蘇璇，方瑜，方穎，劉璐瑤，李飛燕，馮蕊，褚凌渺，左澤濤，金岳龍，孫恩濤

1.皖南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院

疥螨目螨類完整的線粒體基因組通常包含13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因，在一些種類的疥螨目螨類中有tRNA基因丟失的報(bào)道[1]。疥螨目螨類線粒體基因組中多數(shù)tRNA基因的長(zhǎng)度較短（平均為54 bp），且具有缺乏T-臂或D-臂的非典型結(jié)構(gòu)，無法形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)[2]，這為其tRNA基因的注釋增添了難度。因此，在疥螨目螨類線粒體基因組預(yù)測(cè)過程中，tRNA基因可能會(huì)被遺漏[3]。歐亞鴝特魯螨（Trouessartia rubecula）屬于疥螨目（Sarcoptiformes）無氣門股（Astigmatina）羽螨總科（Analgoidea），是一種棲息在歐洲知更鳥羽毛上的羽螨。Esteban[4]首次對(duì)歐亞鴝特魯螨線粒體全序列進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)歐亞鴝特魯螨缺失了5個(gè)tRNA基因，分別為trnA、trnE、trnI、trnY和trnV基因。為了確認(rèn)歐亞鴝特魯螨線粒體tRNA基因是否丟失，本研究采用了一套完整的注釋流程重新對(duì)歐亞鴝特魯螨線粒體tRNA基因進(jìn)行注釋。

1 材料與方法

1.1 rRNA的確定 基于高度保守的基因序列基序，通過NCBI的BLASTn[5]搜索識(shí)別出rrnL（16S核糖體RNA，16S ribosomal RNA）和rrnS（12S核糖體RNA，12S ribosomal RNA）。將這些基因的5” 端緊跟在上游基因的3” 端之后，將rRNA的3” 端緊跟在下游基因的前面，兩者之間沒有間隙[6]。

1.2 “丟失”tRNA的確定 采用圖1中的注釋方法，使用MITOS[7]、tRNAscan-SE[8]、ARWEN[9]和MITOS2（http://mitos2.bioinf.uni-leipzig.de）預(yù)測(cè)tRNA基因。若以上軟件注釋了所有tRNA基因，則進(jìn)入人工序列檢查。

圖1 tRNA基因注釋的工作流程

對(duì)上述程序預(yù)測(cè)的tRNA基因進(jìn)行人工檢查[2]，確保注釋的tRNA其一級(jí)序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)與近緣種相比均高度保守。在通過人工序列檢查排除了軟件錯(cuò)誤預(yù)測(cè)的tRNA基因之后，若軟件注釋的所有tRNA基因正確，則流程結(jié)束。若上述程序未能正確預(yù)測(cè)tRNA基因或未注釋全部tRNA基因，本研究使用蛋白質(zhì)編碼區(qū)之間的序列作為模板，允許基因之間少量的重疊。隨后，在模板區(qū)域基于近緣種反密碼子環(huán)和反密碼子臂進(jìn)行人工手動(dòng)查找[10]，通過分析tRNA基因反密碼子、二級(jí)結(jié)構(gòu)與它們的近緣種核苷酸序列進(jìn)行手動(dòng)比對(duì)，確保其一級(jí)序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)均高度保守。從Vienna RNA安裝包（v2.3.3）中使用RNAeval分別計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小自由能（minimum free energy,MFE）[11]，選擇出最穩(wěn)定的tRNA基因二級(jí)結(jié)構(gòu)（首選MFE最低）[5]。

首先使用MITOS[7]進(jìn)行基因注釋，預(yù)測(cè)到3個(gè)tRNA基因：trnY、trnI和trnE。接著使用tRNAscan-SE[8]、ARWEN[9]和MITOS2等tRNA預(yù)測(cè)程序進(jìn)行注釋。tRNAscan-SE未預(yù)測(cè)到缺失的tRNA基因；MITOS2未預(yù)測(cè)到缺失的tRNA基因；ARWEN預(yù)測(cè)到3個(gè)tRNA基因：trnE、trnA、trnV，見表1。對(duì)于程序預(yù)測(cè)的結(jié)果，本研究進(jìn)行了人工序列檢查，成功找回了歐亞鴝特魯螨線粒體基因組“缺失”的5個(gè)tRNA基因。

表1 預(yù)測(cè)程序預(yù)測(cè)的tRNA基因

1.2.1trnY和trnI基因 經(jīng)人工序列檢查后，MITOS預(yù)測(cè)的trnY、trnI基因一級(jí)序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)均高度保守，故采用。

1.2.2trnE基因 MITOS預(yù)測(cè)的trnE基因位于12 785～12 841 bp，氨基酸接受臂長(zhǎng)度為7 bp；ARWEN預(yù)測(cè)的trnE基因位于12 786～12 840 bp，在5” 端和3” 端各縮短1 bp，氨基酸接受臂長(zhǎng)度為6 bp。由于螨類通常的tRNA基因氨基酸接受臂長(zhǎng)度為7 bp[5]，因此，本研究選擇了MITOS預(yù)測(cè)的結(jié)果。

1.2.3trnA和trnV基因 ARWEN預(yù)測(cè)的trnA基因位于正鏈4 536～4 588 bp，與trnC基因（4 531～4 583 bp）重合，其最小自由能（MFE）為0.60。ARWEN預(yù)測(cè)的trnV基因位于正鏈9 515～9 578 bp，與nad4基因（8 360～9 659 bp）完全重合，并且其反密碼子環(huán)及反密碼子臂與其他無氣門股已測(cè)序螨類差異較大，最小自由能（MFE）為99 997.60。因此本研究對(duì)于這2個(gè)基因重新進(jìn)行了人工手動(dòng)查找。通注：用灰色陰影表示保守核苷酸，反密碼子采用加粗字體表示，在臂（受體臂、D臂、反密碼子臂和T臂）上配對(duì)的核苷酸都標(biāo)注了下劃線。對(duì)比的序列來自Aleuroglyphus ovatus（Ao）、Caloglyphus berlesei（Cb）、Rhizoglyphus robini（Rr）、Ardeacarus ardeae（Aa）、Dermatophagoides farinae（Df）、Trouessartia rubecula(Tr）。過分析其反密碼子和二級(jí)結(jié)構(gòu)，并與它們?cè)跓o氣門股中的近緣種進(jìn)行手動(dòng)比對(duì)注釋[12]，確保其tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出高度的相似性，見表2。最后根據(jù)最小自由能（MFE）確認(rèn)二級(jí)結(jié)構(gòu)。圖2為trnA和trnV基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖。

圖2 ARWEN與人工注釋的trn A和trn V基因二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比圖

表2 6種無氣門股螨類線粒體trn A和trn V基因的核苷酸序列比對(duì)

2 結(jié)果

2.1 tRNA基因 MITOS預(yù)測(cè)的trnY基因處于正鏈，位于trnP和trnK基因之間，二級(jí)結(jié)構(gòu)缺少配對(duì)的D-臂，呈D-loop結(jié)構(gòu)，其最小自由能（MFE）為-12.40。MITOS預(yù)測(cè)的trnI基因在負(fù)鏈上，位于trnQ基因和nad2基因之間，其最小自由能（MFE）為-12.30，trnI基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)缺失T-臂和配對(duì)的莖，呈TV-loop結(jié)構(gòu)。MITOS預(yù)測(cè)trnE基因在負(fù)鏈上，位于nad2基因和cob基因之間，其最小自由能（MFE）為-8.20。以上3個(gè)tRNA基因（trnY、trnI、trnE基因）均存在一定程度的堿基錯(cuò)配，并以G·U弱配對(duì)為主，其一級(jí)序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)均與其他無氣門股已測(cè)序螨類高度保守。人工手動(dòng)查找的trnV基因和trnA基因位于正鏈上，二級(jí)結(jié)構(gòu)缺少配對(duì)的D-臂，呈D-loop結(jié)構(gòu)，而且推斷的T-臂非常短（僅1～2 bp配對(duì)的臂），這種現(xiàn)象在本研究預(yù)測(cè)的trnY基因中也被發(fā)現(xiàn)。重新注釋的5個(gè)tRNA基因位置見表3。

2.2 rRNA基因 未重新注釋前的rrnL基因只有650 bp，相較于其他無氣門股螨類的rrnL基因長(zhǎng)度較短。重新注釋后的rrnL基因長(zhǎng)度為999 bp，rrnS基因長(zhǎng)度也由之前的623 bp變?yōu)?62 bp，見表3。rrnS基因和rrnL基因的A/T堿基含量分別為72.81%和76.68%，其中rrnS基因位置在trnN與trnV之間，rrnL基因位置在trnV與trnW之間。

2.3 蛋白質(zhì)編碼基因 重新注釋的線粒體基因組蛋白質(zhì)基因序列位置與之前的排列方式相同，各基因所在位置見表3。

表3 歐亞鴝特魯螨線粒體基因組重新注釋后基因序列表格

3 討論

有關(guān)甲螨亞目基因的研究中，Domes[9]等首次報(bào)道大蓋卷甲螨（Steganacarus magnus）的線粒體基因組全序列，22個(gè)tRNA基因中有16個(gè)缺失。Klimov和O” connor[12]重新注釋了trnW和trnS2兩個(gè)tRNA基因；Edwards等[13]重新注釋了3個(gè)缺失的tRNA基因（trnG、trnS1和trnE）；Sch?ffer等[3]重新注釋了大蓋卷甲螨的12個(gè)tRNA基因，而薛曉峰等[14]利用tRNAscan-SE、ARWEN和基于反密碼子和二級(jí)結(jié)構(gòu)的人工注釋，認(rèn)為大蓋卷甲螨具有完整的22個(gè)tRNA基因，并未存在丟失。Sch?ffer等[3]對(duì)一種甲螨Paraleius leontonychus測(cè)序發(fā)現(xiàn)，缺少兩個(gè)tRNA基因（trnG和trnY）；詹雪冰等[1]通過tRNAscan-SE、ARWEN、MITOS和MITOS2結(jié)合人工注釋的方法發(fā)現(xiàn)疥螨目盛若甲螨線粒體基因組也擁有22個(gè)tRNA基因，說明tRNA基因的缺失在疥螨目中并不普遍。在無氣門股基因的研究中，tRNA基因的丟失也是長(zhǎng)期以來被關(guān)注的問題。在疥螨科的Sarcoptes scabiei中有2個(gè)tRNA基因（trnA和trnY）缺失，隨后被薛曉峰等[14]通過重新注釋和分析找回。在粉螨科的食酪螨屬中，首次報(bào)道的腐食酪螨和長(zhǎng)食酪螨缺失3個(gè)tRNA基因（trnF、trnS1和trnQ），薛曉峰等[14]重新注釋找回了丟失的trnF和trnS1基因。在此基礎(chǔ)上，薛曉峰等[14]不支持疥螨目中線粒體tRNA基因的缺失，詹雪冰等[1]也認(rèn)為tRNA基因的丟失在甲螨亞目中并不普遍。前期研究發(fā)現(xiàn)，通過重新測(cè)序腐食酪螨和首次報(bào)道范張食酪螨的線粒體基因組全序列，都擁有完整的22個(gè)tRNA基因[15-16]。線粒體基因組中存在的tRNA基因?qū)€粒體翻譯系統(tǒng)至關(guān)重要，22個(gè)tRNA基因中的任何一個(gè)的缺失都會(huì)嚴(yán)重影響翻譯系統(tǒng)[1]。目前相關(guān)研究均不支持疥螨目tRNA基因的丟失。

在所有已發(fā)表的無氣門股線粒體基因組中均發(fā)現(xiàn)了截?cái)嗟膖RNA[6,8]，此外，無氣門股線粒體基因組tRNA基因的莖中經(jīng)常發(fā)生不匹配，這兩點(diǎn)都增加了無氣門股線粒體tRNA基因的預(yù)測(cè)難度。tRNA基因的檢測(cè)和注釋一直以來都是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的問題，不同的方法對(duì)tRNA基因的非典型二級(jí)結(jié)構(gòu)有不同的預(yù)測(cè)潛力，使用不同類型和數(shù)量的tRNA預(yù)測(cè)方法會(huì)導(dǎo)致注釋結(jié)果存在差異。因此，大量專門的tRNA基因預(yù)測(cè)工具被開發(fā)[17]。在這些預(yù)測(cè)工具中，tRNAscan-SE基于尋找的完整三葉草結(jié)構(gòu)，不適合處理高度分化的序列[18]。ARWEN首先只識(shí)別出最保守的結(jié)構(gòu)域，即反密碼子莖，隨后進(jìn)行可能的D-臂和T-臂結(jié)構(gòu)的評(píng)估，以及尋找一個(gè)受體莖，然后提供特異性[9]。但ARWEN的敏感性以評(píng)分閾值的降低和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率增多為代價(jià)而增加，不能排除假基因被確定為tRNA基因的可能性[19]。MITOS和MITOS2預(yù)測(cè)的tRNA基因二級(jí)結(jié)構(gòu)通常沒有最小的自由能，因?yàn)榍o中存在核苷酸不匹配或截?cái)嗟亩?jí)結(jié)構(gòu)[19]。本研究使用這四種程序預(yù)測(cè)歐亞鴝特魯螨線粒體tRNA基因時(shí)，MITOS預(yù)測(cè)的3個(gè)“缺失”tRNA基因都具有較高的保守性和穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而ARWEN預(yù)測(cè)的3個(gè)“缺失”tRNA基因在反密碼子莖上呈現(xiàn)出較高的保守性。首次報(bào)道的歐亞鴝特魯螨線粒體基因組序列采用MITOS2直接注釋，這可能是本研究未能使用MITOS2尋找到“丟失”tRNA基因的原因。tRNAscan-SE未能發(fā)現(xiàn)“缺失”的tRNA，這可能由于無氣門股中截?cái)嗟膖RNA難以滿足tRNAscan-SE所要求的完整三葉草結(jié)構(gòu)。上述四種預(yù)測(cè)程序中，MITOS的注釋結(jié)果最為可靠，但是仍舊難以獲得完整的tRNA基因。對(duì)于截?cái)嗟膖RNA基因的注釋中單獨(dú)使用以上的某一種工具或程序通常不能完整地獲得所有的tRNA基因，容易出現(xiàn)錯(cuò)誤。歐亞鴝特魯螨線粒體基因組序列5個(gè)tRNA基因的“缺失”可能是由于使用單一的預(yù)測(cè)程序和缺乏人工序列檢查，而尋找更加全面的注釋tRNA基因的流程有助于解決這一問題。

本研究重新注釋并分析了歐亞鴝特魯螨線粒體基因組全序列，采用一套完整的無氣門股螨類線粒體基因組tRNA基因注釋流程，找回了先前報(bào)道的在歐亞鴝特魯螨線粒體基因組中“丟失”的trnA、trnE、trnI、trnV和trnY基因。這種預(yù)測(cè)流程減少了單一程序預(yù)測(cè)以及注釋程序本身預(yù)測(cè)方法所導(dǎo)致的偏差，使tRNA注釋結(jié)果更為準(zhǔn)確。本研究結(jié)果并不支持無氣門股螨類線粒體基因組tRNA基因的丟失。無氣門股線粒體基因組序列的進(jìn)一步研究將有助于驗(yàn)證這種“丟失”的tRNA是真正缺失還是由于高度非典型結(jié)構(gòu)而未被一些軟件程序檢測(cè)到。