1株海洋芽孢桿菌對黃瓜灰霉病的防治效果及防治機制研究

方佩 羅遠(yuǎn)嬋 田黎 李淑蘭 李元廣

摘要：為研究1株海洋芽孢桿菌對黃瓜灰霉病的防治效果及防治機制，從室內(nèi)生測、盆栽藥效及田間藥效3個方面研究了1株海洋芽孢桿菌對黃瓜灰霉病的防治效果。同時，從拮抗作用、定殖特性、誘導(dǎo)抗病性3個方面來研究其生防機制。室內(nèi)生測及盆栽藥效結(jié)果表明，該菌株對灰霉病菌的抑菌作用顯著優(yōu)于對照藥劑嘧霉胺（P<0.05），其發(fā)酵液處理在接種病原菌5 d后對黃瓜灰霉病的盆栽防效為83.23%。此外，菌株制劑300倍液對灰霉病的田間治療效果達(dá)77.31%。防治機制研究表明，該菌株發(fā)酵上清液能使灰霉病菌菌絲畸形生長，原生質(zhì)濃縮并外滲，導(dǎo)致菌絲死亡;能抑制灰霉病菌孢子萌發(fā)，并導(dǎo)致萌發(fā)孢子不能正常生長;該菌株能在黃瓜苗的根、莖、葉等生態(tài)位點良好定殖，定殖量維持在10萬～100萬CFU/g;黃瓜苗經(jīng)菌株發(fā)酵液處理后，與抗病相關(guān)的過氧化物酶和過氧化氫酶活性均升高，CAT對應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄量也增加，從生理水平和轉(zhuǎn)錄水平說明該菌株發(fā)酵液對黃瓜有誘導(dǎo)抗病性的作用。說明該株海洋芽孢桿菌對黃瓜灰霉病有較好的防治效果，且防治機制包括抑菌、定殖和誘導(dǎo)抗病性。

關(guān)鍵詞：黃瓜灰霉病;海洋芽孢桿菌;防治效果;生防機制

中圖分類號： S436.421.1+9? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）02-0091-06

收稿日期：2021-09-07

作者簡介：方 佩（1987—），女，湖北洪湖人，碩士，主要從事生物防治研究。E-mail：fpwonderful116@126.com。

通信作者：羅遠(yuǎn)嬋，博士，講師，主要從事微生物防治研究，E-mail：luoyuanc@ecust.edu.cn; 李元廣，博士，教授，主要從事微生物農(nóng)藥、微藻培養(yǎng)研究，E-mail：ygli@ecust.edu.cn。

近年來，隨著大棚蔬菜面積擴大，重茬黃瓜棚增多，黃瓜灰霉病（Botrytis cinerea）發(fā)病日趨嚴(yán)重，已成為設(shè)施栽培黃瓜上的一種重要病害。在濕度大、通風(fēng)條件差的情況下，一旦發(fā)病，不能及時防治，就會造成很大損失，一般減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時全棚萎蔫、絕產(chǎn)[1-2]?；瘜W(xué)防治是目前黃瓜灰霉病的主要防治措施，然而高強度、高頻次地使用化學(xué)農(nóng)藥致使灰霉病菌對常用的殺菌劑已產(chǎn)生了抗藥性，而且對環(huán)境也造成了一定的農(nóng)藥污染[3-4]。隨著人們環(huán)保意識的增強和對食品安全的注重，對無公害蔬菜的需求日益增多，生物農(nóng)藥由于其低污染、低殘留的特性已成為灰霉病防治研究的熱點[4]。

海洋微生物因其生境特殊，常產(chǎn)生有異于陸地微生物的代謝產(chǎn)物而成為近年來海洋微生物資源開發(fā)的熱點[5]。利用海洋微生物進(jìn)行藥劑開發(fā)的研究主要集中在醫(yī)藥方面，而在防治灰霉病農(nóng)藥開發(fā)方面的研究并不多，但也有學(xué)者開始相關(guān)研究。如Edwards等研究發(fā)現(xiàn)，短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）可在液體、固體培養(yǎng)基及白菜離體葉片上抑制灰霉病菌的萌發(fā)和生長[6];Wang等從中國東南海域分離的酵母（Rhodosporidium paludigenum），離體及活體都能較好地抑制灰霉病菌的生長[7];聶亞鋒等從海水中分離的細(xì)菌PT-sw-1，其胞外粗提物對番茄灰霉病菌等幾種病原菌有較好的抑菌活性[8];崔榮強等對來自潮間帶紅樹植物的芽孢桿菌T28菌株進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)T28菌株對番茄灰霉病防治效果顯著，且對番茄生長有多種促進(jìn)作用[9];魏新燕等從渤海海水和底泥樣品中分離出1株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21，它對灰霉菌菌絲生長有較好的抑制效果[10];邱森森等對從東海海底土壤沉積物中分離獲得的芽孢桿菌菌株ZDC-01的室內(nèi)防效進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該菌株菌懸液對茄子灰霉病菌有一定的防治效果，與對照藥劑腐霉利防治效果相當(dāng)[11];楊可等研究發(fā)現(xiàn)，海洋生境貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）TCS001對黃瓜灰霉病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)有顯著的抑制作用，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)TCS001發(fā)酵濾液可導(dǎo)致黃瓜灰霉病菌孢子萌發(fā)芽管中間或頂端膨大畸形[12]。Ma等研究發(fā)現(xiàn)，來自海洋沉積物的解淀粉芽孢桿菌SH-B74能產(chǎn)生制磷脂菌素（Pastastatin A1），該物質(zhì)能有效降低番茄灰霉病的發(fā)病率[13]。目前，還未見有來自海洋的芽孢桿菌對防治黃瓜灰霉病詳細(xì)田間實際應(yīng)用效果的報道。

田黎研究員課題組與筆者所在實驗室合作，從渤海潮間帶鹽地堿蓬中分離到1株海洋芽孢桿菌。為明確該菌株防治黃瓜灰霉病的效果并了解其防治黃瓜灰霉病的機制，本試驗以黃瓜灰霉病菌為靶標(biāo)，對該株海洋芽孢桿菌的室內(nèi)生測、盆栽藥效、田間藥效試驗及生防機制進(jìn)行了全面探究。

1 材料和方法

1.1 材料

生防菌：海洋芽孢桿菌（Bacillus marinus），分離自渤海潮間帶鹽地堿蓬，由筆者所在實驗室保藏。

病原指示菌：黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea），分離自上海南匯地區(qū)的黃瓜上，由筆者所在實驗室保藏。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[14]、海洋芽孢桿菌培養(yǎng)基[15]。

藥劑：400 g/L嘧霉胺懸浮劑[拜耳作物科學(xué)（中國）有限公司，農(nóng)藥登記證號：PD20060014]。

1.2 海洋芽孢桿菌對灰霉病菌的室內(nèi)生測

以400 g/L嘧霉胺懸浮劑為對照藥劑，用平板擴散法來測定海洋芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)[15]上清液對黃瓜灰霉病菌的抑菌活性。每個處理設(shè)3個重復(fù)，滅菌蒸餾水為空白對照。將各處理平皿置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用十字交叉法測量皿底抑菌圈的大小，計算平均抑菌圈直徑。采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析，以下同。

1.3 海洋芽孢桿菌對灰霉病的盆栽防治效果測定

盆栽試驗方法參考上海南方農(nóng)藥研究中心“創(chuàng)制農(nóng)藥生物活性評價SOP規(guī)范”進(jìn)行。取1葉1心期長勢一致盆栽黃瓜苗（寶雜2號），分別用海洋芽孢桿菌 5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)30 h的發(fā)酵液、嘧霉胺800倍稀釋液、嘧霉胺1 200倍稀釋液、清水噴霧處理后，放在人工氣候箱中（相對濕度100%，溫度 20 ℃，光照6 000 lx 12 h），2 d后于黃瓜苗葉片中央接種病原菌菌餅（直徑5 mm）。各處理設(shè)3個重復(fù)，每天觀察黃瓜苗生長狀況，2～5 d后空白對照充分發(fā)病時，以灰霉病菌菌塊為中心，測定每片黃瓜葉片病斑直徑（cm），并按公式（1）和公式（2）計算防效。

平均病斑直徑=∑病斑直徑葉片數(shù);（1）

防治效果=對照平均病斑直徑-處理平均病斑直徑對照平均病斑直徑×100%。（2）

1.4 海洋芽孢桿菌制劑對灰霉病的田間藥效

2020年在江西省南昌市郊進(jìn)行黃瓜灰霉病田間試驗，于第1次施藥前進(jìn)行病指基數(shù)調(diào)查并開始用藥，共噴施3次，每次間隔7 d。處理為海洋芽孢桿菌可濕性粉劑300倍液、600倍液和1 200倍液、嘧霉胺1 000倍液以及空白對照，各處理占地 25～50 m2。定期檢查病情指數(shù)，并按公式（3）和公式（4）計算病指防效。

依據(jù)GB/T 17980.28—2000《農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則（一） 殺菌劑防治蔬菜灰霉病》，灰霉病分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，無病斑;1級，單葉片有病斑3個;3級，單葉片有病斑4～6個;5級，單葉片有病斑7～10個;7級，單葉有病斑11～20個，部分密集成片;9級，單葉片有病斑密集占葉面積1/4以上。

病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×相對級數(shù)值）調(diào)查總株數(shù)×最高級數(shù)值×100%。（3）

相對病指防效=1-CK0病情指數(shù)×pt1病情指數(shù)CK1病情指數(shù)×pt0病情指數(shù)×100%。（4）

式中：CK0、CK1 分別為清水對照區(qū)施藥前病株率（病指）、施藥后病株率（病指）;pt0、pt1 分別為藥劑處理區(qū)施藥前病株率（病指）、施藥后病株率（病指）。

1.5 海洋芽孢桿菌對灰霉病菌生長抑制作用的測定

1.5.1 對菌絲抑制作用的測定

取室內(nèi)生測“1.2”節(jié)中靠近平皿中央孔口（注入海洋芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)上清液或無菌水）的病原真菌菌絲，于顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)，并拍照記錄。

1.5.2 對孢子萌發(fā)抑制作用的測定

將病原真菌以無菌生理鹽水制備成孢子懸浮液（濃度約為 10萬孢子/mL）。取海洋芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)上清液，與病原菌孢子懸浮液等體積混合，加入凹玻片凹穴中，20 ℃暗培養(yǎng)，定期檢查孢子萌發(fā)狀況，計算孢子萌發(fā)率。用無菌生理鹽水為對照。以芽管長度超過孢子小端直徑一半時記錄為萌發(fā)，每處理3個重復(fù)，計算孢子萌發(fā)率及孢子萌發(fā)抑制率。

孢子萌發(fā)率=萌發(fā)孢子數(shù)孢子總數(shù)×100%;（5）

孢子萌發(fā)抑制率=對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率對照孢子萌發(fā)率×100%。（6）

1.6 海洋芽孢桿菌的定殖

用薄膜將黃瓜苗莖基部以下部分包裹住，噴霧海洋芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)液后去除薄膜，于人工氣候箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件同“1.3”節(jié)），3、6、9、12、15 d對黃瓜苗的葉、莖、根進(jìn)行分離，并用稀釋法計算接種后不同時間、不同器官內(nèi)海洋芽孢桿菌的含菌量。每處理設(shè)50株苗，每次取10株苗的不同器官檢測活菌含量。

1.7 海洋芽孢桿菌發(fā)酵液對黃瓜抗病相關(guān)防御酶活性的影響

共設(shè)2個處理。處理1：海洋芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)液，噴霧;處理2：CK，清水噴霧。每處理設(shè)15株苗。每次取3株苗檢測酶活性。分別于用藥后1、2、3、4、5 d取黃瓜葉片測定POD、CAT的活性，酶活測定方法參照《植物生理學(xué)研究技術(shù)》[16]。

1.8 熒光定量PCR檢測海洋芽孢桿菌對黃瓜cat基因表達(dá)的影響

共設(shè)2個處理。處理1：海洋芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)液，噴霧;處理2：清水對照，CK。各處理15盆苗，分別于藥劑處理后的0、1、2、3、4 d在各處理中隨機抽取3盆、摘取3張真葉，稱質(zhì)量后于液氮中研磨成粉末狀，用“植物總RNA提取試劑盒”（TIANGEN公司）提取黃瓜葉片中的總RNA，用“反轉(zhuǎn)錄試劑盒”（TIANGEN公司）合成cDNA第一鏈，然后以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，每個點做3次重復(fù)。

熒光定量PCR所用試劑盒為TOYOBO公司，所用儀器為ABI StepOne plus（ABI公司），反應(yīng)體系（20 μL）：模板 2 μL，引物F 0.8 μL，引物R 0.8 μL，2.5×RealMasterMix/20×SYBR solution 10 μL，補充超純水至20 μL。程序：95 ℃預(yù)變性 30 s;95 ℃ 變性5 s，50～61 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)。依據(jù)引物設(shè)計原則及cat和番茄的18S rRNA基因序列、選取序列中的一段保守序列進(jìn)行相應(yīng)的引物設(shè)計（表1）。數(shù)據(jù)處理方法用相對定量法中的2-ΔΔCT法[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋芽孢桿菌對灰霉病菌的室內(nèi)抑菌作用

從表2可以看出，海洋芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)上清液原液至稀釋20倍液對灰霉病菌都有明顯的抑菌圈。其上清液原液至稀釋20倍液對灰霉病菌的抑菌圈直徑分別為68.70、57.27、48.30、38.87 mm;嘧霉胺800倍、1 600倍稀釋液對灰霉病菌的抑菌圈直徑分別為33.47、28.20 mm。海洋芽孢桿菌上清液原液至稀釋20倍液與嘧霉胺800倍液和1 600倍液的抑菌圈直徑在0.05和0.01水平上均差異顯著。由上述結(jié)果可見，海洋芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)上清液原液至稀釋20倍液對灰霉病菌的抑制作用明顯優(yōu)于嘧霉胺800倍液和1600倍液。

2.2 海洋芽孢桿菌對黃瓜灰霉病的盆栽防效測定

室內(nèi)生測結(jié)果（表3）顯示，海洋芽孢桿菌對灰霉病菌有較強的抑菌作用，且優(yōu)于常用化學(xué)藥劑嘧霉胺;盆栽試驗也顯示了相同的結(jié)果：在接種病原菌5 d后，海洋芽孢桿菌發(fā)酵液對黃瓜灰霉病的防效為83.23%，顯著優(yōu)于對照藥劑嘧霉胺田間推薦使用濃度（P<0.05）。

2.3 海洋芽孢桿菌可濕性粉劑對黃瓜灰霉病的田間藥效

由表4可知，在第3次藥后7 d，海洋芽孢桿菌可濕性粉劑的防效隨著用藥濃度的升高而升高，且300倍稀釋液對黃瓜灰霉病的相對病指防效為77.31%，與對照藥劑400 g/L嘧霉胺1 000倍稀釋液防效相當(dāng)。

2.4 海洋芽孢桿菌對灰霉病菌抑制作用機制

2.4.1 對菌絲抑制作用的測定

由圖1可知，與空白對照相比，海洋芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)上清液可使灰霉病菌的菌絲畸形生長，使其原生質(zhì)濃縮，導(dǎo)致菌絲死亡。

2.4.2 對孢子萌發(fā)抑制作用的測定

由表5可知，海洋芽孢桿菌上清液48 h內(nèi)對灰霉孢子的萌發(fā)有明顯的抑制作用。處理4～48 h，海洋芽孢桿菌上清液對灰霉孢子的抑制率為46.76%～90.62%，隨著時間的延長抑制作用開始減弱。鏡檢海洋芽孢桿菌上清液處理48 h萌發(fā)孢子的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)芽管比對照短且粗大?？梢钥闯?，生防菌株海洋芽孢桿菌上清液對灰霉孢子的作用還表現(xiàn)為推遲孢子的萌發(fā)時間，并導(dǎo)致萌發(fā)孢子不能正常生長。

2.4.3 海洋芽孢桿菌在黃瓜苗上的定殖情況

由表6可知，海洋芽孢桿菌發(fā)酵液噴霧接種到黃瓜苗上3～15 d時，在葉、莖、根上均能良好定殖。葉部可能由于保水能力不強，其含菌量從接種3 d的 143萬CFU/g 下降到6 d時的22.5萬CFU/g，此后在9 d有所上升，到15 d時含量達(dá)到82.8萬CFU/g。

莖部和根部保水能力較好，其含菌量從接種3 d后持續(xù)上升，到9 d時達(dá)到最大值（100萬CFU/g），此后開始雖有所下降，但15 d時莖和根內(nèi)仍含有 45萬CFU/g 左右的活菌。由此可見，海洋芽孢桿菌在黃瓜苗各器官內(nèi)可以良好定殖。

2.4.4 海洋芽孢桿菌發(fā)酵液對黃瓜抗病相關(guān)防御酶活性的影響

過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）屬于植物活性氧清除酶系，對于超氧陰離子自由基和過氧化氫的清除，保護膜結(jié)構(gòu)發(fā)揮了重要作用。這2種酶均為植物抗病性的重要指標(biāo)。由表7可見，黃瓜葉片經(jīng)海洋芽孢桿菌培養(yǎng)液處理后，葉片內(nèi)的CAT和POD這2種酶的活性與對照相比均明顯升高。其中，CAT在3 d時活性達(dá)到最高，POD在2 d時達(dá)到最高，在4 d時又出現(xiàn)第2個酶活性高峰。酶活性的增加在一定程度上反映了植物抗病性的增加，說明海洋芽孢桿菌發(fā)酵液對黃瓜有誘導(dǎo)抗病的作用。

2.5 海洋芽孢桿菌發(fā)酵液對黃瓜防御酶cat基因表達(dá)量的影響

運用實時熒光定量PCR技術(shù)，以18S rRNA為內(nèi)參基因，分析黃瓜苗經(jīng)發(fā)酵液處理后cat基因的差異表達(dá)。由表8可知，經(jīng)海洋芽孢桿菌培養(yǎng)液處理后，黃瓜葉片中的cat基因mRNA轉(zhuǎn)錄量增加。與對照相比，cat基因在處理后3 d時轉(zhuǎn)錄量達(dá)到最大，CAT活性也在3 d時達(dá)到最大。cat基因轉(zhuǎn)錄量和CAT活性的增加分別從分子水平和生理水平上說明了海洋芽孢桿菌發(fā)酵液能誘導(dǎo)黃瓜植株產(chǎn)生抗病性。

3 討論

利用生物防治法防治灰霉病已有諸多文獻(xiàn)報道，且被認(rèn)為是代替化學(xué)藥劑的有效方法之一[7]。海洋的特殊生境（高鹽、低溫、高壓、寡營養(yǎng)和流動等特點）使生活于其中的海洋生物極易產(chǎn)生與陸地生物不同的代謝產(chǎn)物，對病害防治可能有與陸地微生物不同的效果;此外，對于資源日漸匱乏的陸地，可持續(xù)開發(fā)海洋資源已成為當(dāng)今研究的熱點[5]。

田黎研究員課題組與筆者所在課題組合作，從渤海潮間帶鹽地堿蓬根際分離到1株海洋芽孢桿菌。室內(nèi)生測及盆栽藥效試驗顯示，海洋芽孢桿菌對黃瓜灰霉病菌的抑菌效果優(yōu)于常用化學(xué)藥劑 400 g/L嘧霉胺懸浮劑（推薦稀釋倍數(shù)800～1 200倍）;海洋芽孢桿菌制劑在田間藥效能達(dá)到77.31%，與400 g/L嘧霉胺懸浮劑（稀釋1 000倍）的藥效相當(dāng)，且對環(huán)境友好，對作物及其他生物無藥害。此外，筆者所在課題組劉榮峰等從其發(fā)酵液中分離到3個新結(jié)構(gòu)的環(huán)脂肽化合物，這些化合物對灰霉病菌也有較強的抑菌活性[18-20];最低抑菌濃度（MIC）為50 μg/mL，進(jìn)一步盆栽試驗結(jié)果表明，環(huán)脂肽物質(zhì)（125 μg/mL）對黃瓜灰霉病的盆栽防效高達(dá)95.6%，而嘧霉胺（500 μg/mL，推薦使用濃度）的防效僅為51.1%[20]?？梢姰a(chǎn)生環(huán)脂肽物質(zhì)是海洋芽孢桿菌抑制灰霉病的重要機制之一。

本研究結(jié)果表明，海洋芽孢桿菌菌株代謝產(chǎn)物對黃瓜灰霉病菌菌絲生長有強烈的抑制作用，同時該菌株代謝產(chǎn)物能殺死分生孢子，降低孢子萌發(fā)率。海洋芽孢桿菌能在黃瓜根、莖、葉生態(tài)位點有良好的定殖能力，并對黃瓜苗有誘導(dǎo)抗病性的作用。因此，可以推斷海洋芽孢桿菌對黃瓜病害的防治機制包括拮抗、位點競爭和誘導(dǎo)抗病性。本研究用熒光定量PCR法研究了海洋芽孢桿菌誘導(dǎo)植物抗病相關(guān)基因表達(dá)量的變化，從轉(zhuǎn)錄水平說明了其對黃瓜有誘導(dǎo)抗病性作用。

生防微生物應(yīng)用后防治效果能否穩(wěn)定持久，受多種因素的影響。尤其是灰霉病菌，它是一種極易變異的植物病原菌，使其生物防治變得更復(fù)雜。只有詳細(xì)了解了生防菌對不同來源的抗性和敏感性灰霉病菌菌株的抑制效果，生防菌使用后在植物內(nèi)生防菌與灰霉病菌的消長情況，生防菌產(chǎn)生的抑制灰霉病菌的主要抑菌活性物質(zhì)及其在生防菌代謝產(chǎn)物內(nèi)的含量，以及不同環(huán)境因素對生防菌的存活和防效的影響后，才能更好地發(fā)揮生防菌對灰霉病的防病功能。目前，正在開展海洋芽孢桿菌在不同類型田間土壤的定殖能力、適生性、穩(wěn)定性及其在不同地區(qū)防治灰霉病效果的研究，以期充分探究其防治不同來源灰霉病的機制和效果。

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