郭嘉鴻 魏華 徐可 梁照志

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院,河南 新鄉(xiāng) 453000)

糖尿病腎病是臨床常見的疾病之一，隨著病情嚴(yán)重程度的增加導(dǎo)致終末期腎臟病的發(fā)生，因而急需尋找有效阻止糖尿病腎病進(jìn)展的治療方法〔1〕。腎小管上皮細(xì)胞凋亡、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤等造成細(xì)胞外基質(zhì)增多從而引起腎小管損傷、腎間質(zhì)纖維化〔2〕。因而探究腎小管上皮細(xì)胞損傷機(jī)制成為糖尿病腎病的研究重點(diǎn)。微小RNA(miRNA)可能通過影響腎小管上皮細(xì)胞凋亡從而參與糖尿病腎病的發(fā)生〔3〕。微小RNA-326(miR-326)在1型糖尿病患者外周血單核細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，并可能參與糖尿病發(fā)生及發(fā)展過程〔4〕。miR-326在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細(xì)胞中高表達(dá)，其高表達(dá)量與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活動(dòng)度相關(guān)〔5〕。通過生物信息學(xué)分析顯示PHB2可能是miR-326的靶基因，研究表明PHB2在系膜細(xì)胞缺氧模型中表達(dá)降低，并可能參與細(xì)胞缺氧損傷過程〔6〕。本研究通過高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞模擬細(xì)胞損傷模型，觀察細(xì)胞中miR-326、PHB2的表達(dá)水平并分析其對(duì)細(xì)胞凋亡及炎性因子表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2(美國ATCC細(xì)胞庫)；Lipofectamine2000(美國Thermo Fisher)；anti-miR-326、anti-miR-NC、miR-326 mimics、miR-NC、si-PHB2、si-NC(上海吉瑪制藥)兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購自美國CST公司；pcDNA3.1(上海遠(yuǎn)慕生物)；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(大連寶生物工程)；白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測(cè)試劑盒(上海百蕊生物)；細(xì)胞凋亡試劑盒(美國Sigma)；二抗購自武漢艾美捷科技有限公司；兔抗人PHB2抗體(美國Abcam)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)期HK-2細(xì)胞，設(shè)置對(duì)照組(葡萄糖濃度5.5 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基)、高糖組(葡萄糖濃度25 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基)〔7〕。取對(duì)數(shù)期HK-2細(xì)胞接種于24孔板，用Lipofectamine2000分別將anti-miR-NC、anti-miR-326、pcDNA、pcDNA-PHB2、anti-miR-326與si-NC、anti-miR-326與si-PHB2轉(zhuǎn)染至70%融合HK-2細(xì)胞，置于DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，分別記作高糖+anti-miR-NC組、高糖+anti-miR-326組、高糖+pcDNA組、高糖+pcDNA-PHB2組、高糖+anti-miR-326+si-NC組、高糖+anti-miR-326+si-PHB2組。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-326、PHB2 mRNA的表達(dá)水平 采用Trizol法提取各組HK-2細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，擴(kuò)增cDNA。qRT-PCR反應(yīng)檢測(cè)miR-326、PHB2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-6、TNF-α含量 高糖孵育24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，按照試劑盒步驟檢測(cè)IL-6、TNF-α水平。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 每組收集1×104個(gè)HK-2細(xì)胞，按照凋亡檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-326的靶基因 WT-PHB2、MUT-PHB2分別與miR-NC、miR-326 mimics共轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收集HK-2細(xì)胞，檢測(cè)其相對(duì)熒光素酶活性。分別將miR-NC、miR-326、anti-miR-NC、anti-miR-326轉(zhuǎn)染至腎小管上皮細(xì)胞，Western印跡檢測(cè)各組PHB2蛋白水平。

1.2.6Western印跡檢測(cè)PHB2、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 收集各組HK-2細(xì)胞加入適量RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，按照電壓100 V、時(shí)間90 min進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，隨后按照電流300 mA、時(shí)間30 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。用一抗稀釋液(1∶1 000)4℃孵育10 h，再用二抗稀釋液(1∶2 000)25℃孵育1 h。ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-326和PHB2在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷中的表達(dá) 與對(duì)照組相比，高糖組HK-2細(xì)胞中miR-326表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，PHB2 mRNA及蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 兩組PHB2蛋白表達(dá)

2.2抑制miR-326表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 對(duì)照組比較，高糖組IL-6及TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)；與高糖+anti-miR-NC組比較，高糖+anti-miR-326組IL-6、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)，見表1、表2。

2.3抑制miR-326表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，高糖組凋亡率及Bax水平均顯著升高(P<0.05)，而Bcl-2水平顯著降低(P<0.05)；與高糖+anti-miR-NC組比較，高糖+anti-miR-326組凋亡率及Bax水平均顯著降低(P<0.05)，而Bcl-2水平顯著升高(P<0.05)，見表1、表2、圖2、圖3。

1～4：對(duì)照組、高糖組、高糖+anti-miR-NC組、高糖+anti-miR-326組圖2 Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖3 抑制miR-326表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

2.4PHB2過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響 與高糖+pcDNA組相比，高糖+pcDNA-PHB2組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，IL-6和TNF-α水平、Bax蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖4、圖5、表3。

1，2：高糖+pcDNA組、高糖+pcDNA-PHB2組圖4 Western印跡檢測(cè)各組PHB2、Bcl-2及Bax的表達(dá)

圖5 PHB2過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

2.5miR-326靶向調(diào)控PHB2的表達(dá) miR-326與PHB2存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖6。轉(zhuǎn)染miR-326可顯著降低野生型載體WT-PHB2的相對(duì)熒光素酶活性(P<0.05)，見表4。miR-326組PHB2蛋白(0.22±0.03)顯著低于miR-NC組(0.61±0.06，P<0.05)；anti-miR-326組PHB2蛋白(0.93±0.09)顯著高于anti-miR-NC組(0.58±0.05，P<0.05)，見圖7。

圖6 PHB2的3′UTR中含有與miR-326互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖7 miR-326靶向調(diào)控PHB2的表達(dá)

2.6干擾PHB2表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-326表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的作用 與高糖+ anti-miR-326+si-NC組相比，高糖+anti-miR-326+si-PHB2組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)，IL-6和TNF-α水平、Bax蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖8、圖9、表5。

1，2：高糖+anti-miR-326+si-NC組，高糖+anti-miR-326+si-PHB2組，下圖同圖8 Western印跡檢測(cè)PHB2及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖9 干擾PHB2表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-326表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用

3 討 論

miR-326在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)〔8〕。研究表明miR-326在自身免疫性疾病中表達(dá)異?！?〕。相關(guān)報(bào)道指出miR-326可通過激活核因子(NF)-κB信號(hào)通路從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生〔10〕。本研究結(jié)果顯示高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中miR-326的表達(dá)上調(diào)，IL-6、TNF-α水平升高，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似〔11〕，抑制miR-326表達(dá)可明顯降低IL-6、TNF-α水平。本研究結(jié)果顯示高糖處理后，腎小管上皮細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似〔12〕，而抑制miR-326表達(dá)可減弱細(xì)胞凋亡能力。

PHB2可調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖及凋亡等多種細(xì)胞生物學(xué)過程，研究表明PHB2表達(dá)量降低與腎小管上皮細(xì)胞損傷有關(guān)〔13，14〕。

綜上，高糖處理后腎小管上皮細(xì)胞中miR-326表達(dá)上調(diào)，PHB2表達(dá)下調(diào)，抑制miR-326表達(dá)可靶向上調(diào)PHB2表達(dá)從而抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的發(fā)生。