高效液相色譜法測(cè)定蜜餞中檸檬黃的不確定度評(píng)定

◎ 張慧瓊，鄭陸紅，陳嘉敏

（1.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；3.廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站，廣東 廣州 511442）

蜜餞，是一種以果蔬等為主要原料，添加（或不添加）食品添加劑和其他輔料，經(jīng)糖或蜂蜜或食鹽腌制（或不腌制）等工藝制成的制品[1]。從國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局公布的2019—2021年食品監(jiān)督抽檢數(shù)據(jù)來(lái)看，著色劑的不合格批次數(shù)和涉及的著色劑種類呈上升趨勢(shì)[2]。

食用檸檬黃是一種水溶性合成色素，外觀呈鮮艷的嫩黃色。適量的檸檬黃可以安全地用于食品、飲料、藥品及化妝品的著色，還可用于蠶絲、羊毛的染色等。由于合成色素的確能改善食品的色澤，為刺激消費(fèi)者的購(gòu)買欲，制作商將其廣泛用于冷凍飲品、糖果包衣、果凍以及蜜餞等的著色。但是合成著色劑存在一定的毒性、致泄性，還會(huì)影響兒童的智力發(fā)育[3]。其中，檸檬黃可能會(huì)對(duì)人體引發(fā)過(guò)敏癥狀，包括焦慮、哮喘、蕁麻疹、視覺模糊偏頭痛等。因此，在蜜餞中檢測(cè)檸檬黃含量非常有必要。食品檢驗(yàn)的工作程序復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中難免會(huì)受到各種因素的影響，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果和真實(shí)值之間出現(xiàn)一定的誤差。為了使分析結(jié)果更加客觀公正，需要引入測(cè)量不確定度。不確定度表明測(cè)量結(jié)果可能的分散程度，指對(duì)測(cè)量正確性的可疑程度，是測(cè)量結(jié)果質(zhì)量高低的一種定量表達(dá)方式[4]。本文根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定》（GB 5009.35—2016）[5]，以蜜餞中檸檬黃的檢測(cè)為例，依據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[6]，探討食品檢測(cè)過(guò)程中測(cè)量不確定度來(lái)源、影響因素和測(cè)定方法，以期為食品檢驗(yàn)中測(cè)量不確定度的研究與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某品牌蜜餞：市售。

檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)品：海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司；檸檬酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚酰胺（100～200目）：源葉有限公司；甲酸：廣州化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）：上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆灰宜徜@：福晨（天津）有限公司；氨水：廣州化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇：成都市科隆化學(xué)品有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q Advantage A10制備的一級(jí)水，Millipore公司；乙酸：康科德有限公司；0.45 μm水相濾膜：艾杰爾。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測(cè)器（DAD）：安捷倫科技有限公司；C18色譜柱（250 mm×4. 6mm，5 μm）：飛諾美有限公司；電子天平（十萬(wàn)分之一）：梅特勒-托利多有限公司；超聲波清洗機(jī)（SB25-12DT）：新芝生物科技股份有限公司；漩渦混合器（IKA MS 3 basic）：德國(guó)IKA公司；純水機(jī)（Milli-Q Advantage A10）：默克密理博公司；電熱恒溫水浴鍋（HWS-26）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；玻璃砂芯漏斗（G3）：帆船牌；隔膜真空泵：津滕有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)與方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

從檸檬黃的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg·mL-1）中分別吸取0.002 mL、0.010 mL、0.100 mL、0.500 mL和1.000 mL至10 mL容量瓶中，用一級(jí)水定容，配制成0.2 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和100.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3.2 試樣前處理

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定》（GB 5009.35—2016）[5]，將蜜餞均勻粉碎后，準(zhǔn)確稱取試樣5.00 g，放入100 mL小燒杯中，加水30 mL，溫?zé)崛芙?。樣品溶液加檸檬酸溶液?0%）調(diào)pH到6，加熱至60 ℃，將1 g聚酰胺粉加少許水調(diào)成糊狀，倒入樣品溶液里并攪拌。以G3垂融漏斗抽濾，用60 ℃pH為4的水洗滌5次，接著用甲醇-甲酸混合液（6+4，體積比）洗滌5次，再用水洗至中性；用乙醇-氨水-水混合液（7+2+1，體積比）解吸5次，直至色素完全解吸。收集洗脫液，加乙酸中和，蒸發(fā)至近干，加水溶解，定容至5 mL容量瓶，混勻后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，收集濾液供高效液相色譜儀分析測(cè)定。

1.4 色譜條件

色譜柱：phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：35 ℃，流動(dòng)相：以甲醇為A相，以0.02 mol·L-1乙酸銨溶液為B相，梯度洗脫，洗脫方式見表1，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，波長(zhǎng)428 nm，二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)。

表1 梯度洗脫表

2 結(jié)果及分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

式中：X為試樣中檸檬黃的含量，g·kg-1；C為進(jìn)樣液中檸檬黃的濃度，μg·mL-1；V為試樣定容體積，mL；m為試樣質(zhì)量，g；1 000為換算系數(shù)。

2.2 分析不確定度的來(lái)源

根據(jù)測(cè)定方法的主要步驟，高效液相色譜儀檢測(cè)蜜餞中檸檬黃含量的不確定度主要有以下5類[7]。①標(biāo)準(zhǔn)工作液配制產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。②樣品稱量產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。③試樣定容體積產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。④求樣品濃度時(shí)用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。⑤樣品重復(fù)性測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜法測(cè)定蜜餞中檸檬黃的不確定度來(lái)源圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量評(píng)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(B)

檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是由北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司提供，該標(biāo)物由證書給出的純度為1 000 μg·mL-1，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為1.0%，正態(tài)分布（包含因子k=2），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.2 樣品稱量產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ucrel(m)

依據(jù)方法要求，使用千分之一的天平稱量，稱取混合均勻的試樣5.000 g，根據(jù)檢定證書，該天平給出的0～50 g（0～5 000 e，e=10 d，d=1 mg)稱量范圍的允許誤差為5 mg，按均勻分布則引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.3 樣品定容體積產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ucrel(V)

（1）標(biāo)定容量瓶帶來(lái)的不確定度。樣品經(jīng)前處理，最后用5 mL容量瓶定容，根據(jù)《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[8]，A級(jí)單標(biāo)線5 mL容量瓶，其容量允許差為±0.020 mL，按均勻分布引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）由溫度效應(yīng)引入的不確定度。玻璃器皿在20 ℃校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室的溫度在（20±5）℃變動(dòng)?？赏ㄟ^(guò)計(jì)算該溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來(lái)評(píng)定該影響引起的不確定度。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，由溫度波動(dòng)引起的體積偏差為V×10 ℃×2.1×10-4℃-1，按均勻分布，由溫度變化帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（3）樣品定容體積產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ucrel(V)。試樣定容體積產(chǎn)生的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.4 求樣品濃度時(shí)用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c)

使用校準(zhǔn)曲線計(jì)算檸檬黃的濃度，配制5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.200 0 μg·mL-1、1.000 0 μg·mL-1、10.000 0 μg·mL-1、50.000 0 μg·mL-1和100.000 0 μg·mL-1，平均值每個(gè)點(diǎn)各測(cè)3次，結(jié)果見表2。

表2 檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)系列溶液測(cè)定結(jié)果表

線性最小二乘法擬合曲線的相關(guān)系數(shù)r2為1.000，以含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)得方程y=bx+a=31.608x+0.378，殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差為

測(cè) 量 提 取 溶 液 兩 次 得 濃 度 為36.10 μg·mL-1、36.52 μg·mL-1，即平均值c=36.31 μg·mL-1，求樣品濃度時(shí)用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

式中b為斜率，p為測(cè)試的次數(shù)，n為測(cè)試校準(zhǔn)溶液的次數(shù)，求樣品濃度時(shí)用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.5 樣品重復(fù)性測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)

影響測(cè)量結(jié)果重復(fù)性的因素主要有人員操作和讀數(shù)差異、樣品不均勻、測(cè)量?jī)x器的變動(dòng)性等。各種隨機(jī)因素合并引起的重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，可在重復(fù)性測(cè)量條件下統(tǒng)計(jì)分析一系列測(cè)量結(jié)果得到。用同一臺(tái)高效液相色譜儀，在重復(fù)性條件下對(duì)蜜餞進(jìn)行了6次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果分別為0.034 g·kg-1、0.036 g·kg-1、0.036 g·kg-1、0.035 g·kg-1、0.033 g·kg-1、0.035 g·kg-1。

以標(biāo)準(zhǔn)偏差表示測(cè)量的重復(fù)性，按貝塞爾公式計(jì)算，則

本實(shí)驗(yàn)測(cè)量6個(gè)樣品，平均值為0.035 g·kg-1，當(dāng)報(bào)告平均值時(shí)，應(yīng)用早先預(yù)評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)偏差，測(cè)量的平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.6 合成相對(duì)不確定度、相對(duì)擴(kuò)展不確定度和擴(kuò)展不確定度的評(píng)定

（1）合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評(píng)定。綜合以上由標(biāo)物、樣品稱量、樣品前處理過(guò)程、求樣品濃度時(shí)最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線和重復(fù)性試驗(yàn)5個(gè)方面產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，得到的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）相對(duì)擴(kuò)展不確定度和擴(kuò)展不確定度的評(píng)定。當(dāng)置信概率為95%時(shí)，取包含因子k=2，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為Urel=k×ucrel(W)=2×0.015 4=3.08%。樣品中檸檬黃檢出0.035 g·kg-1，則其擴(kuò)展不確定度為

2.3.7 測(cè)量結(jié)果不確定度報(bào)告

根據(jù)不確定度評(píng)估后，檸檬黃測(cè)定結(jié)果為0.035 g·kg-1；擴(kuò)展不確定度為U=0.001 g·kg-1（k=2），其結(jié)果可表示為X檸=(0.035±0.001) g·kg-1，k=2。

3 結(jié)論

本文以檸檬黃為例，分析了高效液相色譜法測(cè)定蜜餞中檸檬黃的不確定度評(píng)定，本實(shí)驗(yàn)中，前處理過(guò)程產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度最大，即本實(shí)驗(yàn)中前處理是影響結(jié)果的關(guān)鍵，因此在檢驗(yàn)工作的過(guò)程中，需要給予重視，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。