王雪婷, 李靜靜, 姜 珊, 沈偉健, 王毅謙, 顧 強

(1. 南京海關動植物與食品檢測中心, 江蘇 南京 210001; 2. 張家港海關綜合技術中心, 江蘇 張家港 215600)

氯丙二醇酯(monochloropropanediol esters, MCPDEs)是氯丙二醇與脂肪酸的酯化產(chǎn)物,其中3-氯丙二醇酯(3-monochlorpropanediol esters, 3-MCPDEs)在胰酯酶作用下會釋放出具有潛在致癌性的3-氯丙二醇(3-MCPD)[1]。有文獻報道,在未精煉的原油中幾乎不含有3-MCPDEs(<0.05 mg/kg),然而在精煉油中3-MCPDEs的含量卻會顯著增加(0.2～20 mg/kg)[2]?？s水甘油酯(glycidyl esters, GEs)是縮水甘油與脂肪酸的酯化產(chǎn)物,是制備3-MCPDEs的前體物,本身并不具有致癌性。研究表明,精煉油中10%～60%的3-MCPDEs是由GEs轉化而來的[3]。現(xiàn)如今3-MCPDEs和GEs已成為繼反式脂肪酸之后油脂精煉加工過程中產(chǎn)生的新型潛在危害因子[4]。到目前為止,我國尚未設立油脂中MCPDEs和GEs的限量值,但2018年歐盟發(fā)布的(EU)2018/290號法規(guī)已對油脂中GEs總量給出了界限值。為嚴格控制加工油脂中MCPDEs和GEs的含量水平,確保食用植物油的安全,建立可靠的分析方法是首要工作。

現(xiàn)階段國內外已建立了多種分析方法測定3-MCPDEs[5-10],但2-氯丙二醇酯(2-monochlorpropanediol esters, 2-MCPDEs)和GEs的定量分析方法發(fā)展相對滯后。已報道的GEs檢測方法有液相色譜-質譜聯(lián)用法[11,12](直接法)和氣相色譜-質譜聯(lián)用法[13-19](間接法),其中間接法只需一個單一的酯類標準品就可測得GEs總量因而更適合于常規(guī)分析。在使用間接法測定MCPDEs和GEs的研究中,根據(jù)酯交換反應使用的催化劑類型不同,間接法又分為堿催化間接法和酸催化間接法。堿催化間接法由于酯交換反應時間快,檢驗周期短,已有很多文獻報道,國家標準和海關總署發(fā)布的行業(yè)標準也都采用了此法,但是在堿性介質中3-MCPD、2-氯丙二醇(2-MCPD)和3-溴丙二醇(3-MBPD)很容易發(fā)生副反應生成游離態(tài)的縮水甘油,進而會造成過低評估樣品中3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs總量,影響檢測結果的準確性[20-22]。此外,國家標準和行業(yè)標準無法實現(xiàn)3類物質的同時測定;行業(yè)標準檢測最終結果將GEs的總量以3-MCPD計也與歐盟限量要求不符?；谏鲜鲈?本方法以美國油脂化學協(xié)會AOCS Cd 29a-13方法[23]為基礎,增加了2-MCPDEs的同位素內標,選取了響應高且無干擾的監(jiān)測離子,并通過優(yōu)化前處理條件建立了一種酸性酯交換間接分析法,它可以同時對植物油中3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs的總量進行準確定量分析,且定量方式完全符合歐盟要求。在試樣制備過程中,我們使用酸性酯交換反應有效避免3-MCPD、2-MCPD和3-MBPD副反應的發(fā)生;通過對溴化反應溫度、溴化反應時間、衍生化試劑用量等前處理條件的優(yōu)化,取得較好的效果。該方法重現(xiàn)性好,準確度高,適用于實驗室對植物油中這3類加工污染物的常規(guī)檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

7890B-5977A氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(美國Agilent科技有限公司); SQP Quintix224-1CN電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司); KH-500SP超聲波振蕩器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司); BS-06恒溫水浴搖床(韓國jeiotech公司); WH-3渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠); Auto Vap S60氮吹儀(美國ATR公司)。

正己烷、丙酮、甲醇、四氫呋喃、甲苯均為色譜純(美國Fisher公司);溴化鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉、硫酸均為優(yōu)級純(國藥集團);苯基硼酸(phenyl boronic acid, PBA,純度97%,美國Sigma公司);實驗用水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯(純度99.6%,英國LGC公司), D5-3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯(純度98%,加拿大TRC公司), 2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯(純度98%,加拿大TRC公司), D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯(純度98.2%, BePure公司),棕櫚酸縮水甘油酯(純度98.0%, BePure公司), D5-棕櫚酸縮水甘油酯(純度96%,加拿大TRC公司)。

112批油脂樣品來源于本地超市及電商銷售平臺。

1.2 實驗方法

1.2.1標準溶液的配制

分別準確稱取3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯標準品53.14 mg、D5-3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯標準品51.27 mg、2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯標準品58.21 mg、D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯標準品56.13 mg、棕櫚酸縮水甘油酯標準品42.18 mg、D5-棕櫚酸縮水甘油酯標準品40.15 mg至6個10 mL棕色容量瓶中,以甲苯為溶劑配制質量濃度均為1 000 mg/L的單標準儲備液(以對應的氯丙二醇、氘代氯丙二醇、縮水甘油和氘代縮水甘油計), -20 ℃避光保存,有效期2年。

將氯丙二醇酯和縮水甘油酯單標準儲備液(1 000 mg/L)用甲苯稀釋配制成10 mg/L(以對應的氯丙二醇和縮水甘油計)的混合標準工作液,-20 ℃避光保存,有效期1年。

將內標儲備液(1 000 mg/L)用甲苯稀釋配制成10 mg/L(以對應的氘代氯丙二醇和氘代縮水甘油計)的混合內標工作液,-20 ℃避光保存,有效期1年。

1.2.2樣品前處理

準確稱取0.25 g(精確至0.000 1 g)植物油樣品于10 mL螺口玻璃試管中,準確加入25 μL混合內標工作液,再加入2 mL四氫呋喃,渦旋溶解,作為待反應液。

向待反應液中加入30 μL酸性溴化鈉溶液(溴化鈉3 mg/mL,含5%(v/v)硫酸),旋緊蓋子,渦旋混合,在50 ℃水浴反應15 min;加入3 mL碳酸氫鈉溶液(6 g/L)終止反應。隨后加入2 mL正己烷,渦旋振蕩15 s,靜置,取上清液于另一10 mL螺口玻璃試管中,再用正己烷重復提取1次,合并提取液,40 ℃氮吹至近干,加入1 mL四氫呋喃溶解殘渣,作為待凈化液。

向待凈化液中加入1.8 mL硫酸-甲醇溶液(1.8%, v/v),渦旋混合10 s,旋緊瓶蓋,置于40 ℃恒溫水浴中反應16 h。加入0.5 mL飽和碳酸氫鈉溶液終止反應,渦旋10 s,氮吹除去有機溶劑。再向剩余液中依次加入2 mL硫酸鈉溶液(200 g/L), 2 mL正己烷,渦旋混合10 s,靜置分層后,棄去上層正己烷,再用正己烷重復萃取1次,棄去上層正己烷,得到下層凈化液備用。

向凈化液中加入300 μL飽和苯基硼酸溶液,渦旋10 s后,于室溫下超聲5 min。取出后,加入2 mL正己烷,渦旋10 s,靜置分層后,取上層正己烷至另一潔凈的玻璃試管中。再用正己烷重復提取1次,合并提取液,40 ℃氮吹至近干。用1 mL正己烷溶解殘渣,渦旋10 s,經(jīng)0.45 μm尼龍微孔濾膜過濾后進行測定。

1.2.3分析條件

GC條件 DB-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×1 μm);進樣口溫度280 ℃;升溫程序為80 ℃保持0.5 min,以20 ℃/min速率升溫至180 ℃,保持0.5 min,再以5 ℃/min速率升溫至200 ℃,保持4 min,最后以40 ℃/min速率升溫至300 ℃,并保持4 min;進樣方式為脈沖不分流;進樣量1 μL。

MS條件 電子轟擊離子源(EI);電離能量70 eV;離子源溫度280 ℃;四極桿溫度150 ℃,傳輸線溫度280 ℃;掃描方式為選擇離子掃描(SIM);溶劑延遲6 min;定時事件14 min MS關閉;3種目標化合物及其內標的保留時間和定量、定性離子見表1。

表 1 3種目標化合物及其內標的保留時間和定量、定性離子Table 1 Retention times, quantitative and qualitative ions of the three target compounds and their internal standards (IS)

2 結果與討論

2.1 3種目標化合物儀器條件的建立

本方法的建立是基于在酸性條件下,GEs的環(huán)氧環(huán)易受親核試劑的攻擊而被打開,生成單?；视蜆臃肿?。由于溴化物與氯化物的相似性較高,在質子溶劑中反應活性較大,當親核試劑是含溴離子的鹵化物時,GEs會轉化為2-MBPD單酯或3-MBPD單酯。已有研究表明,GEs上脂肪酸鏈引起的空間位阻效應使其以形成3-MBPD單酯為主(3-MBPD與2-MBPD的信號響應比在13～15之間)[23]。因2-MCPD、3-MCPD和3-MBPD具有相似的分子結構,我們可以使用同一種衍生試劑——苯基硼酸,實現(xiàn)對樣品中2-MCPDEs、3-MCPDEs和GEs的同步定量分析。

將3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯、2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯及棕櫚酸縮水甘油酯用甲苯配制成10 mg/L的單標準溶液,D5-3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯,D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯及D5-棕櫚酸縮水甘油酯用甲苯配制成5 mg/L的單標準溶液,經(jīng)鹵化、水解、衍生后,用全掃描方式進行測定,以此獲得各目標化合物的特征離子。3種目標化合物及其內標在GC-MS分析條件下,經(jīng)全掃描模式分析得到相應的總離子流圖和質譜圖見圖1。

圖 1 3種目標化合物及其內標的總離子流圖和質譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms and mass spectra of the three target compounds and their IS The concentrations of the three target substances were 10 mg/L, and the concentrations of their IS were 5 mg/L.

從圖1中可以看出,3種目標化合物在該GC-MS分析條件下響應及分離度良好;選取響應高且無干擾的監(jiān)測離子,可以降低噪聲和其他干擾效應,提高檢測靈敏度,在選擇離子監(jiān)測模式下,3種目標化合物及其內標的定量和定性離子見表1。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1溴化反應條件的優(yōu)化

Hrncirik等[24]已詳細研究了硫酸和親核試劑溴化鈉濃度對縮水甘油酯轉化成3-MBPD單酯效率的影響,本方法直接引用其結果,僅考察了溴化反應溫度(30、40、50、60和70 ℃)和溴化反應時間(5、10、15、20和25 min)對縮水甘油酯轉化成3-MBPD單酯效率的影響。準備待測樣品10份,在樣品中加入100 μL混合內標工作液,在不同的溴化反應溫度和溴化反應時間下,按照1.2.2節(jié)進行處理,內標D5-3-MBPD-PBA的峰面積結果見圖2。

圖 2 (a)溴化反應溫度和(b)溴化反應時間對植物油樣品中 內標D5-棕櫚酸縮水甘油酯轉化效率的影響Fig. 2 Effect of (a) bromination reaction temperature and bromination reaction time (b) on the conversion efficiency of IS D5-glycidyl palmitate in vegetable oil samples

從圖2中可以發(fā)現(xiàn),較高的溫度和較長的反應時間都會對縮水甘油酯的轉化效率造成影響。為獲得縮水甘油酯的最佳轉化效率,最終我們選取50 ℃下反應15 min作為溴化反應的最佳條件。

2.2.2衍生化反應條件的優(yōu)化

3-MBPDEs、3-MCPDEs、2-MCPDEs及其同位素內標物經(jīng)硫酸-甲醇水解后分別生成了3-MBPD、D5-3-MBPD、3-MCPD、D5-3-MCPD、2-MCPD和D5-2-MCPD,再經(jīng)PBA衍生后得到3種目標化合物及3種內標化合物,即3-MBPD-PBA、D5-3-MBPD-PBA、3-MCPD-PBA、D5-3-MCPD-PBA、2-MCPD-PBA和D5-2-MCPD-PBA。考察了衍生化試劑的使用體積(100、200、300、400和500 μL)和衍生化反應時間(5、10、15、20和25 min)對測定結果的影響。

圖 3 (a)衍生化試劑的使用體積和(b)衍生化反應時間 對植物油樣品中3種內標測定結果的影響Fig. 3 Effect of (a) volume of derivatization reagent and (b) derivatization reaction time on the determination results of three IS in vegetable oil samples

準備待測樣品10份,將樣品中加入500 μL混合內標工作液,在衍生化試劑不同使用量和反應時間下,按照1.2.2節(jié)進行處理,3種內標化合物的峰面積結果見圖3。如圖3a所示,衍生化試劑的用量對內標D5-棕櫚酸縮水甘油酯的影響最為明顯,綜合考慮3種內標的信號響應情況,最終我們選取衍生化試劑用量為300 μL;圖3b顯示,衍生化反應時間對3種內標的信號響應值影響較小,在5 min時衍生化反應已基本完成,出于節(jié)約時間方面考慮,最終選擇衍生化時間5 min。

2.3 方法學指標考察結果

2.3.1標準曲線、檢出限和定量限

準確移取混合標準工作液和內標工作溶液適量于6個10 mL螺口玻璃試管中,按1.2.2節(jié)步驟與試樣同時處理。得到質量濃度為0.01、0.05、0.10、0.20、0.40和0.80 mg/L的系列混合標準溶液,其中內標的質量濃度均為0.25 mg/L,按濃度由低到高的順序進樣分析。

以目標化合物及其對應氘代同位素內標的濃度比值為橫坐標,以目標化合物及其對應氘代同位素內標的峰面積比值為縱坐標,繪制標準曲線,從而獲得線性方程和相關系數(shù)(r2),見表2。結果表明,線性相關系數(shù)均大于0.999,說明目標化合物在0.01～0.80 mg/L范圍內具有良好的線性關系。

以定量離子信噪比(S/N)為3和10時的響應定義方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ), 3-MCPDEs、2-MCPDEs及GEs的檢出限和定量限分別為25、25、20 μg/kg和75、75、60 μg/kg。

表 2 目標化合物的線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients (r2), limits of detection (LODs) and limits of quanti-fication (LOQs) of target compounds CompoundLinear equation r2LOD/(μg/kg)LOQ/(μg/kg)3-MCPD-PBAy=17.770068x-0.1961560.999825752-MCPD-PBAy=0.391145x+0.0014310.999825753-MBPD-PBAy=0.722427x-0.0077600.99992060 y: peak area ratio of the analyte to the internal standard; x: mass concentration ratio of the analyte to the internal standard.

2.3.2準確度和精密度

按照前述方法,對大豆油、菜籽油、葵花籽油和亞麻籽油4種樣品進行添加回收試驗,設定添加水平為250、500、750 μg/kg,考察方法的準確度和精密度,結果見表3。不同基質中3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs的加標回收率為89.0%～98.7%,相對標準偏差(RSD)為2.05%～7.81%,實驗結果表明該方法具有良好的準確性和精密度。

2.4 本方法與標準方法測定值的比較

采用本文所建立的方法、國家標準方法(GB 5009.191-2016)和行業(yè)標準方法(SN/T 5220-2019)測定了植物油(樣品編號:FAPAS 2662)中3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs的值,結果見表4。從表4可知,由于標準方法中使用了甲醇鈉-甲醇溶液進行酯鍵斷裂反應,易造成3-MCPD、2-MCPD和3-MBPD副反應的發(fā)生,實驗結果的重復性不好且測定值會偏低一些。

表 5 實際樣品中3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs的檢測結果Table 5 Detected results of 3-MCPDEs, 2-MCPDEs and GEs in real samples

表 3 3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs在植物油樣品中的添加回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 3-MCPDEs, 2-MCPDEs and GEs in vegetable oils (n=6)

表 4 不同方法測得的植物油中3種目標物的含量(n=6)Table 4 Contents of three target substances in vegetable oil by different methods (n=6)

2.5 市售樣品分析評價

采用本文建立的方法對市售的112批植物油,包括大豆油、菜籽油、葵花籽油、玉米油、芝麻油樣品進行分析,在84批樣品中檢出3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs(測定值范圍見表5),檢出率高達75%;部分大豆油、菜籽油和芝麻油中GEs含量高出歐盟(EU)2018/290號法規(guī)中的限量值(GEs≤1 mg/kg),超標率分別為9.1%、7.5%和45.5%。

3 結論

本文所建立的酸性酯交換法既可避免副反應的發(fā)生,又可彌補現(xiàn)有標準中無法對3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs同時進行測定的缺失。方法分析效率高、準確度好、重復性佳,對我國植物油中3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs污染水平的控制、檢測標準的制定和生產(chǎn)工藝的優(yōu)化具有一定的理論和現(xiàn)實意義。