甘肅省牛和羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥性分析

吳 克，趙學(xué)亮，馮 航，王晨驍，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens，C.perfringens)是一種有莢膜、產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性厭氧菌，菌體呈粗短桿狀，廣泛存在于各種動(dòng)物的胃腸道及土壤、河流等自然環(huán)境當(dāng)中[1-2]。該菌在適宜的條件下生長(zhǎng)繁殖迅速，且能夠產(chǎn)生20余種毒素，根據(jù)是否產(chǎn)生α、β、ι、ε、CPE、NetB等毒素可以將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A～G 7個(gè)毒素型[3-4]。

作為一種重要的人畜共患病原菌，不同毒素型產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠造成人和動(dòng)物的多種疾病[5-6]。F型產(chǎn)氣莢膜梭菌可導(dǎo)致人類發(fā)生食源性疾病,在發(fā)達(dá)國(guó)每年可導(dǎo)致上百萬人食物中毒，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[7-9]。此外，產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病在我國(guó)牛、羊養(yǎng)殖中也時(shí)有發(fā)生，造成牛羊猝死和生產(chǎn)性能降低。A型、E型和F型產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠引起犢牛和羔羊的腸毒血癥，B型、C型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠造成羔羊痢疾和犢牛的出血性腸炎[10]。鑒于目前我國(guó)對(duì)牛、羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌的研究較少，牛、羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌的臨床用藥缺乏理論參考，本次研究對(duì)采集自甘肅省規(guī)?；曫B(yǎng)場(chǎng)的牛、羊源肛拭子進(jìn)行了產(chǎn)氣莢膜梭菌分離鑒定和耐藥性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 229份牛羊源肛拭子于2019年采集于自甘肅省定西市(DX)、臨夏州(LX)和天水市(TS)規(guī)?；?、羊養(yǎng)殖場(chǎng)，樣品采集后保存于運(yùn)輸培養(yǎng)基，12 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定。

1.1.2 主要試劑及儀器 細(xì)菌培養(yǎng)96孔板，廣州潔特生物過濾股份有限公司產(chǎn)品；胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)培養(yǎng)基、厭氧肉肝湯培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR StarMix，為北京Genstar生物科技有限公司產(chǎn)品；藥品，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；厭氧培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離鑒定 自含有牛、羊肛拭子的運(yùn)輸培養(yǎng)基中吸取50 μL液體接種于厭氧肉肝湯中，37 ℃培養(yǎng)18 h，取渾濁菌液接種于TSC培養(yǎng)基，置于厭氧箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。取TSC培養(yǎng)基上黑色菌落接種于50 mL/L脫纖維綿羊血瓊脂平板厭氧培養(yǎng)24 h，挑取血平板上有溶血環(huán)的菌落對(duì)其16S rRNA序列進(jìn)行PCR鑒定，并將PCR產(chǎn)物送至西安擎科澤西生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序鑒定。

1.2.2 分離菌株毒素基因檢測(cè) 毒素基因cpa、cpb、etx、itx、cpe、netB、cpb2的特異引物見表1，送至西安擎科澤西生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。水煮法提取菌株DNA，毒素基因cpa、cpb、etx、itx采用多重PCR,50 μL體系：25 μL 2×Mix預(yù)混液，cpa、cpb、etx、itx毒素上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL,雙蒸水補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，51.6 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。cpe、netB、cpb2采用單項(xiàng)PCR，20 μL體系：10 μL 2×Mix預(yù)混液，上、下游引物各1 μL，模版DNA 1 μL,雙蒸水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，54 ℃1 min，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min[11]。

表1 毒素基因PCR引物

1.2.3 分離菌株藥敏試驗(yàn) 通過微量肉湯稀釋法測(cè)定產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株對(duì)選用抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)，在細(xì)菌用96孔板每孔加入50 μL CAMHB，并將青霉素、阿莫西林、氨芐西林、四環(huán)素、頭孢他啶、萬古霉素、氯霉素、美羅培南進(jìn)行梯度稀釋。血平板上刮取產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落，生理鹽水稀釋為麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的菌液。每60 μL菌液與5 mL藥敏接種培養(yǎng)液混合均勻后，按照每孔50 μL加入96孔細(xì)菌培養(yǎng)板，置于厭氧培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h。通過觀察96孔細(xì)菌培養(yǎng)板內(nèi)產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)菌株對(duì)所選抗菌藥物的MIC值，并根據(jù)CLSI抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)，判斷試驗(yàn)菌株對(duì)所選抗菌藥物耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 分離鑒定結(jié)果

170份羊源和59份牛源肛拭子中分離出25株和28株疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株，分離菌株在TSC培養(yǎng)基上為黑色邊緣整齊的圓形菌落，在血平板上為周圍有單溶血環(huán)或雙溶血環(huán)的半透明小菌落。鏡檢觀察，分離菌株為革蘭氏陽性邊緣整齊的中等大小桿菌(圖1)，16S rRNA PCR產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)顯示所分離菌株均為產(chǎn)氣莢膜梭菌(圖2)。本次試驗(yàn)牛羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌總分離率為23.1%，牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離率為47.5%，羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離率為14.7%。

A.分離菌株菌落(TSC培養(yǎng)基)；B.分離菌株菌落(血平板)；C.分離菌株鏡檢觀察(1 000×)A.Colonies of the isolates on TSC agar; B.Colonies of the isolates on blood agar; C.Microscopic observation of the isolates(1 000×)

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～7.樣品；-.陰性對(duì)照；+陽性對(duì)照

2.2 毒素基因鑒定

經(jīng)鑒定，53株產(chǎn)氣莢膜梭菌全都含cpa毒素基因，36株含有cpb2毒素基因，未檢測(cè)到毒素基因cpb、etx、cpe、itx和netB，本次試驗(yàn)所分離53株產(chǎn)氣莢膜梭菌均為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.3 分離菌株MIC分布

藥敏試驗(yàn)用53株產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)美羅培南、萬古霉素、阿莫西林MIC集中于≤0.06 μg/mL～0.5 μg/mL，對(duì)青霉素與氨芐西林的MIC值集中于≤0.06 μg/mL～1 μg/mL，對(duì)氯霉素的MIC集中于0.25 μg/mL～2 μg/mL，對(duì)頭孢他啶的MIC在≤0.25 μg/mL～8 μg/mL散在分布，對(duì)四環(huán)素的MIC值在≤0.25 μg/mL～32 μg/mL散在分布。53株產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)美羅培南、阿莫西林、萬古霉素、頭孢他啶、氯霉素均敏感，對(duì)青霉素和氨芐西林分別有11(20.8%)株和7(13.2%)株中介菌，對(duì)四環(huán)素有8(15.1%)株中介菌和13(24.5%)株耐藥菌。牛源(28)與羊源(25)產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)四環(huán)素的耐藥菌株為9株和4株，耐藥率分別是36%和14.3%。

2.4 四環(huán)素耐藥菌株進(jìn)化樹分析

本研究中四環(huán)素耐藥菌株(DX、LX、TS)，與日本(JCM)、美國(guó)(BB、SG、MOTB、MOTT)、韓國(guó)(KSJ)的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株16S rRNA序列同源性分析可見，我國(guó)甘肅省產(chǎn)氣莢膜梭菌與日本、美國(guó)、韓國(guó)之間產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株同源性很低。但甘肅省定西市(DX)、臨夏州(LX)、天水市(TS)之間的四環(huán)素耐藥產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株之間具有較高的同源性(圖3)。

圖3 四環(huán)素耐藥產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)化樹分析

3 討論

本研究自229份牛、羊源肛拭子中分離到53(23.1%)株產(chǎn)氣莢膜梭菌，表明產(chǎn)氣莢膜梭菌在甘肅省牛、羊養(yǎng)殖中具有一定程度的流行。所分離的53株產(chǎn)氣莢膜梭菌均屬于A型產(chǎn)氣莢膜梭菌，且牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離率(47.5%)高于羊源(14.7%)，說明A型產(chǎn)氣莢膜梭菌在所有產(chǎn)氣莢膜梭菌中占據(jù)最大比例，且牛比羊更易攜帶產(chǎn)氣莢膜梭菌，這可能導(dǎo)致牛受到產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病危害的風(fēng)險(xiǎn)性高于羊。

本次試驗(yàn)中，分離菌株對(duì)cpb2毒素基因的攜帶率達(dá)68%。CPB2毒素作為與胃腸道疾病密切相關(guān)的毒素，在多起產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的胃腸道疾病中被檢測(cè)到[12-14]，cpb2毒素基因在甘肅省牛、羊中的高水平流行應(yīng)在產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病的防控中引起重視。

本次研究發(fā)現(xiàn)甘肅省牛、羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)青霉素、氨芐西林出現(xiàn)一定比例的中介菌株，分別為20.8%和13.2%，具有一定規(guī)模出現(xiàn)相應(yīng)耐藥菌株，并通過牛、羊產(chǎn)品傳播給人類的風(fēng)險(xiǎn)。甘肅省牛、羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌主要對(duì)四環(huán)素耐藥，且牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率(36%)高于羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)四環(huán)素耐藥率(14.3%)，可以反映出甘肅省在牛飼養(yǎng)過程中對(duì)四環(huán)素的應(yīng)用比羊頻繁，且四環(huán)素耐藥菌株間的高同源性，揭示了甘肅省內(nèi)不同地區(qū)牛、羊養(yǎng)殖中四環(huán)素耐藥產(chǎn)氣莢膜梭菌具有一定程度的傳播。