕護(hù)航[30,31]。