1株產(chǎn)果膠酶中度嗜鹽菌(Aspergillus aculeatus GLUT-01)的鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

池彬彬 倪瑩 陳慧英 劉紅艷

摘要：從海拔2 500～3 000 m處的鹽井土壤樣品中分離得到1株中度嗜鹽菌，通過(guò)對(duì)該菌株的菌落形態(tài)觀察、rDNA-ITS測(cè)序及同源序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，鑒定該菌株為曲霉屬（Aspergillus），命名為棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus） GLUT-01。該菌株能在3%～15% NaCl （最適7%）、20～30 ℃ （最適27 ℃）、pH值為4.0～10.0 （最適pH值為7.0）條件下生長(zhǎng)，且能以部分污染物作為唯一碳源生長(zhǎng)，這顯示了一定的應(yīng)用潛力。以其作為發(fā)酵真菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)正交試驗(yàn)分析，在接種量為2%， 溫度為28 ℃，起始pH值為6，C/N為1 ∶2條件下培養(yǎng)3～5 d，產(chǎn)生的果膠酶活性達(dá)到126.68 U/mL。試驗(yàn)結(jié)果豐富了嗜鹽果膠酶的研究和開(kāi)發(fā)依據(jù)，為高鹽環(huán)境下食品工業(yè)加工提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：中度嗜鹽菌;曲霉屬;系統(tǒng)發(fā)育樹(shù);果膠酶;正交試驗(yàn);產(chǎn)酶條件優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)：S182 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）02-0239-08

收稿日期：2021-04-12

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：21762015、31860251）;桂林理工大學(xué)科研啟動(dòng)基金（編號(hào)：GLUT2015038）;廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：2020GXNSFAA238037）。

作者簡(jiǎn)介：池彬彬（1997—），男，浙江溫州人，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。E-mail：837282401@qq.com。

通信作者：陳慧英，博士，副教授，主要從事微生物代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā)，E-mail： hychen@glut.edu.cn;劉紅艷，博士，副教授，主要從事功能微生物開(kāi)發(fā)及應(yīng)用，E-mail： lhyglite@126.com。

自然界中存在各種各樣的鹽域環(huán)境如鹽湖、鹽井、鹽礦，也有人工合成的鹽土環(huán)境如鹽場(chǎng)、鹽池等，而嗜鹽菌（halophiles）則是在這樣的高鹽環(huán)境下能夠生長(zhǎng)的一類(lèi)微生物，另外鹽制發(fā)酵食品中也能夠分離篩選出嗜鹽菌[1-2]。與其他極端微生物相比，中度嗜鹽菌可以在較高濃度（3%～15%）的鹽溶液下生存[3]，并且能利用不同種類(lèi)的有機(jī)物作為碳源和氮源。因其獨(dú)特的生理生化特性，確定了其在生產(chǎn)酶制劑、食品行業(yè)、污水凈化等方面具有非常廣闊的應(yīng)用價(jià)值[4-5]。

果膠酶（pectinase）是世界四大酶制劑之一，是分解果膠質(zhì)酶類(lèi)的總稱(chēng)，主要包括原果膠酶、果膠酯酶、聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶四大類(lèi)[6]。主要來(lái)源于動(dòng)植物及微生物，尤其是微生物，因其生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單、代謝過(guò)程特殊等特征，成為果膠酶的重要來(lái)源[7]。目前，曲霉屬的菌株已被廣泛用于聚半乳糖醛酸酶的工業(yè)生產(chǎn)[8]。國(guó)內(nèi)果膠酶需求量很大[9]，但我國(guó)果膠酶發(fā)展速度緩慢，并且果膠酶大多都是單獨(dú)使用，這在很大程度上限制了果膠酶的應(yīng)用范圍。因此，為了提高果膠酶制劑的質(zhì)量，降低成本，選擇適合工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)果膠酶生產(chǎn)菌是關(guān)鍵[10-11]。

目前，多數(shù)果膠酶在高濃度鹽溶液下存在酶活性較低的缺陷，限制了其更廣泛的開(kāi)發(fā)利用[12-13]。因此，本試驗(yàn)研究了1株中度嗜鹽真菌（GLUT-01）的形態(tài)特征、生理生化特性、分子生物學(xué)系統(tǒng)分類(lèi)、培養(yǎng)條件，同時(shí)還著重對(duì)該菌株的發(fā)酵產(chǎn)果膠酶條件進(jìn)行探索，以期能豐富耐鹽果膠酶的基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)時(shí)間為 2018年10月至 2019年 6月，地點(diǎn)為桂林理工大學(xué)（110°18′21″E， 25°04′10″N）。

1.2 材料與儀器

1.2.1 材料 菌株GLUT-01由桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院生物工程教研室分離篩選并保存。

1.2.2 主要試劑和儀器 乳糖購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠; D-果糖、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺艷（ABTS）、聚半乳糖醛酸均購(gòu)自源葉生物科技有限公司; DZF-6050型真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn); VIS-7220N可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司生產(chǎn); iMark酶標(biāo)儀，Bio-Rad Laboratoties Inc生產(chǎn); SZGMA3-30K高速冷凍離心機(jī)，SZGMA德國(guó)生產(chǎn)。

1.2.3 培養(yǎng)基

菌種保藏培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA固體培養(yǎng)基）。

種子液/發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉3.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，NaCl 28.0 g/L，pH值為6.8～7.0。

改良培養(yǎng)基：磷酸氫二銨10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L，KCl 20.0 g/L，MgSO4·7H2O 40.0 g/L，pH值為6.8～7.0。

營(yíng)養(yǎng)明膠培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，明膠120.0 g/L，pH值為6.8～7.0。

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源（D-果糖、葡萄糖、菊糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖）15.00 g/L，硫酸銨5.00 g/L，K2HPO4 1.00 g/L，MgSO4·7H2O 0.50 g/L，KCl 5.00 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，pH值為6.8～7.0。

1.3 酶活力測(cè)定及蛋白質(zhì)含量測(cè)定

1.3.1 粗酶液的制備 將保存于PDA斜面上的菌株活化后，接入種子培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)48 h，作為種子液使用。以2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)72 h[14]。發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min條件下冷凍離心10 min后取上清液作為粗酶液，4 ℃低溫保存。

1.3.2 果膠酶活力測(cè)定 取編號(hào)為1、2的離心管2支，各加入800 μL聚半乳糖醛酸（濃度為1%），在40 ℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，在試管1中加入 200 μL 適當(dāng)稀釋樣品酶液，在試管2中加經(jīng)煮沸 5 min 滅活的適當(dāng)稀釋樣品酶液200 μL，2支試管同時(shí)放入40 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min后，立即加入 500 μL DNS試劑停止反應(yīng)，用開(kāi)水煮沸顯色 5 min，立即冷卻，取反應(yīng)液體200 μL于540 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度[15]。

1.3.3 酶活單位定義 在40 ℃條件下，1 min降解聚半乳糖醛酸產(chǎn)生1 μmol半乳糖醛酸所需酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

1.4 形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

1.4.1 菌種形態(tài)觀察 將分離得到的純菌株進(jìn)行劃平板培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)7 d，觀察并記錄單菌落的顏色、形狀、透明度、大小、表面隆起和菌落培養(yǎng)基的顏色等[16]。在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)大小[17]。

1.4.2 液體培養(yǎng)形態(tài)觀察 將分離得到的純菌株接種在液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌液顏色、菌絲體形狀、菌絲體大小、透明度等。

1.5 生理生化特性試驗(yàn)

1.5.1 明膠液化 接種營(yíng)養(yǎng)明膠培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)，分別于1、2、3 d觀察，空管對(duì)照。觀察前先把試管放置在冰箱中20～30 min。觀察試管內(nèi)菌液是否為液態(tài)判斷其明膠液化能力。

1.5.2 甲基紅試驗(yàn) 接種發(fā)酵液培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)3 d，檢測(cè)時(shí)，加入2～3 滴甲基紅試劑到培養(yǎng)液中，混勻觀察，若呈紅色，即為陽(yáng)性反應(yīng)，若無(wú)顏色變化，則為陰性反應(yīng)[18]。

1.5.3 吲哚試驗(yàn) 1%胰蛋白胨水溶液，0.5% NaCl，調(diào)節(jié)pH值為7.5，分裝小管。接種培養(yǎng)3 d后檢測(cè)。試管里加入2～3滴乙醚，再緩慢加入1～2滴吲哚試劑。乙醚層出現(xiàn)玫紅色，代表陽(yáng)性，乙醚層為黃色，代表陰性[19]。

1.5.4 藥敏性試驗(yàn) 將硫酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素、鹽酸林可霉素、鹽酸土霉素、克拉霉素、硝酸益康唑、灰黃霉素分別配制成5 mg/mL抗生素溶液。抗生素溶液經(jīng)紫外殺菌后，移取200 μL加入已滅菌的50 mL PDA培養(yǎng)基中，倒平板并涂布種子液，30 ℃靜置培養(yǎng)2 d，觀察并記錄結(jié)果。

1.5.5 有機(jī)污染物降解初步試驗(yàn) 在改良培養(yǎng)基其他成分不變的情況下，不添加任何碳氮源，以芳香類(lèi)化合物作為唯一的碳源以及能量，配制培養(yǎng)基[20]。芳香類(lèi)化合物為雙酚A、雙酚AF、四溴雙酚A、六溴十二烷、苯甲基磺酰氟、鄰聯(lián)甲苯胺。以2%接種量接入50 mL培養(yǎng)基，置于30 ℃，150 r/min 振蕩培養(yǎng)3 d，觀察并記錄菌株生長(zhǎng)情況。以不接種的培養(yǎng)基為陰性對(duì)照試驗(yàn)。

1.6 rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增及測(cè)序分析

采用ITS序列設(shè)計(jì)保守?cái)U(kuò)增引物（ITS1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; ITS4： 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)菌株總 DNA 模板進(jìn)行ITS1-5.8S-ITS4 rDNA 擴(kuò)增， 擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min;94 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。取4.5 μL PCR 產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物，紫外燈箱觀察擴(kuò)增效果。

序列測(cè)定和分析：將rDNA-ITS 擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海生工公司測(cè)序，所測(cè)序列在NBCI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastn同源性比對(duì)分析，利用BLAST軟件搜索相似序列后，利用MEGA 5.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining）以相近序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[21]。

1.7 培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

采取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)條件[22]。在 50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中接入1 mL種子液，分別加以菊糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、D-果糖、乳糖為碳源，以硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、檸檬酸氫二銨、酵母浸出粉為氮源，鹽度設(shè)為3%、5%、7%、9%、11%、15%，起始pH值梯度設(shè)為4、6、7、8、9、10、11，溫度設(shè)為4、20、27、30、37、40 ℃。均于150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，進(jìn)行烘干，記錄菌體質(zhì)量，比較菌株在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況。進(jìn)行2個(gè)平行試驗(yàn)，取均值（下同）。

1.8 培養(yǎng)條件對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

研究不同碳源、氮源、C/N、溫度、誘導(dǎo)劑、金屬離子、起始 pH值、接種量對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.8.1 碳源、氮源 以2%的接種量接種50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基（下同），分別設(shè)置菊糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、D-果糖、乳糖為碳源，以硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、檸檬酸氫二銨、酵母浸出粉為氮源。測(cè)定酶活，確定最佳碳源、氮源。

1.8.2 碳源、氮源添加量 在確定最佳碳源、氮源的條件下，分別設(shè)置碳源、氮源的添加量梯度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g，測(cè)定酶活，確定最佳碳源和氮源的添加量。

1.8.3 C/N 篩選出最合適的碳源、氮源后，固定碳源質(zhì)量為0.5 g，改變氮源的質(zhì)量，使得C/N分別為1 ∶10、1 ∶5、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、5 ∶1、10 ∶1，測(cè)定酶活，確定最佳C/N。

1.8.4 溫度 用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，于20、28、30、32、35 ℃條件下培養(yǎng)，測(cè)定酶活，確定最佳發(fā)酵溫度[23]。

1.8.5 誘導(dǎo)劑 在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑，選擇麩皮（1%）、羧甲基纖維素（1%）、木質(zhì)素（1%）、苯酚（1 mmol/L）、ABTS （1 mmol/L）作為誘導(dǎo)劑，測(cè)定酶活，確定最佳誘導(dǎo)劑。

1.8.6 金屬離子 通過(guò)向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.25 g氯化鉻、氯化鈉、氯化鉀、氯化鋇、氯化鈣、硫酸鎂，測(cè)定酶活，確定最適添加的金屬離子。選取最適金屬離子，設(shè)置添加量為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 g，確定最佳金屬離子的添加量。

1.8.7 初始pH值 在以上因素為最佳條件下，調(diào)節(jié)不同pH值為 3、4、5、6、7、8進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定酶活，確定最佳初始pH值。

1.8.8 接種量 在最佳條件下，分別以1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，測(cè)定酶活，確定最佳接種量。

1.9 正交試驗(yàn)分析

各培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酶的影響確定后，考慮不同因素之間的相互作用及影響程度，對(duì)單因素確定的C/N、溫度、起始pH值、接種量進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[L9（34）]，以確定最佳培養(yǎng)條件下的菌種發(fā)酵酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

2.1.1 固體培養(yǎng)菌落形態(tài)

在PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后的觀察結(jié)果見(jiàn)圖1，菌落直徑約為8 mm，菌種生長(zhǎng)速度較快，培養(yǎng)的第1天菌落即產(chǎn)生白色纖維狀的初生菌絲，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，菌絲正面轉(zhuǎn)變?yōu)楹诤稚?，反面為淡黃色。該菌種菌落生長(zhǎng)特點(diǎn)與李芬芳等報(bào)道的[24]基本相同。菌絲由中心向周?chē)鷶U(kuò)散生長(zhǎng)，菌落邊緣為全緣，表面粗糙，呈粉粒狀。

菌株在顯微鏡下的觀察結(jié)果（圖2）顯示，孢子由單細(xì)胞構(gòu)成，呈球狀，直徑為1～2 μm，鏈狀或堆積排列，表面光滑。

2.1.2 液體培養(yǎng)菌落形態(tài)

在PDA液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后（圖3），菌落為白色不透明的球狀，菌體直徑約為10 mm，培養(yǎng)基顏色變?yōu)橥该鳌?/p>

2.2 分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

菌株GLUT-01 的ITS1-5.8S-ITS4基因擴(kuò)增條帶測(cè)序結(jié)果如下：序列總長(zhǎng)為557 bp，序列為GACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCTGGGTCCTTCGGGGCCCAACCTCCCACCCGTGCTTACCGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTCGGGCGGCCCGGGGCCTGCCCCCGGGACCGCGCCCGCCGGAGACCCCAATGGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTCGATTGATACCAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTCCCCTCCAGCCCCGCTGGTTGTTGGGCCGCGCCCCCCCGGGGGCGGGCCTCGAGAGAAACGGCGGCACCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACCCGCTCTATGGGCCCGGCCGGGGCTTGCCTCGACCCCCAATCTTCTCAGATTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA。

將rDNA-ITS序列在NBCI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastn比對(duì)分析，利用ClustalX和MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）。不同的種聚為不同的分支，菌種GLUT-01與菌種Aspergillus niger CBS 172.66 NR_111412.1聚為一支，自展值為100，表明兩者親緣關(guān)系非常近。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，可以鑒定菌株GLUT-01為棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）。

2.3 生理生化特性

菌株GLUT-1的生理生化特征結(jié)果見(jiàn)表1。該菌株在pH值為4.0～9.0時(shí)皆可生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)pH值為7.0;20～30 ℃時(shí)生長(zhǎng)旺盛，最適生長(zhǎng)溫度為27 ℃;鹽度為3%～9%時(shí)皆可生長(zhǎng)， 最適生長(zhǎng)鹽度為7%，甲基紅試驗(yàn)反應(yīng)為陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)反應(yīng)為陰性。乳糖、葡萄糖、麥芽糖、D-果糖、菊糖皆可作為碳源，可水解明膠，硫酸銨、檸檬酸氫二銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出粉可作為氮源。

對(duì)硫酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、鹽酸土霉素、鹽酸林可霉素、克拉霉素、氯霉素等抗生素敏感;對(duì)硝酸益康唑、灰黃霉素2類(lèi)抗生素不敏感。能夠在以雙酚A、雙酚AF、四溴雙酚A、六溴十二烷、苯甲基磺酰氟、鄰聯(lián)甲苯胺為唯一碳源和能量的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。Ekanayake等也曾報(bào)道，棘孢曲霉可有效分解染料[25]。

2.4 培養(yǎng)條件對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的影響

2.4.1 碳源 從圖5可以看出，經(jīng)不同碳源培養(yǎng)，菊糖和D-果糖對(duì)液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的影響最小，而葡萄糖可以明顯提高果膠酶的活性，乳糖次之，因此選擇葡萄糖為最適碳源。

從圖6可以看出，最佳的葡萄糖添加量為 0.5 g，此時(shí)酶活性可達(dá)到126.10 U/mL。隨著葡萄糖添加量的增加，果膠酶活性出現(xiàn)峰值之后，呈先下降再升高趨勢(shì)，但過(guò)高的葡萄糖濃度將抑制菌株生長(zhǎng)，且依據(jù)趨勢(shì)增長(zhǎng)最高峰依舊難以達(dá)到前峰峰值。宜選擇添加量少且效果顯著的試驗(yàn)組，因此選擇 0.5 g 作為葡萄糖最佳添加量。

2.4.2 氮源 從圖7可以看出，在最佳碳源條件下，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加蛋白胨、酵母浸出粉和牛肉膏，對(duì)果膠酶活性提升不大;而硫酸銨能夠相對(duì)提高果膠酶活力，因此選擇硫酸銨作為最適氮源[26]。

從圖8可以看出，最佳硫酸銨添加量為 0.5 g，此時(shí)果膠酶活性為122.30 U/mL。隨著硫酸銨添加量的增加，果膠酶活性出現(xiàn)峰值之后呈下降趨勢(shì)?？赡芘c硫酸銨的酸化作用有關(guān)，少量硫酸銨分解產(chǎn)生的微酸環(huán)境提高了酶活性，而過(guò)量硫酸銨導(dǎo)致過(guò)酸抑制了酶活和菌的生長(zhǎng)。

2.4.3 C/N 以葡萄糖作為碳源、硫酸銨作為氮源，確定葡萄糖為0.5 g，改變硫酸銨的質(zhì)量，使得C/N分別為1 ∶10、1 ∶5、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、5 ∶1、10 ∶1，考察不同C/N對(duì)嗜鹽菌產(chǎn)果膠酶的影響，結(jié)果（圖9）顯示，1 ∶2為最佳C/N。

2.4.4 溫度 從圖10可以看出，30 ℃為最適產(chǎn)酶溫度，此時(shí)果膠酶活性達(dá)到125.88 U/mL。培養(yǎng)的溫度過(guò)高或者過(guò)低均不利于果膠酶的產(chǎn)生。當(dāng)溫度較低時(shí)，菌體代謝緩慢，所產(chǎn)的酶量也較少;當(dāng)溫度較高時(shí)，菌體自身代謝所需酶的活性降低，導(dǎo)致發(fā)酵減緩，從而影響產(chǎn)酶。

2.4.5 誘導(dǎo)劑 表面活性劑可以改變細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)的酶更容易通過(guò)細(xì)胞膜滲出，細(xì)胞內(nèi)的酶逐漸合成，細(xì)胞外的酶則持續(xù)集聚，因而增加了酶的產(chǎn)量。由圖11可知，麩皮的誘導(dǎo)效果最佳，其酶活為121.07 U/mL，其他4種誘導(dǎo)劑也有誘導(dǎo)效果，但是沒(méi)有麩皮的效果好，因此確定最佳誘導(dǎo)劑為麩皮。

2.4.6 金屬離子 金屬離子是微生物生長(zhǎng)和新陳代謝所必需的，同時(shí)，一些無(wú)機(jī)金屬離子也是酶的激活劑，從圖12可以看出，氯化鉻、氯化鈉、氯化鉀、氯化鋇、氯化鈣、硫酸鎂均能提高果膠酶活性，其中以氯化鉀的促進(jìn)作用最強(qiáng)，說(shuō)明鉀離子與酶之間可能存在潛在的結(jié)合關(guān)系[27]。

從圖13可以看出，氯化鉀的最佳添加量為0.75 g，此時(shí)果膠酶活性為122.45 U/mL。隨著氯化鉀含量的增加，出現(xiàn)峰值之后，果膠酶活呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明氯化鉀含量在一定范圍內(nèi)對(duì)果膠酶活性起到促進(jìn)作用，含量過(guò)高反而會(huì)導(dǎo)致果膠酶失活。

2.4.7 初始pH值 從圖14可以看出，當(dāng)pH值為5時(shí)，果膠酶活性達(dá)到124.03 U/mL。隨著pH值的升高，出現(xiàn)峰值后，果膠酶活性呈下降趨勢(shì)。pH值太低或太高會(huì)改變培養(yǎng)基中有機(jī)化合物的離子化作用程度，干擾物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞，從而影響產(chǎn)酶效率[28]。因此，確定該菌種最佳生產(chǎn)酶pH值為5，符合真菌來(lái)源的果膠酶較細(xì)菌偏酸的報(bào)道[29]。

2.4.8 接種量 從圖15可以看出，接種量在1%～6%間變動(dòng)時(shí)，果膠酶的活性先上升后下降，當(dāng)接種量為3%時(shí)達(dá)到最高。當(dāng)接種量太小時(shí)會(huì)使初期菌種生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致延長(zhǎng)生產(chǎn)酶周期;當(dāng)接種量太大時(shí)，前期菌體生長(zhǎng)繁殖速度快，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要用于細(xì)胞的合成，導(dǎo)致酶的合成下降。因此，確定該菌種的最佳接種量為3%。

2.5 利用正交試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶條件

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)試驗(yàn)所得的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，從直觀分析和極差分析中確定最佳組合。

從表2可以看出，對(duì)產(chǎn)酶影響因素的次序從大

到小為B>C>A>D。從表3方差分析可知，初始pH值對(duì)產(chǎn)酶量影響極顯著，溫度、接種量對(duì)產(chǎn)酶影響顯著，而C/N對(duì)產(chǎn)酶影響不顯著，與直觀分析結(jié)果一致。因此，最佳方案為 A2B3C1D2，即果膠酶的最佳液體發(fā)酵產(chǎn)酶條件：發(fā)酵初始pH值為6，溫度為28 ℃，C/N為1 ∶2，接種量為2%，在該條件下果膠酶活性達(dá)到126.68 U/mL。

3 結(jié)論與討論

本研究以1株分離篩選自海拔2 500～3 000 m鹽井土壤樣品中的真菌為研究對(duì)象，結(jié)合形態(tài)學(xué)、rDNA-ITS序列測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、生理生化特性對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，鑒定該菌株為曲霉屬真菌，命名為棘孢曲霉GLUT-01。該菌株能耐受較大范圍的NaCl濃度，且能以多種芳香類(lèi)化合物為底物生長(zhǎng)。此外，它可以產(chǎn)果膠酶，這擴(kuò)大了產(chǎn)果膠酶菌種來(lái)源。

在本研究中，對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到該菌種單因素最佳發(fā)酵條件：碳源為葡萄糖，氮源為硫酸銨，C/N為1 ∶2，金屬離子為K+且添加量為0.75 g，接種量為3%，誘導(dǎo)劑為麩皮，溫度為30 ℃，培養(yǎng)基初始pH值為5.0。通過(guò)4因素3水平的正交試驗(yàn)確定果膠酶發(fā)酵的最優(yōu)條件：C/N為1 ∶2，培養(yǎng)基初始pH值為6，溫度為28 ℃，接種量為2%。在此最佳條件下發(fā)酵得到的果膠酶活性達(dá)到126.68 U/mL。之前也有文獻(xiàn)報(bào)道， 產(chǎn)果膠酶微生物有枯草芽孢桿菌等[30-31]，且多為細(xì)菌，目前對(duì)中度嗜鹽真菌產(chǎn)果膠酶的研究較少，該菌種在偏酸及高鹽環(huán)境下果膠酶活性較高，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

目前，筆者只對(duì)菌株棘孢曲霉GLUT-01 進(jìn)行了初步研究，今后將進(jìn)一步對(duì)其所產(chǎn)果膠酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究， 并將其應(yīng)用于高鹽環(huán)境下果膠的處理中，明確其在高鹽環(huán)境下降解果膠的能力。

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