李 莉, 李 碩, 王海燕, 孫 磊

(中國食品藥品檢定研究院, 北京 100050)

為避免化妝品在生產(chǎn)、儲存和使用的過程中受到微生物污染,延長產(chǎn)品保存期限和保障消費者使用安全,生產(chǎn)廠家通常在化妝品配方中添加一種或多種防腐劑[1]。目前化妝品準用防腐劑共有51種,《化妝品安全技術規(guī)范》僅對單一物質的最大允許使用量進行了限定,但未對單一化妝品中可以使用的防腐劑種類數(shù)量做出規(guī)定,也未對產(chǎn)品中多種防腐劑混合使用的最大使用量進行限定。市售化妝品中多種防腐劑配合使用的情況較為普遍,加入多種防腐劑不但可以擴大抗菌廣譜性,起到較好的抑菌作用,同時還可以降低每種防腐劑的用量,避免超出限量[2]。防腐劑需要達到一定的使用濃度才能發(fā)揮其抑菌的功效,因此添加量一般在千分比到百分比的級別[2,3]。

目前,化妝品中防腐劑的檢測方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質譜法等[3-7]。高效液相色譜法靈敏、高效,選擇性強,而且51種準用防腐劑中大部分組分都能用該法分析,所以該技術已經(jīng)成為應用最廣泛的檢測方法。色譜柱是高效液相分離系統(tǒng)中最重要的環(huán)節(jié),色譜柱的類型決定色譜系統(tǒng)的性質,色譜柱的粒徑和長度影響分析時間和分析效率[8],采用不同品牌、不同型號的色譜柱分析具體樣品時,由于色譜柱硅膠純度、鍵合工藝和封尾技術等工藝方面的不同造成選擇性差異較大,溶質的保留值、色譜峰之間的分離度甚至色譜峰順序都可能出現(xiàn)較大的差異[9-11]。特別是當樣品基質中含堿性或弱酸性化合物時這種風險更為顯著[9]。如果使用的色譜柱不合適，目標物色譜峰和干擾峰之間分離度則達不到要求，從而影響定性和定量結果的準確性。因此,在實際檢驗工作中,尤其是進行高效液相色譜法分析時,色譜柱的選擇是一項十分重要且困難的工作,關系到整個實驗的成敗[12]。我國《化妝品安全技術規(guī)范》理化檢驗方法在描述高效液相色譜方法時,通常僅列出色譜柱的填料種類、孔徑、顆粒大小等基本信息,如“C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)或等效色譜柱”,為了避免商業(yè)競爭,在非必要條件下一般不予公開方法使用的色譜柱品牌、型號等具體信息。雖然這樣做的初衷是為了體現(xiàn)方法的公平性,但也在一定程度上增加了檢驗方法實際執(zhí)行的難度,特別是多種組分同時分析時,色譜柱的選擇存在一定的盲目性。

自20世紀70年代開始,國內外不少研究人員開始研究影響色譜柱選擇性的因素,嘗試建立量化表征方法,用于比較不同品牌型號色譜柱的選擇性差異。根據(jù)色譜柱填料的不同將C18色譜柱分為3類[13]: A型色譜柱(早期開發(fā)的色譜柱,硅膠純度較低,硅羥基和金屬殘留較高)、B型色譜柱(新型色譜柱,硅膠純度較高,金屬殘留量低,是目前市場上主流色譜柱)、E型色譜柱(C18鏈內嵌極性基團或極性基團封尾的色譜柱)。但這種分類模式比較籠統(tǒng),與色譜柱的選擇性缺乏關聯(lián),難以表征色譜柱選擇性的差異[10]。21世紀初,研究者通過采用不同的色譜柱參數(shù)和化學計量學方法,逐漸建立色譜選擇性的柱表征體系[10,11]。目前比較有影響力的色譜柱數(shù)據(jù)庫包括[9]: USP(United States Pharmacopeia)、PQRI(Product Quality Research Institute)、KUL(Katholieke Universiteit Leuven)和ACD(Advanced Chemistry Development)數(shù)據(jù)庫,每個數(shù)據(jù)庫都包含了數(shù)百種色譜柱信息,但以上4個數(shù)據(jù)庫均未收載國產(chǎn)色譜柱的信息?；瘖y品種類繁多，成分復雜,如何對多組分進行有效分離一直是化妝品分析檢測的難點,本研究以《化妝品安全技術規(guī)范》收載的23種防腐劑的測定方法為例,探討色譜柱對高效液相色譜分析結果的影響,并結合現(xiàn)有的色譜柱研究成果和評價手段,嘗試對不同色譜柱針對化妝品23種防腐劑的選擇性及等效性進行評價和預測,以期為化妝品理化檢驗中該類難題的解決提供研究思路和數(shù)據(jù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters e2695高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器,美國Waters公司;Agilent 1260高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器,美國Agilent公司;XP205電子天平,瑞士Mettler-Toledo公司。C18色譜柱規(guī)格、型號、廠家等參數(shù)見表1。

23種防腐劑標準品及其純度信息見表2。甲醇、乙腈、二甲亞砜均為色譜純,購自德國Merck公司;磷酸為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

參照《國家藥監(jiān)局關于將化妝品中防腐劑檢驗方法等7項檢驗方法納入化妝品安全技術規(guī)范(2015年版)的通告》(2021年第17號)新發(fā)布的《化妝品安全技術規(guī)范》第4章4.1節(jié)甲基異噻唑啉酮等23個組分的檢驗方法(該方法以下簡稱為“規(guī)范方法”)對化妝品中23種防腐劑進行測定。

1.2.1標準溶液的配制

混合標準儲備溶液:準確稱取23種標準品適量(精確至0.000 01 g),置于同一容量瓶中,先用2 mL二甲亞砜溶解,再用乙腈定容至刻度,搖勻,置于4 ℃冰箱中冷藏保存。

混合標準工作溶液:取混合標準儲備溶液適量,用甲醇稀釋得混合標準工作溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2液相色譜分析條件

色譜柱:C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:30 ℃;流動相A:磷酸水溶液(量取磷酸1.2 mL,加水至1 000 mL,混勻);流動相B:乙腈;流速:1.0 mL/min;梯度洗脫程序:0～5 min, 10%B; 5～29 min, 10%B～50%B; 29～41 min, 50%B ～35%B; 41～52 min, 35%B～65%B; 52～57 min, 65%B ～95%B; 57～62 min, 95%B～10%B;進樣量:10 μL。檢測波長(λ)信息見表2。

表 1 色譜柱信息Table 1 Information of chromatographic columns

1.2.3樣品測定

取混合標準工作溶液按照1.2.2節(jié)液相色譜條件,用表1中的15款色譜柱在Waters e2695高效液相色譜儀和Agilent 1260高效液相色譜儀上分別進行測定。記錄23種組分的保留時間、出峰順序等色譜柱的保留行為,并計算分離度(R)和理論塔板數(shù)(n)。

2 結果與討論

2.1 不同色譜柱的分離效果

在Waters e2695液相色譜儀上按照1.2.2節(jié)條件,分別用15款色譜柱對23種防腐劑組分進行測試,從部分有代表性的色譜圖可以看出,不同品牌型號C18柱的分離效果存在明顯差異(見圖1)。經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn),在不改變規(guī)范方法流動相洗脫程序等其他條件的前提下,15款色譜柱中只有2款色譜柱(Capcell Pak MG Ⅲ C18和ZORBAX SB-C18)能夠將23種組分完全分離,其他13款色譜柱都存在部分組分分離度不佳的情況。

圖 1 采用不同色譜柱在Waters e2695液相色譜儀上檢測23種防腐劑的色譜圖(λ=280 nm)Fig. 1 Chromatograms of the 23 preservatives using different chromatographic columns on Waters e2695 HPLC (λ=280 nm) Nos. 1-23 were consistent with the compound numbers in Table 2.

2.2 不同色譜柱對同類物質的分離情況

4-羥基苯甲酸苯酯、4-羥基苯甲酸異丁酯、4-羥基苯甲酸丁酯、4-羥基苯甲酸芐酯等同類物質及同分異構體保留時間相近,是色譜分離的關鍵點之一。色譜柱的分離效能最重要的評價指標為分離度和理論板數(shù)。選取4-羥基苯甲酸丁酯為代表組分計算理論板數(shù)和其與相鄰色譜峰(前峰為4-羥基苯甲酸異丁酯,后峰為4-羥基苯甲酸芐酯)的分離度R1和R2(λ=254 nm),結果見表3?？梢钥闯?同一色譜柱在2臺儀器上的理論塔板數(shù)相近,不同色譜柱之間的理論板數(shù)差異較大,但理論板數(shù)和4-羥基苯甲酸酯類物質的分離效果不成正相關;15款色譜柱中除5款色譜柱對于4-羥基苯甲酸丁酯和4-羥基苯甲酸異丁酯這組同分異構體的分離效果稍差外,其余11款色譜柱都能實現(xiàn)基線分離(分離度≥1.5)。但是對于4-羥基苯甲酸丁酯和4-羥基苯甲酸芐酯,僅有6款色譜柱能實現(xiàn)良好分離。不同色譜柱對4-羥基苯甲酸酯類的保留行為選擇性差異較大,僅控制色譜柱柱效并不能保證該類物質的分離效果。

2.3 不同色譜柱對不同類物質的分離情況

選取對4-羥基苯甲酸苯酯、4-羥基苯甲酸異丁酯、4-羥基苯甲酸丁酯、4-羥基苯甲酸芐酯等物質分離效果較好的5款色譜柱,考察不同色譜柱對4-羥基苯甲酸甲酯、氯苯甘醚、脫氫乙酸、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷的分離情況。計算用Waters e2695液相色譜儀檢測時,目標組分與相鄰色譜峰的R值,結果見表4?？梢钥闯?4-羥基苯甲酸甲酯、氯苯甘醚、脫氫乙酸、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷雖然結構差異較大,檢測波長也不同,但在C18色譜柱上保留行為相似,色譜峰的保留時間相近。這4種化合物在5款色譜柱上的分離度存在明顯差異,4-羥基苯甲酸甲酯和氯苯甘醚在InertSustain AQ-C18色譜柱上沒有完全分離。雖然4種化合物采用不同的檢測波長檢測一定程度上減少了色譜峰分離度不足對定量結果帶來的影響,但是由于部分物質在多個波長下均有吸收,如果與相鄰色譜峰不能實現(xiàn)基線分離,對低濃度待測組分檢測時仍會引起較大誤差。

表 3 4-羥基苯甲酸丁酯在不同色譜柱上的理論塔板數(shù)及與相鄰峰的分離度(λ=254 nm)Table 3 Plate counts (n) and resolutions (R) with two adjacent peaks of butyl 4-hydroxybenzoate using different chromatographic columns (λ=254 nm)

2.4 不同色譜柱對色譜峰出峰順序的影響

不同色譜柱對23種防腐劑的保留行為差異除了體現(xiàn)在分離度上之外,在色譜峰的出峰順序上也存在顯著不同。實驗結果表明,在用Waters e2695液相色譜儀檢測時,4-羥基苯甲酸(圖2中3號峰)和甲基氯異噻唑啉酮(圖2中4號峰)在7款色譜柱(DIAMONSIL C18、InertSustain AQ-C18、Xbridge Shield RP C18、Xselect T3、Capcell Pak MG C18、Capcell Pak MG Ⅱ C18和Capcell Pak MG Ⅲ C18)上的出峰順序和規(guī)范方法給出的參考色譜圖出峰順序相反。4-羥基苯甲酸和甲基氯異噻唑啉酮在Unitary C18和LUNA C18(2)這2款色譜柱上的色譜峰完全重疊,沒有分開(見圖2)。

對于化妝品中多組分檢測項目,實際工作中往往需要配制十幾種或幾十種標準溶液,費時費力,極大制約了工作效率,因此一些試劑公司推出了按照規(guī)范方法預先配制好的混合標準溶液等產(chǎn)品。檢驗人員在使用這些產(chǎn)品給工作帶來便捷的同時,還應注意由于色譜柱選擇不合適帶來的誤判問題。在標準方法或規(guī)范方法首次驗證或更換色譜柱檢測時,都應當使用單一化合物的標準品對色譜峰的出峰順序進行確證。

2.5 等效色譜柱選擇系統(tǒng)的應用

USP網(wǎng)站(https://apps.usp.org/app/USPNF/columnsDB. html)提供USP和PQRI數(shù)據(jù)庫中2種色譜柱相似度計算和預測工具。選擇參比色譜柱后,可獲得其他色譜柱與參比色譜柱相似度值(F),F越小,說明2款色譜柱的選擇性越相似,當F≤3時,認為2款色譜柱的選擇性相似,可視為等效色譜柱。以規(guī)范方法制定單位在該方法編制說明中給出的色譜柱(Agilent ZORBAX SB-C18)為參比柱,查閱USP網(wǎng)站2個色譜柱數(shù)據(jù)庫提供的相似度值,將實驗所用典型色譜柱的實際分離效果與數(shù)據(jù)庫選擇性差異的預測結果進行比較,結果見表5。

圖 2 采用不同色譜柱在Waters e2695液相色譜儀上 檢測時4-羥基苯甲酸和甲基氯異噻唑啉酮的色譜圖(λ=280 nm) Fig. 2 Chromatograms of 4-hydroxybenzoic acid and methylisothiazolinone using different chromatographic columns on Waters e2695 HPLC (λ=280 nm) 3. 4-hydroxybenzoic acid; 4. methylchloroisothiazolinone.

表 5 典型C18柱的實際分離效果與數(shù)據(jù)庫預測結果的比較Table 5 Comparison of practical separation results and predicted results based on the databases of typical C18 columns

USP數(shù)據(jù)庫結果:有7款色譜柱收載于USP數(shù)據(jù)庫中,與ZORBAX SB-C18柱的相似度值FUSP全部小于3,然而實際分離效果中4-羥基苯甲酸和甲基氯異噻唑啉酮在5款色譜柱上出現(xiàn)峰重疊或出峰順序顛倒(見圖2),只有ZORBAX Extend-C18柱和Xbridge C18柱2款色譜柱得到的23種防腐劑的圖譜與參比柱的圖譜接近,但兩款色譜柱都存在部分色譜峰分離度達不到基線分離的現(xiàn)象(見表3)。

PQRI數(shù)據(jù)庫結果:有12款色譜柱收載于PQRI數(shù)據(jù)庫中,查閱與ZORBAX SB-C18柱的相似度值FPQRI,可知12款色譜柱的相似度值均大于3,都不能視為等效色譜柱。盡管與參考色譜柱的相似度值為12.05,但是實際分離效果結果顯示,Capcell Pak MG Ⅲ C18柱仍能實現(xiàn)對23種組分的良好分離(見圖1)。

從現(xiàn)有的實驗數(shù)據(jù)分析,USP網(wǎng)站提供的2種色譜柱選擇數(shù)據(jù)庫無法預測出合適的等效色譜柱,對23種防腐劑的液相色譜分析參考價值均較小,這可能與待測組分結構，以及其他色譜條件如流動相pH和柱溫等因素有關,進而說明化妝品中多組分分析的復雜性。

2.6 應對措施探討

液相色譜方法容易受到儀器型號、流動相組成及其pH值、色譜柱、柱溫和流速等因素影響[14,15]。標準方法或規(guī)范方法會被不同實驗室、不同人員在不同時間和試驗條件下使用,可能會發(fā)生許多異?；蚱?。隨著液相色譜方法研究和應用的深入,色譜系統(tǒng)適用性也逐漸受到重視,當檢測結果容易受實驗條件變化影響時,應當對方法進行合理控制或是指明注意事項?！吨袊幍洹?020年版第四部通則0512高效液相色譜法規(guī)定[16]:色譜參數(shù)除填充劑種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外,其余如色譜柱內徑與長度、填充劑粒徑、流動相流速、流動相組分比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等,均可適當調整以滿足系統(tǒng)適應性要求。《化妝品安全技術規(guī)范》中對液相色譜方法的系統(tǒng)適應性及如何進行色譜參數(shù)調整均未做任何說明。方法應用時如果遇到待測組分分離度不佳或雜質峰干擾時,實驗人員勢必會對方法進行改動,從而造成方法偏移。如果這種更改不加以指導和限制,就會給檢測結果的準確性帶來很多不可控因素。為解決上述問題,一方面,標準研制單位可以在方法開發(fā)初始,通過進行耐用性試驗對影響因素做出一定的模擬或預判,以保證方法的可靠性和有效性;另一方面,雖然為體現(xiàn)公正性和避免商業(yè)競爭,方法在非必要條件下一般不予公開方法制修訂時使用的色譜柱商標等,但是如果測試條件對色譜柱要求苛刻,那么在規(guī)定色譜條件時,可以參照食品安全國家標準[17,18]細化色譜柱分類和增加描述信息,并注明可以接受變動的范圍,或者以標準方法釋義[19]、編制說明[20]或資料性附錄等方式,明確色譜柱具體參數(shù),以便于研究人員選擇合適的色譜柱,獲得最佳的分離效果。

3 結論

通過應用《化妝品安全技術規(guī)范》中收載的23種防腐劑測定方法,對不同色譜柱分離效果進行分析,并嘗試用等效色譜柱選擇系統(tǒng)對色譜柱進行評價和預測。實驗結果表明:色譜柱是影響化妝品中23種防腐劑液相色譜法測定結果準確性的關鍵因素,不同品牌C18色譜柱的選擇性差異明顯,但目前仍缺乏能有效預測等效色譜柱的評價機制。有關檢驗機構在應用規(guī)范方法時,應考慮色譜柱選擇性差異。建議化妝品標準(規(guī)范)管理部門在起草和執(zhí)行標準(規(guī)范)方法時,增加系統(tǒng)適應性和方法耐用性的考察要求,細化色譜柱的分類和系統(tǒng)篩選工作,指導色譜柱的合理選擇,減少因色譜柱選擇差異導致的結果不準確等問題。如何在現(xiàn)有研究成果的基礎上,開發(fā)色譜柱的篩選和預測評價體系,進而指導實際樣品的分離以適應化妝品基質復雜的特點是下一步研究的重點和難點。