王寧 張葉韜 蘆曉芳

摘要 基于超聲時間、液料比和超聲溫度的單因素試驗，通過響應面分析法優(yōu)化，結合樣品粉末的SEM表征，確定超聲輔助法提取黑豆異黃酮的最優(yōu)工藝條件;經大孔樹脂（D-101）純化黑豆異黃酮粗提物，繼而以乙酸乙酯-甲醇（V乙酸乙酯∶V甲醇=10∶1）溶液洗脫過硅膠層析柱，得組分Ⅰ和組分Ⅱ;考察異黃酮、組分Ⅰ和組分Ⅱ體外抗氧化活性。結果表明：超聲輔助法提取黑豆異黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)為時間38 min，液料比32∶1，溫度53 ℃，該條件下黑豆異黃酮提取量[（9.403±0.698） mg/g]最大;經大孔樹脂（D-101）純化得到純度較高（異黃酮含量[（53.37±3.37）%]的異黃酮;過硅膠層析柱得組分Ⅰ和組分Ⅱ。當總異黃酮、組分Ⅰ和組分Ⅱ的濃度達到0.25 mg/mL時，DPPH·自由基清除率分別達到了（71.28±1.41）%、（34.60±2.95）%和（42.01±1.34）%，總異黃酮的清除率是組分Ⅰ和組分Ⅱ的2.06和1.70倍，總異黃酮、組分Ⅰ和組分Ⅱ的抗氧化能力依次為總異黃酮>組分Ⅱ>組分Ⅰ。

關鍵詞 響應面法;異黃酮;分離純化;抗氧化活性

中圖分類號 TQ 914.1? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）01-0171-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.046

開放科學（資源服務）標識碼（OSⅠD）：

Extraction of Isoflavones from Glycine max and Its Ability to Scavenge DPPH Free Radicals

WANG Ning， ZHANG Ye-tao， LU Xiao-fang

（Foundation Department， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi 030801）

Abstract The optimal process conditions for ultrasonic-assisted extraction of isoflavones from Glycine max were determined based on univariate analysis of ultrasonic time， solid-liquid ratio and ultrasonic temperature， and SEM characterization of sample powder. After purifying the crude extract of isoflavones from Glycine max by the macroporous resin （D-101）， and silicagel column chromatographic separation in ethyl acetate-methanol （Vethyl acetate∶Vmethanol=10∶1）， component I and component II were obtained. The in vitro anti-oxidant activities of isoflavones， component I and component II were analyzed. The results showed that the optimal process parameters for the extraction of isoflavones from Glycine max? by the ultrasonic-assisted method were as follows： time， 38 min;liquid-solid ratio，32∶1;temperature， 53 ℃. Under these conditions， the extraction rate of isoflavones from Glycine max? achieved the highest （9.403±0.698）mg/g. Using the macroporous resin （D-101）， highly purified isoflavones were extracted from Glycine max? （53.37±3.37）%. Component I and component II were obtained from the silicagel column chromatographic separation. Under the concentrations of total isoflavones， component I and component II at 0.25 mg/mL， their DPPH free radical scavenging rate reached （71.28±1.41）%， （34.60±2.95）% and （42.01±1.34）%， respectively. In particular， the scavenging rate of total isoflavones was 2.06 and 1.70 times than that of component I and component II. The antioxidant capacity remained highest in total isoflavones， followed by component II， and component I.

Key words The response surface method;Isoflavones;Separation and purification;Antioxidant activity

基金項目 山西省高等學校大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目（202010113014）;山西農業(yè)大學博科研啟動（J242098140）。

作者簡介 王寧（1999—），男，山東臨沂人，從事植物活性成分提取及活性研究。通信作者，副教授，博士，從事天然產物提取及活性研究。

收稿日期 2021-06-02

黑豆屬于豆科大豆屬植物，具有很強的環(huán)境適應能力，在氣溫較為寒冷、雨水量較少的北方有著廣闊的種植面積[1-3]。作為具有預防和治療多種疾病的食藥同源物種之一的黑豆異黃酮含量較高[4]，因此其具有預防心血管疾病、治療糖尿病、抗炎癥、改善骨質疏松、降低乳腺癌的發(fā)病幾率等功效[5-8]。目前，超聲輔助提取天然產物大大提高了活性組分的溶出率[9]。因此，該研究采用響應面法優(yōu)化黑豆異黃酮超聲提取工藝，并經大孔樹脂和硅膠柱分離純化[10]，研究黑豆異黃酮最優(yōu)提取分離方法，測定其體外抗氧活化活性[11]，以期為黑豆相關附加產品、功能食品等在臨床醫(yī)學、制藥、化妝品、保健等方面的開發(fā)和推廣使用提供參考和理論依據(jù)[8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 武鄉(xiāng)黑豆，由山西農業(yè)大學大豆課題組提供。

染料木素標準品（純度98%），成都植標化純生物技術有限公司;石油醚（分析純），天津市大茂化學試劑廠;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（分析純，DPPH） ，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司;抗壞血酸（分析純），中國醫(yī)藥公司北京采購供應站;無水乙醇（分析純），天津市天大化工試驗廠。

1.2 儀器與設備

UV1100紫外分光光度計，長沙科美分析儀器有限公司;YRE2000E旋轉蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器責任有限公司;GZX-GF101-2-BS-Ⅱ/H電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司;KM-300DE中文液晶臺式超聲波清洗器，昆山美美超聲儀器有限公司;SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵，鄭州予華儀器制造有限公司;DL-0506低溫冷卻液循環(huán)泵，河南兄弟設備儀器有限公司。

1.3 標準曲線的繪制

準確稱取22.4 mg染料木素標準品溶于70% （V/V）乙醇溶液，定容至100 mL，分別吸取0、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0 mL染料木素溶液，置于100 mL容量瓶中定容，即得不同濃度梯度的染料木素標準溶液。利用紫外分光光度計對染料木素標準溶液于200～600 nm處掃描，確定最大吸收波長，即含量檢測波長。以不加樣品的平行樣作為空白對照，在最大的吸收波長處測定吸光度。以70%乙醇為空白對照，吸光度為縱坐標，標準品質量濃度（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，建立回歸方程（n=3）。

1.4 黑豆異黃酮的提取 黑豆異黃酮提取流程如圖1所示，每組3次平行。按“1.3”中的方法測定溶液吸光度，根據(jù)回歸方程計算黑豆異黃酮提取量。

黑豆異黃酮的提取量（mg/g）=C·V·n/m（1）

式中，C為黑豆異黃酮的質量濃度（mg/mL）;V為定容體積（mL）;n為稀釋倍數(shù);m為原料質量（g）。

1.5 單因素試驗

1.5.1 超聲時間對黑豆異黃酮提取量的影響。

準確稱取脫脂黑豆粉末10 g，液料比40∶1（mL∶g），提取液為70%乙醇溶液，超聲波功率270 W，溫度60 ℃，分別設定超聲時間為10、20、30、40、50和60 min。按“1.4”中方法計算黑豆異黃酮提取量。

1.5.2 超聲溫度對黑豆異黃酮提取量的影響。

準確稱取脫脂黑豆粉末10 g，液料比40∶1，超聲時間30 min，超聲功率270 W，提取液為70%乙醇溶液，超聲溫度分別為25、40、50、60和70 ℃。按“1.4”中方法計算黑豆異黃酮提取量。

1.5.3 液料比對黑豆異黃酮提取量的影響。

準確稱取脫脂黑豆粉末10 g，超聲溫度為 60 ℃，超聲功率為 270 W，超聲時間30 min，提取液為70%乙醇溶液，液料比分別為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50。按“1.4”中方法計算黑豆異黃酮提取量。

1.6 響應面法優(yōu)化黑豆異黃酮提取工藝

以超聲時間（A）、液料比（B）和超聲溫度（C）3個條件為自變量因素，基于黑豆異黃酮超聲提取單因素試驗結果，設計響應面優(yōu)化試驗（表1），通過 Design Expert 12.0軟件對試驗結果進行回歸分析，得到黑豆異黃酮最優(yōu)提取工藝條件。

1.7 粉末SEM表征

掃描電子顯微鏡（VEGA Ⅱ RSU型，TESCAN公司），用于分析和描述黑豆細胞壁結構在不同條件（超聲時間、液料比、超聲溫度）下提取前后的變化[12]。

1.8 TLC法檢測黑豆異黃酮苷元

采用薄層層析法對黑豆異黃酮苷元進行初步分離檢測。將薄層層析板切成高5 cm、寬1 cm 的板，在距下緣0.5 cm處點樣（點樣量約10 μL，點樣直徑≤2 mm），吹風機吹干。將薄板放入展開劑飽和后的層析缸中展開，展開劑為V乙酸乙酯∶V甲醇=10∶1，展開后吹干，紫外線波長 254 nm 處[13]檢測黑豆異黃酮苷元斑點。

1.9 黑豆異黃酮的分離純化 ①大孔吸附樹脂預處理。將D101大孔樹脂浸泡于體積分數(shù)為95%乙醇溶液中24 h，然后用蒸餾水洗滌至中性;再分別用體積分數(shù)為5% NaOH溶液浸泡12 h，洗滌至中性;最后用體積分數(shù)為5% HCl浸泡12 h，洗滌至中性，靜置待用。

②將活化后的大孔樹脂裝柱，取質量濃度為2 mg/mL黑豆異黃酮粗提取液上樣，先用蒸餾水沖洗，去除水溶性雜質，再用70%乙醇溶液洗脫，選用薄層色譜分析法跟蹤檢測，收集含黑豆異黃酮流出液。③活化后的硅膠粉干法裝柱。將硅膠直接裝入柱中，輕敲硅膠柱兩側，當硅膠高度到達合適位置后用泵將填料壓實。將大孔樹脂純化后的黑豆異黃酮樣品干法上樣，以V乙酸乙酯∶V甲醇=10∶1為洗脫劑進行洗脫。

黑豆異黃酮純度的計算公式[1]：

黑豆異黃酮純度（%）=C·V/M×100%（2）

式中，C為洗脫液中黑豆異黃酮質量濃度，mg/mL;V為洗脫液體積，mL;M為粗異黃酮質量，g。

1.10 DPPH自由基清除能力的測定

準確稱取樣品12.5 mg，以抗壞血酸為對照，95%乙醇溶解，定容至50 mL，準確量取2、4、6、8、10 mL分別稀釋至10 mL，得到濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的樣品溶液。測定不同濃度樣品的清除能力，各組分別編號1～5（表2）。暗反應30 min，517 nm處[13-14]測定吸光度。各組試劑加入量見表2。

樣品對DPPH自由基清除率計算公式：

清除率=[1-（A1-A2）/（A1-A0）]×100%（3）

式中，A0為標0組的吸光度;A1為對照組吸光度;A2為黑豆異黃酮樣液或抗壞血酸與DPPH混合溶液的吸光度。

1.11 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Office軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，利用Origin 2017軟件及Design-Expert 12.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 黑豆異黃酮標準曲線繪制 染料木素標準品全波段掃描結果見圖2。從圖2可見，染料木素最大吸收波長為288 nm。

從圖3可見，回歸方程為y=35.341 0x-0.009 5，R2=0.999 3，在該范圍內（0～0.016 mg/mL）有良好的線性關系。

2.2 單因素試驗分析

2.2.1 超聲時間對黑豆異黃酮提取量的影響。

從圖4可見，在溫度60 ℃、液料比40∶1、70%乙醇、功率270 W的條件下，黑豆異黃酮提取量隨超聲時間的延長呈先增加后降低的趨勢。當時間達到40 min時，黑豆異黃酮提取量達到最大值（9.402 68±0.103 73） mg/g，分別為10、20、30、50、60 min的3.14、2.32、1.29、1.23、1.90倍。原因可能為超聲時間小于40 min時，隨著超聲時間增加，提取液與黑豆粉接觸時間增多，黑豆異黃酮溶出率提高，當黑豆異黃酮溶出完全后，隨著提取時間的增加，雜質溶出率也會相應上升，最終導致黑豆異黃酮提取量降低;其次，超聲時間增加，可能導致黑豆異黃酮結構破壞，使其提取量降低。因此，40 min為黑豆異黃酮超聲提取最佳時間。

2.2.2 超聲溫度對黑豆異黃酮提取量的影響。由圖5可知，在液料比40∶1，超聲時間30 min，乙醇濃度70%，功率為270 W的條件下，黑豆異黃酮提取量隨溫度緩慢升高。當溫度達到60 ℃時，提取量達到最大（9.606 41±0.340 11） mg/g。在超聲時間為60 ℃時，提取量分別是25、40、50 ℃的1.40、1.34、1.13倍;當溫度達到70 ℃時，其提取量分別是25、40、50 ℃的1.42、1.35、1.14倍。而溫度為70 ℃的提取量僅僅是溫度60 ℃的1.01倍。因此，從節(jié)能的角度考慮，選擇60 ℃作為最佳溫度。

2.2.3 液料比對黑豆異黃酮提取量的影響。

由圖6可知，在時間30 min、溫度60 ℃、乙醇濃度70%、功率270 W的條件下，隨著液料比不斷增大，黑豆異黃酮提取量呈先增大后減小的趨勢。當液料比為30∶1時，黑豆異黃酮提取量最大，為（9.397 02±0.294 55） mg/g，且分別是液料比10∶1、20∶1、40∶1和50∶1的1.76、1.20、1.35和1.30倍;液料比60∶1與30∶1的黑豆異黃酮提取量相差不大。這可能是在液料比為30∶1時有足夠的溶劑將黑豆異黃酮溶出，再增大液料比會導致黑豆其他雜質溶出，影響了黑豆異黃酮的提取。因此，黑豆異黃酮的最佳提取液料比為30∶1。

2.3 響應面法優(yōu)化結果

2.3.1 模型建立和顯著性分析。

采用 Design-Expert 8.0.6 軟件對中心試驗設計及試驗結果（表3）進行分析，以Y為黑豆異黃酮的響應值，其與超聲時間（A）、液料比（B）、超聲溫度（C）之間的多元二次回歸模型方程為

Y=9.620 0-0.129 7A+0.123 7B-0.654 3C-0.511 4AB+1.200 0AC-0.260 2BC-1.840 0A2-1.230 0B2-0.301 2C2

由表4可知，P<0.001，表明回歸模型具有高度的顯著性。失擬值 P=0.117 0> 0.05，沒有顯著差異，說明回歸方程與試驗擬合良好，誤差小。經計算，確定系數(shù) R2=0.958 4，表明該模型設計預測值與實際值相近，有良好的線性關系;調整系數(shù)R2adj=0.905 0，經調整后，說明該試驗所建立的模型可以解釋的響應值變化有90.50%。故該模型不僅可以得到黑豆異黃酮提取的最優(yōu)工藝，還可以反映黑豆異黃酮類化合物的含量。從F值可以看出，各因素對黑豆異黃酮提取量的影

響表現(xiàn)為超聲溫度（C）>超聲時間（A）>液料比（B），試驗因素中，一次項C，交互項AC和二次項A2、B2的P值均小于0.01，說明對試驗結果有著極顯著影響，而其余項的P值均大于0.05，對試驗指標影響不顯著。

2.3.2 響應面交互作用分析。

為了更直觀地表現(xiàn)2因素間的交互作用對黑豆異黃酮提取量的影響，根據(jù)超聲時間、超聲溫度和液料比對黑豆異黃酮提取量的影響，控制某一因素不變，改變另外2個因素，繪制響應面圖和等高線圖。

基于二次回歸模型建立響應面，分別繪制出各因素之間相互作用、相互影響的響應面和等高線圖（圖 7～9）。

由圖7a可知，超聲時間與液料比的變化曲面呈較為扁平的橢圓形，說明這2個因素對黑豆異黃酮提取量的作用較為顯著，結合圖7b的響應面（較為陡峭），進一步驗證超聲時間與液料比對異黃酮提取量的影響較大。

由圖8a可知，超聲時間與超聲溫度的變化曲面呈扁平狀，說明這2個因素對黑豆異黃酮提取量的影響較大，圖8b的響應面較為陡峭，相比圖7更為明顯，且可看到超聲溫度較超聲時間對黑豆異黃酮提取量的影響大。

圖9a可知，液料比與超聲溫度的變化曲面呈扁平狀，圖9b的響應面與圖7b和圖8b相比并不陡峭，說明液料比和超聲溫度的交互作用對黑豆異黃酮提取量的影響不顯著。

2.3.3 驗證試驗。

通過響應面分析得出該模型最優(yōu)結果：液料比38.063∶1，超聲時間31.604 min，超聲溫度53.207 ℃，黑豆異黃酮提取量的理論值為10.073 mg/g。但是該試驗條件在實際試驗操作中難以完全實施，故對所得理論值進行一定的修正，得到便于試驗操作的提取條件：超聲時間38 min，液料比32∶1，超聲溫度53 ℃。對優(yōu)化后的條件進行3次重復試驗，驗證得到黑豆異黃酮的提取量為（9.403±0.698） mg/g，與預測值相近，證明該模型能夠預測黑豆異黃酮的總提取量。

2.4 不同方法提取黑豆異黃酮樣品粉末SEM表征

為了進一步證明超聲輔助提取法對黑豆異黃酮提取量的影響，不同提取條件下，黑豆粉末的破損程度見圖10。由圖10可知，細胞的破損程度從大到小依次為圖10d、圖10c、圖10a、圖10b，其提取量依次為（9.403±0.698）、（6.805±0.212）、（3.021±0.774）、 （1.878±0.223） mg/g。

2.5 黑豆異黃酮的分離純化

70%乙醇溶液洗脫，過大孔樹脂，得到純度達到（53.37±3.37）%的黑豆異黃酮。V乙酸乙酯∶V甲醇=10∶1為展開劑，薄層硅膠板點樣（黑豆異黃酮），熒光下明顯可見2點（圖11），Rf值分別為1.8 cm （組分 Ⅱ）和3.2 cm （組分 Ⅰ）。經硅膠層析柱分離純化得組分 Ⅰ 和組分 Ⅱ。

2.6 黑豆異黃酮、組分 Ⅰ 和組分 Ⅱ 的DPPH自由基清除能力檢測

由圖12可知，在試驗濃度范圍內（0～0.25 mg/mL），黑豆異黃酮、組分 Ⅰ? 和組分 Ⅱ 對DPPH自由基有清除能力，且與濃度呈正相關，當濃度達到0.25 mg/mL時，黑豆異黃酮、組分Ⅰ和組分Ⅱ的清除率達到（71.28±1.41）%、（34.60±2.95）%和（42.01±1.34）%，黑豆異黃酮的清除率是組分Ⅰ和組分Ⅱ的2.06和1.70倍。黑豆異黃酮、組分 Ⅰ 和組分 Ⅱ 的抗氧化能力表現(xiàn)為黑豆異黃酮>組分Ⅱ>組分Ⅰ。

3 結論

（1）該研究以黑豆為原料，經去脂等預處理，超聲輔助提取黑豆異黃酮類化合物，基于超聲時間、液料比和超聲溫度單因素試驗，通過響應面優(yōu)化提取工藝，確定超聲輔助法提取黑豆異黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)：超聲時間38 min，液料比32∶1 ，超聲溫度53 ℃。在該條件下黑豆異黃酮提取量達（9.403±0.698） mg/g。影響黑豆異黃酮提取量的因素表現(xiàn)為超聲溫度（C）>超聲時間（A）>液料比（B）。按響應面設計最佳提取條件，3次重復試驗實際提取量與預測值（10.073 mg/g）接近。

（2）經大孔樹脂（D-101）純化黑豆異黃酮粗提物，得到純度較高[（53.37±3.37）%]的黑豆異黃酮，過硅膠層析柱，展開劑為V乙酸乙酯∶V甲醇=10∶1，得組分 Ⅰ 和組分 Ⅱ。

（3）黑豆異黃酮、組分 Ⅰ 和組分 Ⅱ 體外抗氧化活性結果表明：黑豆異黃酮、組分 Ⅰ 和組分 Ⅱ 的濃度達到0.25 mg/mL時，DPPH自由基清除率分別達到（71.28±1.41）%、（34.60±2.95）%和（42.01±1.34）%，黑豆異黃酮的清除率是組分Ⅰ

和組分Ⅱ的2.06和1.70倍。黑豆異黃酮、組分 Ⅰ 和組分 Ⅱ

的抗氧化能力表現(xiàn)為黑豆異黃酮>組分 Ⅱ>組分 Ⅰ。

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