陳 韻，施 慧，許文軍，汪 瑋，謝建軍

(1.浙江海洋大學水產學院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316021)

殺香魚假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)是大黃魚(Larimichthyscrocea)養(yǎng)殖中主要細菌性疾病——內臟白點病的病原菌[1]，該菌能感染包括大黃魚、小黃魚(Larimichthyspolyactis)、條石鯛(Oplegnathusfasciatus)、黃姑魚(Nibeaalbiflora)以及石斑魚亞科魚類(Epinephelinae)等在內的多種水產養(yǎng)殖經濟魚類。由該病原菌引起的病害造成的損失約占大黃魚養(yǎng)殖總產值的10%左右，殺香魚假單胞菌已成為了限制大黃魚產業(yè)規(guī)模升級的最重要病原之一。目前大黃魚內臟白點病的臨床診斷主要依賴于病原菌分離培養(yǎng)、16S r RNA序列分析鑒定以及熒光定量PCR檢測等分子生物學方法[2-4]，但是病原菌分離培養(yǎng)耗時長，殺香魚假單胞菌的16S r RNA序列又與其他同屬假單胞菌相似度極高[5]，而熒光定量PCR檢測等分子生物學方法則對儀器設備要求較高，這使得大黃魚內臟白點病的臨床及時診斷受到極大限制。因此，迫切需要為大黃魚內臟白點病快速診斷開辟新思路。

單鏈抗體(scFv)是一種小分子基因工程抗體，其穿透力強、免疫原性低，在疾病防治及醫(yī)學診斷等領域具有廣泛的應用前景。張凡慶[6]制備了針對豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)及產腸毒素大腸桿菌(ETEC)3種病原的單鏈抗體(scFv)，攻毒實驗證實包載3種scFv的納米口服制劑可以有效緩解仔豬腹瀉癥狀。PRABIR等[7]從噬菌體抗體庫中篩選出針對白斑綜合癥病毒VP28-4L的scFv，該抗體與其他蝦類病毒無交叉反應，具有高特異性，可以在20 min內檢出凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)組織勻漿中病毒粒子，極大的縮短了臨床診斷時間。因此，利用基因工程技術大量、快速制備能夠與殺香魚假單胞菌特異性結合的scFv，并在此基礎上研發(fā)一種操作簡便、判讀簡單、適合于現(xiàn)場快速診斷的免疫學方法，有助于實現(xiàn)大黃魚內臟白點病的臨床快速診斷。

ELISA方法具有靈敏、特異、簡單、快速及易于自動化操作等特點，適用于臨床多樣本的檢查[8]，制備能與殺香魚假單胞菌特異性結合的抗體，并利用該抗體研發(fā)一種適合于現(xiàn)場診斷的ELISA快速檢測方法，可為大黃魚內臟白點病的快速診斷技術的研發(fā)提供科學基礎。

本研究以殺香魚假單胞菌重組溶血素共調節(jié)蛋白為抗原，從兔天然噬菌體 scFv 文庫中篩選出特異性單鏈抗體(Hcp-scFv)，經構建重組質粒pET-30a-Hcp-scFv并進行誘導表達，最終獲得6株抗殺香魚假單胞菌溶血素共調節(jié)蛋白的特異性抗體，為制備抗殺香魚假單胞菌抗體提供了一種快速、便捷的方法，為進一步研究大黃魚內臟白點病的快速臨床診斷技術奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

殺香魚假單胞菌Hcp重組復性蛋白由本實驗室制備保存；天然兔抗噬菌體抗體庫購自武漢普健生物有限公司；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)pLysS購自北京天恩澤基因科技有限公司；T4連接酶試劑盒、限制性內切酶Hind Ⅲ、Bam HⅠ、Not Ⅰ、Nco Ⅰ購自Thermo Scientific公司；Ni-IDA-Sefinose Colum純化柱、TMB顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；His-Tag鼠單抗、HRP標記的羊抗鼠IgG購自北京康為世紀生物科技有限公司；超敏ECL化學發(fā)光試劑盒購自新賽美有限公司。

1.2 單鏈抗體Hcp-scFv的篩選

1.2.1 抗殺香魚假單胞菌Hcp單鏈抗體的篩選

根據T7Select系統(tǒng)手冊，取2 mL 蛋白濃度為50 μg·mL-1殺香魚假單胞菌Hcp重組復性蛋白置于1.5 mL離心管中，4 ℃ 孵育過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline with tween-20, PBST)洗滌后加5%脫脂牛奶，30 ℃封閉2 h，PBST洗滌后加入1.2 mL天然兔噬菌體抗體庫，37 ℃孵育1.5 h；分別以磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)和磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，加入1.2 mL 洗脫液(Gly-HCl 0.1 mol·L-1，pH 2.2)孵育，吸出洗脫液加入中和液(Tris-HCl 1 mol·L-1，pH 8.5)；將洗脫的噬菌體加入經5%脫脂牛奶封閉的試管中，32 ℃孵育1 h，將孵育產物轉移至3% 牛血清蛋白(BSA)封閉的試管中，32 ℃孵育1 h，從中取出 10 μL 進行洗脫噬菌體滴度的測定，剩余洗脫液用于擴增噬菌體進行下一輪親和篩選，滴度測定及噬菌體擴增方法依據參考文獻[9]。

1.2.2 Phage-ELISA 鑒定陽性噬菌體克隆

用2 μg·mL-1殺香魚假單胞菌Hcp重組復性蛋白包被酶標板，4 ℃過夜，PBST 洗滌后加入5%脫脂牛奶封閉，PBST 洗滌3 次，加入擴增的噬菌體100 μL·孔-1，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌加入1∶5 000 稀釋的HRP/anti-M13 單抗，100 μL·孔-1，37 ℃孵育 1 h，PBST洗滌后根據TMB顯色試劑盒說明書，用酶標儀(Multiskan FC，中國上海)測定其在450 nm 處吸光值，選取Ag-NC>0.5的噬菌體進行序列測定。

表1 每輪的淘選條件

1.3 單鏈抗體重組質粒的構建

根據篩選出的單鏈抗體Hcp-scFv序列使用Primer Premier5.0軟件設計特異性引物，分別在上下游引物的5′端和3′端引入酶切位點，PCR擴增引物見表2。

表2 Hcp-scFv PCR擴增引物

從篩選出的噬菌體中提取質粒并進行PCR 擴增。PCR擴增反應體系(25 μL)：2.5 μL的10×Reaction buffer，2 μL dNTPs(2.5 mmol·L-1)，1 μL模板DNA，上下游引物(10 pmol·L-1)各0.25 μL，0.25 μLTaq酶，超純水補足至25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收目的條帶。將目的條帶與表達載體pEASY-T連接，連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，送生工生物工程(上海)有限公司測序，運用DNAMAN 7.0軟件對測序獲得基因序列進行比對分析。

將測序準確的Hcp-scFv基因序列與表達載體pET-30a(+)進行連接，構建重組質粒，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布LB/Amp板篩選陽性克隆，37 ℃培養(yǎng)箱18～24 h，挑取單菌落進行菌落PCR 驗證，取PCR 結果呈陽性的重組子培養(yǎng)后進行質粒提取和雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質粒pET-30a-Hcp-scFv送至生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.4 重組蛋白的小量誘導表達

將測序正確的重組質粒pET-30a-Hcp-ScFv轉化至大腸桿菌BL(DE3)pLysS表達感受態(tài)細胞，涂布于含有氯霉素(CHL)和卡那霉素(Kn)的Luria-Bertani(LB)平板培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，挑取單克隆接種于5 mL LB(含Kn和CHL各5 μL)液體培養(yǎng)基，37℃搖振培養(yǎng)，12～16 h后吸取50 μL菌液轉接至5 mL LB(含Kn和CHL各5 μL)液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1搖振培養(yǎng)，當菌液濃度 OD600為0.6～0.8時，添加Isopropyl β-D-Thiogalactoside(IPTG)至終濃度為0.4 mmol·L-1，30 ℃誘導表達，同時設pET-30a(+)空載體轉化菌為空白對照。收集菌液離心后取沉淀，加入適量蛋白裂解液(8 mol·L-1Urea，0.1 mol·L-1NaH2PO4，0.01 mol·L-1Tris-Cl，pH=8.0)，30 ℃、180 r·min-1裂解，離心取上清進行SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達情況。

取經重組蛋白小量誘導表達驗證后的重組菌，接種于5 mL LB(含Kn和CHL各 5 μL)液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)。12～16 h后按 1∶100 轉接至 200 mL LB(含Kn和CHL各 200 μL)液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)并誘導表達。將大量誘導表達的菌液于 4 ℃、7 000 r·min-1離心5 min，PBS緩沖液洗滌沉淀2次，加入10 mL上樣緩沖液(0.02 mol·L-1Tris-Hcl，0.25 mol·L-1NaCl，pH=8.0)和10 mg溶菌酶，冰浴上超聲破碎30 min，4 ℃、14 000 r·min-1離心，收集上清液(A)。沉淀中加入10 mL蛋白裂解液(8 mol·L-1Urea，0.1 mol·L-1NaH2PO4，0.01 mol·L-1Tris-Cl，pH=8.0)，30 ℃、180 r·min-1裂解，14 000 r·min-1離心，收集上清液(B)。取上清液(A)和上清液(B)進行SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達情況。

1.5 重組蛋白純化及Western Blot鑒定

大量誘導表達的菌液于 4 ℃、7 000 r·min-1離心，用PBS緩沖液洗滌沉淀2次，用Ni-Denature-urea緩沖液(8 mol·L-1Urea，0.02 mol·L-1NaH2PO4，0.3 mol·L-1NaCl，pH=8.0)重懸沉淀，30 ℃、180 r·min-1裂解2～3 h，冰浴上超聲破碎，4 ℃、14 000 r·min-1離心，取上清。使用0.45 μm濾膜過濾上清液，按照Ni-IDA-Sefinose Colum純化柱(Ni-IDA-6FF，中國上海)說明書進行重組蛋白純化。

取純化蛋白進行SDS-PAGE電泳，采用半干法轉至PVDF膜，加入5 %BSA，4 ℃封閉過夜，次日37 ℃封閉1 h，PBST洗滌3次后加入用PBST稀釋的His-Tag小鼠單抗(His-Tag小鼠單抗：PBST=1∶200)，37 ℃反應2 h；PBST洗滌3次后加入用PBST稀釋的HRP/山羊抗鼠IgG(HRP/山羊抗鼠IgG∶PBST=1∶1 000)，37 ℃反應1 h，使用ECL化學發(fā)光試劑顯色2 min，用大量純凈水沖洗PVDF膜終止反應，觀察目的條帶。

2 結果與分析

2.1 單鏈抗體Hcp-scFv的篩選

2.1.1 抗殺香魚假單胞菌溶血素共調節(jié)蛋白單鏈抗體Hcp-scFv的富集淘選

以復性純化的殺香魚假單胞菌Hcp重組蛋白為抗原，從天然兔噬菌體抗體庫中篩選Hcp的單鏈抗體，總共經過4輪淘洗篩選富集。比較4輪噬菌體的回收率，第1輪的回收率是1.06×10-7%、第4輪回收率為4.44×10-6%，約是第一輪的42倍(圖1，表3)，表明能與靶分子特異性結合的噬菌體得到了有效的富集。

表3 淘選結果

圖1 第4輪篩選出的噬菌體滴度測定圖

2.1.2 Phage-ELISA 鑒定陽性噬菌體克隆

從第4輪洗脫物滴度測定的平板上挑取了96個噬菌體陽性單克隆和96個陰性單克隆，通過Phage-ELISA方法，包被復性的Hcp重組蛋白進行噬菌體克隆的特異性檢測(表4)。以 Ag-NC>0.5為判斷標準，篩選出陽性克隆，對獲得的陽性克隆進行擴增并提取噬菌粒，通過Sanger法測序獲得scFv基因序列，用DNAMAN軟件對獲得的序列進行比對分析，刪除重復序列，最后共篩選出16個scFv基因(圖2)。根據陽性克隆的OD450值，選擇OD450值高的scFv，分別命名為A5、F11、D2、D10、G5、G8、H12，進行下一步實驗，序列長度及編碼的蛋白預測分子量見表 5。

表5 Hcp-scFv的基因序列長度及編碼蛋白預測分子量

圖2 陽性克隆ELISA驗證結果

表4 第4輪洗脫噬菌體單克隆驗證ELISA的OD450值

2.2 重組質粒pET-30a-Hcp-scFv的構建

在A5、F11的上下游引物中分別加入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切位點，G5、G8、D2、D10、H12的上下游引物分別加入Nco Ⅰ和Not Ⅰ酶切位點，以提取的噬菌粒為模板，經PCR擴增，2%瓊脂糖電泳觀察，顯示7個菌株均擴增得到約750 bp 的scFv 目的片段，擴增條帶大小與目的基因大小一致(圖3，圖4)。將PCR產物克隆于載體pEASY-T中，挑取陽性克隆擴增培養(yǎng)后測序，使用DNAMAN 7.0軟件對測序結果進行分析比對，與預期結果相符。將經限制性內切酶雙酶切回收后的目的scFv片段與經對應限制性內切酶雙酶切的表達載體pET-30a(+)連接，構建重組質粒pET-30a-Hcp-scFv，轉化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞。挑取陽性克隆提取質粒后進行雙酶切鑒定，酶切結果如圖5、圖6所示，與預期相符，表明重組質粒pET-30a-Hcp-ScFv構建正確。

圖3 scFv A5、F11基因的PCR擴增

圖4 scFv G5、G8、D2、D10、H12基因的PCR擴增

圖5 重組質粒pET-30a-Hcp-scFv的雙酶切鑒定

圖6 重組質粒pET-30a-Hcp-scFv的雙酶切鑒定

2.3 重組蛋白的小量誘導表達及可溶性分析

陽性重組質粒轉化至感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)pLysS后小量誘導表達后，進行SDS-PAGE 檢測，結果如圖7所示，重組菌H12表達不穩(wěn)定，重組菌 A5、F11、G5、G8、D2、D10在約33 kDa處都有一特異性蛋白條帶，與預測的分子量一致。作為對照的未經誘導重組菌和誘導的空載體pET-30a(+)轉化菌均無特異性條帶，可見重組質粒在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS得到了表達。經小量誘導表達實驗，H12表達不穩(wěn)定，故選擇A5、F11、G5、G8、D2、D10做下一步實驗。收集培養(yǎng)菌體超聲裂解，離心后分別取等量上清液和沉淀，通過SDS-PAGE檢測目的蛋白的可溶性，結果如圖8～圖10所示：重組菌F11、G8、D2、D10在沉淀裂解產物中有目標條帶，故F11、G8、D2、D10以包涵體形式存在，重組菌A5、G5在上清液和沉淀裂解產物均有條帶，但沉淀裂解產物蛋白含量明顯高于上清液，說明A5、G5主要以包涵體形式存在。

圖7 pET-30a-Hcp-scFv的誘導表達

圖8 A5、F11的誘導表達

圖9 G5、G8的誘導表達

圖10 D2、D10的誘導表達

2.4 重組蛋白的純化及Western Blot驗證

收集大量誘導表達的重組菌，使用Buffer B緩沖液(尿素：480g·L-1，NaH2PO412 g·L-1, pH:8)對菌體進行裂解，經超聲破碎后離心取上清液，用SDS-PAGE電泳觀察目的蛋白表達情況。因表達的目的蛋白帶有多聚組氨酸標簽(His-tag)，可以利用親和柱分離目的蛋白，獲得的純化蛋白進行SDS-PAGE電泳，結果與預期目標一致，見圖11。本實驗使用目的蛋白上帶有 His-tag對應的鼠一抗和山羊抗鼠二抗進行Western Blot，以檢測目的蛋白與殺香魚假單胞菌Hcp重組蛋白抗原結合能力。結果顯示，如圖12所示，目的蛋白與His-Tag鼠單抗發(fā)生特異性反應顯示棕色，與SDS-PAGE電泳實驗條帶位置一致，證明該重組蛋白純化后結構完整，說明殺香魚假單胞菌Hcp重組蛋白的scFv 在大腸桿菌 BL21(DE3)pLysS中可以有效表達，通過純化、透析得到的是有生物活性的目的蛋白。

圖11 pET-30a-Hcp-ScFv的純化

圖12 pET-30a-Hcp-ScFv的Western Blot分析結果

3 討論

細菌的分泌系統(tǒng)是病原菌逃避宿主免疫清除的關鍵[10]，Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)存在于許多革蘭氏陰性菌的毒力島中，研究證實 T6SS分泌系統(tǒng)是假單胞菌分泌毒力的關鍵因子[11]。而溶血素共調節(jié)蛋白(Hcp)是病原菌對靶細胞產生生物學效應的重要的效應蛋白，被認為是T6SS的分子標志[12]。WANG等[13]用針對嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)制備的重組Hcp疫苗免疫鯉(Cyprinuscarpio)，在攻毒實驗中經免疫的鯉存活率明顯提高。本研究以殺香魚假單胞菌Hcp為抗原，從兔天然噬菌體文庫中篩選出了針對殺香魚假單胞菌Hcp的特異性scFv，并在E.coli系統(tǒng)中獲得大量穩(wěn)定表達，最終獲得6個目的蛋白抗體，后續(xù)可以用于研究和開發(fā)以此為基礎的大黃魚內臟白點病診斷和檢測試劑盒，因此，本研究具有重要的理論意義和實際應用價值。

本文構建的7個重組子中，含A5、F11、G5、G8、D2、D10 的6個重組子在IPTG終濃度為0.4 mmol·L-1、30℃條件下誘導表達，都獲得了大量穩(wěn)定表達的重組蛋白。而H12重組質粒酶切鑒定結果雖與預期一致，但重組子誘導表達不穩(wěn)定，使用DNAMAN軟件對H12編碼的氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)H12的基因序列中帶有AGA、AGC、CGA等稀有密碼子。有研究表明，稀有密碼子的存在尤其是連續(xù)的稀有密碼子可以降低蛋白質的翻譯速率[14]。王光強[15]通過引入稀有密碼子的方法成功抑制了耐熱半乳糖苷酶的分泌表達，證明稀有密碼子的存在會對蛋白表達產生影響，推測H12基因中稀有密碼子的存在導致了H12重組子不穩(wěn)定表達。

His 標簽(His-tag)又稱多組氨酸標簽，由6～10 個連續(xù)的組氨酸殘基組成，因His標簽結構較小，對目的蛋白可溶性和生物學功能幾乎沒有影響。用His-tag制備的單抗可用來鑒定目的蛋白的相對表達量、分子量及目的蛋白在細胞中的定位。本實驗中所用的表達載體pET-30a(+)帶有His-Tag，利用這一特點，對實驗獲得的6個目的蛋白使用His-tag鼠單抗進行Western Blot驗證，結果表明His-tag單抗能夠特異性識目的蛋白。本研究中獲得的6個重組蛋白大部分是以不可溶的包涵體形式存在，下一步將開展蛋白復性等研究，進一步提高重組蛋白針對殺香魚假單胞菌的抗體活性。

噬菌體展示技術是一種高通量篩選技術，它依賴于細胞內基因的表達，受限于所建噬菌體展示文庫大小，淘選目標抗體時會出現(xiàn)非特異性吸附現(xiàn)象，但是它不需要免疫動物即可獲得大量目的抗體，耗時短且成本低，逐漸成為當前應用廣泛的篩選技術之一[16-17]?；谠摷夹g的scFv是一種最小的功能性抗體片段單元，分子大小僅為完整抗體的1/6，但可以保持抗體親和性和特異性[18]。隨著噬菌體展示技術的創(chuàng)建和發(fā)展，研究者可通過與相應靶抗原的富集從抗體庫中快速高效地獲取特異性抗體。理論上抗體庫庫容達到107pfu，便能夠識別99%的抗原決定簇，而天然噬菌體抗體庫的多樣性至多可以達到1012pfu，幾乎可以篩選到各種目標抗體[19]。孫麗娜等[20]用純化的H5N1禽流感凝血素蛋白對容量為5×109的人源天然抗體庫進行3輪淘選，獲得的5株單鏈抗體均與H5N1禽流感凝血素蛋白特異性結合，且與甲1型和甲3型人流感病毒無交叉反應。本實驗中的兔天然噬菌體scFv文庫容量為1010pfu，通過4輪淘洗獲得目標抗體，對富集的scFv進行ELISA驗證，最終獲得16株具有高特異性的scFv，表明該文庫容量滿足本實驗要求。本研究實現(xiàn)了殺香魚假單胞菌Hcp高特異性scFv 在大腸桿菌中的高效表達，為基因工程抗體制劑應用于大黃魚病害的免疫防治與病原菌ELISA 檢測試劑盒等的研制奠定了基礎。