賈梓渤，彭健康，朱 燕，陳海峰，王 婧

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

奶牛乳房炎通常是由于病原菌感染、外界損傷或奶牛機體免疫力降低導(dǎo)致的奶牛乳腺的實質(zhì)和間質(zhì)性炎癥［1］。據(jù)統(tǒng)計，全世界有大約34%的奶?；加懈鞣N類型的乳房炎［2］。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國奶牛乳房炎的感染率高達70%，46.4%～85.7%為隱性乳房炎［3］。因此，乳房炎作為奶牛三大常見疾病之一成為困擾養(yǎng)殖戶的難題，嚴重制約了奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

奶牛乳房炎的發(fā)病原因較多，一般由病原微生物感染、胎次、飼喂環(huán)境、飼養(yǎng)管理水平、奶牛自身免疫力等因素綜合影響［4］。根據(jù)炎癥的嚴重程度，可將乳房炎分為臨床型和隱性型，隱性型乳房炎是指在臨床體征上無明顯的變化，但對奶的質(zhì)量和產(chǎn)量造成嚴重影響［5］。通常認為病原微生物感染是引起奶牛隱性乳房炎的主要因素，常見病原微生物包括大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌等，以及一些支原體、真菌等，又以金黃色葡萄球菌為主［6］。

金黃色葡萄球菌主要通過皮膚和口咽部入侵機體，隨后定植于乳腺上皮細胞，損傷奶牛的乳腺組織，引起隱性和慢性乳房炎［7］。由于金黃色葡萄球菌侵入病牛乳房后，被炎癥組織包圍，抗菌藥物不易到達損傷部位，導(dǎo)致耐藥菌株逐年增加，因此，一旦侵入牛群便很難被根除［8］。金黃色葡萄球菌引發(fā)的乳房炎一般呈慢性過程。急性感染相對較少，但是一旦感染，該病原菌就會在乳腺組織中大量繁殖，造成動物反復(fù)感染，并在牛群之間連續(xù)傳播。在該病原菌繁殖過程中產(chǎn)生的一系列毒素因子，也可引起急性壞疽性乳房炎［3，9］。

該研究主要針對江蘇省泰州市某奶牛場中奶牛乳房炎奶樣進行金黃色葡萄球菌的分離、鑒定及藥敏測試，為該奶牛場乳房炎的預(yù)防和治療用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Taq DNA聚合酶、DNA Marker 2 000、DNA提取試劑盒等均購自TAKARA生物公司；血平板、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)、亞碲酸鉀卵黃增菌劑、生化鑒定管、凍干血漿購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Mueller-Hinton肉湯培養(yǎng)液和瓊脂、細菌微量生化反應(yīng)管、血平板、藥敏紙片購自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.2 樣品采集

2020年12月，于江蘇省泰州市某奶牛場采集乳房炎奶樣共9份。

1.3 細菌分離

將采集的奶樣置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，振蕩培養(yǎng)4 h左右，用滅菌棉簽蘸取少量奶樣均勻涂布于Baird-Parker平板中，37℃培養(yǎng)24 h。挑取黑色、有光澤性的疑似菌落，再次劃線接種至TSA平板中進行培養(yǎng)，挑取單個黃色菌落至肉湯中增菌用于鑒定。

1.4 細菌的鑒定

1.4.1 革蘭染色鏡檢

取少量菌液與滅菌水于載玻片上混勻，采用革蘭染色進行染色鏡檢。

1.4.2 生化鑒定試驗

取純化的疑似菌株，接種于細菌微量生化鑒定管進行生化鑒定。接種后置于37℃培養(yǎng)箱中過夜，次日觀察結(jié)果。

1.4.3 溶血性試驗

用接種環(huán)蘸取少量上述純培養(yǎng)肉湯，采用分區(qū)劃線法將菌落接種于血平板中，放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。

1.4.4 血漿凝固酶試驗

在凍干兔血清中加入0.5 mL滅菌生理鹽水至完全溶解，再加入0.3 mL疑似菌落的肉湯培養(yǎng)液混勻，置于37℃培養(yǎng)5 h。觀察結(jié)果時將西林瓶傾斜或倒置，內(nèi)容物不流動則判為陽性，反之則為陰性，以不接菌的肉湯作陰性對照。

1.4.5 PCR鑒定

取500μL新鮮疑似菌液放入指形管，加熱煮沸5 min，以此為模板，參考文獻［10］進行16SrDNA和nuc基因片段的PCR擴增，并經(jīng)1.5%電泳檢測，將nuc基因檢測為陽性的菌株擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5 藥物敏感性試驗

使用K-B紙片擴散法對鑒定為金黃色葡萄球菌的菌株進行藥敏試驗，隨后按照美國臨床實驗室標準委員會標準，根據(jù)抑菌圈直徑判斷結(jié)果，重復(fù)3遍［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征

金黃色葡萄球菌在Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為灰黑色，有光澤，邊緣淺色，周圍有不透明的圓圈，外有一清晰帶。挑取灰黑色或黑色疑似菌落再次接種至TSA培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)后，挑取單個菌落接種于血平板，有溶血現(xiàn)象（見圖1）；染色鏡檢發(fā)現(xiàn)所有菌株呈葡萄串狀樣或短鏈樣排列的革蘭陽性球菌，共篩選出6株（分別編號為20210315D1、20210315D2、20210315D3、20210315 D4、20210315D5、20210315D6。進一步對其進行劃線分離、純化（見圖2）。

圖1 分離菌的溶血性

圖2 分離菌的純化

2.2 金黃色葡萄球菌的生化鑒定

將疑似菌株接種至微量生化鑒定管培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》確定6株細菌均屬于葡萄球菌屬。由于金黃色葡萄球菌致病菌多能分解甘露醇，產(chǎn)生凝固酶，因此，重點對這兩個生化指標進行重復(fù)測定。結(jié)果顯示，共有3株分離 菌 （分 別 編 號 為20210315D1、20210315D2、20210315D3）表現(xiàn)為甘露醇分解（見圖3）和血漿凝固酶均為陽性（見圖4），表明分離到致病性的金黃色葡萄球菌。

圖3 甘露醇試驗

圖4 血漿凝固酶試驗

2.3 金黃色葡萄球菌的PCR鑒定

nuc為金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因，具有高度保守的特性，該試驗根據(jù)參考文獻［10］進行了nuc和16SrDNA片段的擴增，結(jié)果見圖5和圖6。將3株nuc基因擴增為陽性的菌株P(guān)CR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。對16SrDNA序列的BLAST比對分析表明，結(jié)果與甘露醇和血漿凝固酶試驗一致，3株均為金黃色葡萄球菌。

圖5 nuc PCR結(jié)果

圖6 16S r D NA PCR結(jié)果

2.4 藥敏試驗結(jié)果

進一步對分離到的金黃色葡萄球菌進行藥物敏感性測試。試驗共采用18種藥敏紙片，試驗結(jié)果見表1。由表1可知，3株臨床分離的金黃色葡菌球菌均對青霉素G耐藥；有2株菌對四環(huán)素耐藥；2株菌對紅霉素和苯唑西林表現(xiàn)為中介，其余均為敏感。

表1 金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果

3 討論

引起奶牛乳房炎的病原種類復(fù)雜多樣，臨床上多數(shù)奶牛乳房炎是由葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌引起的。張崢臻等［12］對上海地區(qū)2009—2010年隱性乳房炎病原流調(diào)結(jié)果也顯示，病原菌以凝固酶陰性葡萄球菌為主，其次為金黃色葡萄球菌。周國燕等［13］從四川地區(qū)乳腺炎奶樣中分離到的病原菌主要有葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、腸球菌和鏈球菌等。劉肖利等［14］從采自新疆等地的142份乳房炎樣品中分離到5株金黃色葡萄球菌。張楠等［15］從邯鄲地區(qū)采集的31份臨床型奶牛乳房炎奶樣中分離到金黃色葡萄球菌9株。試驗采用特異性顯色培養(yǎng)基對隱性乳房炎奶樣中的金黃色葡萄球菌進行分離、純化和微生物生化鑒定，并結(jié)合16SrDNA PCR測序從9份隱性乳房炎奶樣中分離到6株葡萄球菌，其中3株為金黃色葡萄球菌，表明該奶牛場中存在金黃色葡萄球菌的感染，應(yīng)進一步加強飼養(yǎng)管理并注意奶牛場的衛(wèi)生狀況。

進一步對分離到的金黃色葡萄球菌進行藥敏分析發(fā)現(xiàn)，3株分離菌均對青霉素G耐藥，其中2株對四環(huán)素耐藥，這2種為常用的廣譜抗生素，有報道稱目前全球范圍內(nèi)有90%～95%的金黃色葡萄球菌耐青霉素［16］，這也和國內(nèi)一些報道一致［17-18］。有2株對紅霉素和苯唑西林表現(xiàn)為中介，其余為敏感，為該奶牛場預(yù)防和治療奶牛乳房炎合理選擇抗生素提供了理論依據(jù)。