唐梅 蔡松 付聲亮 王金華 王永澤

摘要 [目的]研究可溶性吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因（UdhA）和醛糖還原酶基因（xylI）共表達對木糖醇發(fā)酵的影響。[方法]將來源于博伊丁假絲酵母醛糖還原酶xylI基因克隆到pET28a（+）上，并在BL21（DE3）中表達，通過SDS-PAGE對表達產(chǎn)物的分子量和酶活進行測定。隨即將xylI基因連接lacP啟動子，構(gòu)建pWYZ-2質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化到E.coli AI07菌株。進一步將來源于E.coli W3110的UdhA基因克隆到pWYZ-2質(zhì)粒實現(xiàn)與xylI共表達，所構(gòu)建pWYZ-4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli AI07菌株，比較了E.coli AI07/pWYZ-2和E.coli AI07/pWYZ-4木糖醇發(fā)酵結(jié)果。[結(jié)果]在BL21（DE3）/pET28a（+）體系誘導表達的醛糖還原酶分子量為39? kD，木糖還原酶酶活為3.30 U/mL。E.coli AI07/pWYZ-2菌株發(fā)酵48 h，木糖醇產(chǎn)量為19.90 g/L;E.coli AI07/pWYZ-4發(fā)酵36 h，木糖醇產(chǎn)量達到19.91 g/L，較菌株AI07/pWYZ-2生產(chǎn)強度提高了33.25%。[結(jié)論]通過將UdhA基因與xylI 基因進行共表達，提高了重組大腸桿菌（E.coli AI07/ pWYZ-4）合成木糖醇的生產(chǎn)強度。

關(guān)鍵詞 博伊丁假絲酵母;xylI基因;UdhA基因;共表達;木糖醇

中圖分類號 Q 812? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）01-0106-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.027

The Effect of Co-expression of UdhA and Candida boidinii xylI Gene on Xylitol Fermentation

TANG Mei， CAI Song， FU Sheng-liang et al

（Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology， Hubei University of Technology， Wuhan， Hubei 430068）

Abstract [Objective] The effect of co-expression of soluble pyridine nucleotide transhydrogenase gene （UdhA） and aldose reductase gene （xylI） on xylitol fermentation was investigated. [Method] xylI gene from Candida boidinii encoding aldose reductase was cloned into pET28a（+） and expressed in BL21（DE3）. The enzyme molecular weight was detected by SDS-PAGE and enzyme activity was assayed. xylI gene was ligated to the lacP promoter for construction of plasmid pWYZ-2 and then the plasmid was transformed into E.coli AI07.The UdhA gene derived from E.coli W3110 was further cloned into pWYZ-2 plasmid to achieve co-expression with xylI for pWYZ-4 plasmid construction and then pWYZ-4 was transformed into E.coli AI07. E.coli AI07/pWYZ-2 was compared with E.coli AI07/pWYZ-4 for xylitol fermentation.[Result] The molecular weight of xylose reductase expressed in BL21（DE3）/pET28a（+） system was 39 kD， and the enzymatic activity of aldose reductase was 3.3 U/mL.The E.coli AI07/pWYZ-2 strain was fermented for 48 hours， the xylitol output was 19.90 g/L. E.coli AI07/pWYZ-4 was fermented for 36 hours， xylitol production reached 19.91 g/L， xylitol productivity of E.coli AI07/pWYZ-4 was 33.25% higher than that of strain E.coli AI07/pWYZ-2.[Conclusion]Xylitol productivity of recombinant Escherichia coli was improved using co-expression of UdhA gene and xylI gene.

Key words Candida boydingii;xylI gene;UdhA gene;Co-expression;Xylitol

基金項目 國家“十二五”支撐計劃項目（2012BAD27B03）;山東創(chuàng)新計劃項目（201720311004）。

作者簡介 唐梅（1993—），女，湖北廣水人，碩士，從事代謝工程及發(fā)酵技術(shù)研究。通信作者，副教授，從事生物能源與生物材料研究。

收稿日期 2021-04-22

木糖醇廣泛存在于各種果蔬食物中，含量卻很低[1]，其應(yīng)用范圍廣，且由于木糖醇在人體內(nèi)的代謝與胰島素無關(guān)[2-3]，故適用于生產(chǎn)糖尿病患者食品。近年來，木糖醇的市場需求不斷擴大，國內(nèi)木糖醇年產(chǎn)值已超過13億元，預(yù)計今后國際市場上木糖醇總需求量將達10萬t以上[4]。

通過微生物發(fā)酵或者催化獲得木糖醇正成為木糖醇合成的熱點，醛糖還原酶（也稱為木糖還原酶）作為生物合成法中的關(guān)鍵因子，主要存在于酵母和絲狀真菌中[4]。目前發(fā)現(xiàn)的醛糖還原酶都需要輔酶，其中一類是輔酶NADH依賴型，如來源于近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）[5]的木糖還原酶;另外一類是輔酶NADPH依賴型，如來源于熱帶假絲酵母（Candida boydingii）[6]、埃默森籃狀菌（Talaromyces emersonii）[7]和博伊丁假絲酵母（Candida boidinii）等[8]微生物的醛糖還原酶。對于輔酶NADPH依賴型的木糖還原酶，要提高木糖醇的產(chǎn)量，需要更多的NADPH來滿足酶催化的需要。

通常通過表達磷酸戊糖途徑的6-磷酸葡萄糖脫氫酶編碼基因zwf和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶編碼基因gnd來強化NADPH的產(chǎn)出[9];也有敲除EMP途徑中編碼磷酸果糖激酶的pfkA和pfkB基因，使碳源更多地流向磷酸戊糖途徑，從而實現(xiàn)NADPH的供給[10]。

可溶性吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶能催化NADH和NADPH相互轉(zhuǎn)化[11]，改變了細胞內(nèi)NADH/NAD+的比例。考慮到糖酵解途徑不依賴氧氣也能產(chǎn)生大量的NADH，如果將這部分輔因子轉(zhuǎn)化成NADPH形式，將為NADPH的供給提供一個新的途徑。在前期產(chǎn)丙酮酸大腸桿菌工程菌構(gòu)建的工作中，成功將大腸桿菌W3110自身的UdhA基因克隆到載體上，通過誘導表達發(fā)現(xiàn)，UdhA的克隆有效地促進了丙酮酸發(fā)酵的生產(chǎn)強度[12]。

考慮到博伊丁假絲酵母（Candida boidinii）在木糖醇合成中也存在輔酶NADPH依賴的難題，筆者借鑒丙酮酸工程菌構(gòu)建的結(jié)果，將博伊丁假絲酵母的醛糖還原酶基因xylI進行克隆、表達及酶活測定，并探討可溶性吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶UdhA和xylI共表達對木糖醇發(fā)酵的影響，以期為解決NADPH依賴型醛糖還原酶輔因子不足的問題提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒。所用菌株和質(zhì)粒見表1。

1.1.2 引物。

引物序列見表2，均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.1.3 主要試劑與儀器。

主要試劑：木糖醇對照品（含量>99.9%），2×Taq polymerase，PrimerSTAR Max DNA Polymerase，其他試劑均為市售分析純;主要儀器：e2695液相色譜、蛋白電泳儀、凝膠自動成像儀、PCR儀、電轉(zhuǎn)儀。

1.1.4 培養(yǎng)基。

LB液體培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L、蛋白胨1 g/L、NaCl 5 g/L。

抗性平板培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L、蛋白胨1 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂粉20 g/L，根據(jù)用途加入50 mg/L氨芐青霉素或者卡那霉素。

搖瓶種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、木糖1 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨1 g/L、NaCl 5 g/L、氨芐青霉素50 mg/L。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、木糖20 g/L、酵母粉5 g/L。

1.2 方法

1.2.1 將xylI基因克隆到載體pET28a（+）。

（1）以質(zhì)粒pAGI02作為模板，采用引物pET28a（+）-xylI（AR）-p1和pET28a（+）-xylI（AR）-p2擴增出理論長度為1 016 bp的xylI核酸序列。

（2）以pET28a（+）作為模版，采用反向引物pET28a（+）-p-F-P1和pET28a（+）-p-F-P2將pET28a（+）線性化，得到理論長度為5 000 bp的核酸序列。

（3）采用T5外切酶[13]的方法處理xylI核酸序列和pET28a（+）線性化的核酸序列，處理后的產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，30 ℃ 150 r/min復(fù)蘇40 min后取100 μL菌液涂布于卡那抗性平板上，待卡那抗性平板上長出單菌落后，挑取單菌落提取重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司武漢分公司測序，將測序無誤的重組質(zhì)粒命名為pET28a（+）-xylI。

（4）將重組質(zhì)粒pET28a（+）-xylI采用氯化鈣法轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，得到菌株BL21/pET28a（+）-xylI。

1.2.2 將xylI基因克隆到載體pBR322。

（1）以質(zhì)粒pBR322作為模版，采用反向引物pBR322-F-P1和pBR322-F-P2將pBR322線性化（線性化序列為除去tetP和Tcr部分的序列），得到理論長度為3 094 bp的核酸序列。

（2）以pWYZ-1質(zhì)粒作為模版，設(shè)計引物pBR322-lacP-xylI P1和pBR322-lacP-xylI P2，從pWYZ-1質(zhì)粒上擴增出lacP-xylI核酸序列，大小為1 168 bp。

（3）用T5外切酶的方法[13]處理lacP-xylI核酸序列和pBR322載體線性化的核酸序列，處理后的產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，30 ℃150 r/min復(fù)蘇40 min后取100 μL菌液涂布于氨芐抗性平板上，待氨芐抗性平板上長出單菌落后，挑取單菌落提取重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司武漢分公司測序，將測序無誤的重組質(zhì)粒命名為pWYZ-2。

（4）將重組質(zhì)粒pWYZ-2采用氯化鈣法轉(zhuǎn)化到E.coli AI07中，得到菌株E.coli AI07/pWYZ-2。

1.2.3 將UdhA基因克隆到載體pWYZ-2。

（1）以pWYZ-2質(zhì)粒為模板，采用反向引物pWYZ-2-P1和pWYZ-2-P2將pWYZ-2線性化，得到理論長度為4 212 bp的核酸序列。

（2）以E.coli W3110[14]為模板，使用引物UdhA-P1和UdhA-P2擴增出理論長度為1 401 bp的UdhA核酸序列。

（3）用T5外切酶的方法將擴增出的UdhA核酸序列與pWYZ-2線性化的核酸序列進行外切處理，處理后的產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，30 ℃150 r/min復(fù)蘇40 min后取100 μL菌液涂布于氨芐抗性平板上，待氨芐抗性平板上長出單菌落后，挑取單菌落提取重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司武漢分公司測序，將測序無誤的重組質(zhì)粒命名為pWYZ-4。

（4）將重組質(zhì)粒pWYZ-4采用氯化鈣法轉(zhuǎn)化到E.coli AI07中，得到菌株E.coli AI07/pWYZ-4。

1.2.4 SDS-PAGE分析粗酶液中重組蛋白的分子量。

從甘油管中將菌株BL21（DE3）/pET28a（+）-xylI轉(zhuǎn)接到固體平板，于37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng);從卡那平板挑取單克隆BL21（DE3）/pET28a（+）-xylI接種于含卡那的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，再將菌液溫度降至25 ℃以下，加入誘導劑IPTG至最終濃度為1 mmol/L，25 ℃誘導15 h，取2 mL菌液于2 mL離心管中，12 000 r/min 4 ℃離心5 min，使用1 mL預(yù)冷的低鹽PBS清洗菌體3遍。每管加入1 mL預(yù)冷的裂解液重懸細菌，冰浴超聲400 W，超10 s停10 s，超聲10 min直至變清，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，收集上清即為粗酶液作為樣品進行SDS-PAGE電泳。

1.2.5 菌株BL21（DE3）/pET28a（+）-xylI表達產(chǎn)物的酶活測定。

酶活測定參照張哲等[10]的方法。

對于醛糖還原酶，1個酶活性單位（U）定義為在35 ℃反應(yīng)條件下1 min消耗1 μmol NADPH所需的酶量。

1.2.6 重組大腸桿菌搖瓶發(fā)酵試驗。

分別從甘油管將E.coli AI07/pWYZ-2和E.coli AI07/pWYZ-4菌株轉(zhuǎn)接到氨芐抗性平板上，并轉(zhuǎn)接數(shù)代;然后從抗性平板上挑取3個菌落到50 mL搖瓶種子培養(yǎng)基中。30 ℃ 200 r/min過夜培養(yǎng)，然后按照2%接種量接種于含有100 mg/L氨芐青霉素的100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃ 200 r/min條件下進行發(fā)酵，當搖瓶中菌液OD600達到0.8～1.0時，添加0.1 mmol/L IPTG開始誘導。每12 h向發(fā)酵搖瓶中補加氨芐青霉素100 μL（100 mg/L）;每12 h從搖瓶取出2 mL發(fā)酵液。

1.2.7 產(chǎn)物檢測。

用可見分光光度計測定“1.2.6”中取出的發(fā)酵液中菌的OD600吸光值，用來評價菌的生物量。

將“1.2.6”中取出的發(fā)酵液12 000 r/min離心5 min，取上清用超純水稀釋合適倍數(shù)后，用0.22 μm濾膜過濾。采用高效液相色譜waters e2695測定發(fā)酵液的木糖醇、D-木糖和葡萄糖。色譜柱為Bio-Rad HPX 87H，檢測器為示差檢測器（2414 RI Detector），流動相4 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，柱溫40 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET28a（+）-xylI、pWYZ-2和pWYZ-4目標載體的成功構(gòu)建

圖1～3為3個質(zhì)粒構(gòu)建的示意圖，并將測序正確的質(zhì)粒分別命名為pET28a（+）-xylI、pWYZ-2和pWYZ-4。

2.2 質(zhì)粒 pET28a（+）-xylI中xylI基因的誘導表達

將重組大腸桿菌 BL21（DE3）/pET28a（+）-xylI進行IPTG誘導表達，將誘導表達后的發(fā)酵液進行超聲波破胞后離心，以離心后的上清液作為樣品，進行SDS-PAGE 蛋白電泳（膠濃度為12%），結(jié)果見圖4。從圖4可見，重組大腸桿菌 BL21（DE3）/pET28a（+）-xylI經(jīng)過IPTG誘導表達后，在39 kD處出現(xiàn)明顯的蛋白表達條帶（泳道2），而未添加IPTG誘導表達的對照組（泳道1）在相應(yīng)的位置蛋白表達條帶很淡，可初步推斷醛糖還原酶分子量約為 39 kD，這也與xylI基因預(yù)測表達產(chǎn)物分子量大小相符。

2.3 醛糖還原酶酶活測定結(jié)果

將重組大腸桿菌 BL21（DE3）/pET28a（+）-xylI進行IPTG誘導表達，將誘導表達后的發(fā)酵液進行超聲波破胞后離心，以離心后的上清液作為樣品，測定醛糖還原酶的酶活，結(jié)果表明，BL21（DE3）/pET28a（+）-xylI不添加IPTG的酶活為（0.04±0.03） U/mL，

BL21（DE3）/pET28a（+）-xylI 添加IPTG的酶活為（3.30±0.06） U/mL。

2.4 E.coli AI07/pWYZ-2和E.coli AI07/pWYZ-4菌株發(fā)酵結(jié)果

在大腸桿菌 BL21（DE3）驗證了xylI基因表達產(chǎn)物及測定了相應(yīng)醛糖還原酶酶活后，將xylI基因連接上lacP啟動子，重新構(gòu)建了質(zhì)粒pWYZ-2，以強化菌株E.coli AI07產(chǎn)木糖醇的能力。在pWYZ-2基礎(chǔ)上，進一步共表達xylI基因和UdhA基因，得到了質(zhì)粒pWYZ-4。通過對比菌株E.coli AI07/pWYZ-2和E.coli AI07/pWYZ-4發(fā)酵產(chǎn)木糖醇的結(jié)果，評價UdhA基因?qū)δ咎谴及l(fā)酵的影響。

由圖5可知，在整個發(fā)酵過程中，E.coli AI07/pWYZ-4菌株的生物量（OD600值）始終高于菌株E.coli AI07/pWYZ-2;在利用葡萄糖方面，菌株E.coli AI07/

pWYZ-2在發(fā)酵24 h后葡萄糖剩余量為7.2 g/L，而菌株E.coli AI07/pWYZ-4發(fā)酵24 h后，葡萄糖剩余量為2.1 g/L，表明E.coli AI07/pWYZ-4對葡萄糖消耗較快，也解釋了其在發(fā)酵過程中較高的生物量;在利用木糖方面，當初始D-木糖的量為20 g/L時，E.coli AI07/pWYZ-2菌株48 h，木糖醇的產(chǎn)量為19.90 g/L;而菌株E.coli AI07/pWYZ-4 36 h，木糖醇的產(chǎn)量為19.91 g/L。E.coli AI07/pWYZ-4菌株較E.coli AI07/pWYZ-2生產(chǎn)木糖醇的強度提高了33.25%。

UdhA基因能夠催化NADH與NADPH相互轉(zhuǎn)化，進而調(diào)控胞內(nèi)還原力[15]，而NADPH是很多菌屬包括該研究所用的博伊丁假絲酵母醛糖還原酶的輔酶[16]，由此推斷，共表達UdhA能調(diào)動糖酵解產(chǎn)生的NADH生成NADPH，從而提高木糖醇的產(chǎn)量。但從已有的發(fā)酵數(shù)據(jù)來看，共表達UdhA基因的E.coli AI07/pWYZ-4菌株并未形成更高的木糖醇產(chǎn)量，只是有較高的木糖醇生產(chǎn)強度，推測可能原因在于UdhA基因并不僅僅影響輔酶含量，而是通過一些途徑影響細胞生長或相關(guān)酶的酶活，從而提高木糖醇的生產(chǎn)強度。

3 結(jié)論

（1）博伊丁假絲酵母醛糖還原酶（xylI）基因在BL21（DE3）/pET28a（+）體系誘導表達后的蛋白產(chǎn)物分子量為39 kD，醛糖還原酶酶活為3.30 U/mL。

（2）將博伊丁假絲酵母醛糖還原酶（xylI）基因接lacP啟動子，克隆到pWYZ-2質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到E.coli AI07菌株后發(fā)酵48 h，木糖醇的產(chǎn)量為19.90 g/L。

（3）共表達來自E.coli W3110的可溶性吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因（UdhA）對于Candida boidinii這類醛糖還原酶依賴NADPH輔因子的菌屬來說，具有提高生產(chǎn)強度的作用，該研究中木糖醇的生產(chǎn)強度提高了33.25%。

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