梁蕓 朱沁泉 張滌

〔摘要〕 目的 研究健脾柔肝息風(fēng)湯對抽動障礙（TD）模型大鼠皮質(zhì)-紋狀體-丘腦-皮質(zhì)回路中多巴胺和環(huán)磷酸腺苷調(diào)節(jié)的磷蛋白（DARPP-32）、酪氨酸羥化酶（TH）含量的影響及其作用機制。方法 將40只SD大鼠隨機分為空白組（10只），造模組（30只），造模成功后，將造模組隨機分為模型組、氟哌啶醇組和健脾柔肝息風(fēng)湯組，每組10只，腹腔注射給藥7 d，采用HE染色觀察大鼠大腦皮層各區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元細胞形態(tài)變化，采用免疫組織化學(xué)染色檢測DARPP-32及TH的表達。結(jié)果 與空白組比較，模型組運動行為評分、刻板行為評分均上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，健脾柔肝息風(fēng)湯組、氟哌啶醇組運動行為評分、刻板行為評分均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與空白組大鼠比較，模型組、氟哌啶醇組及健脾柔肝息風(fēng)湯組大鼠的DARPP-32、TH水平降低（P<0.05）;與模型組比較，氟哌啶醇組及健脾柔肝息風(fēng)湯組DARPP-32、TH水平升高，其平均光密度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;氟哌啶醇組與健脾柔肝息風(fēng)湯組DARPP-32、TH平均光密度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 健脾柔肝息風(fēng)湯可升高TD模型大鼠腦組織中DARPP-32、TH的含量，從而調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)功能平衡，減少大鼠抽動癥狀的產(chǎn)生。

〔關(guān)鍵詞〕 兒童抽動障礙;DARPP-32;酪氨酸羥化酶;健脾柔肝息風(fēng)湯;大鼠

〔中圖分類號〕R272.6? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? &nbsp; 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.02.011

Effect of Jianpi Rougan Xifeng Decoction on the content of DARPP-32 and

TH in the brain neurons of model rats with tic disorder

LIANG Yun1， ZHU Qinquan2， ZHANG Di2*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated Hospital of

Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To study the effect of Jianpi Rougan Xifeng Decoction on the content of dopamine and adenosine 3'5'-monophosphate-regulated phospho-protein （DARPP-32） and tyrosine hydrogenase（TH） in the cortex striatum-thalamus-cortex loop of model rats with tic disorder， and to explore its mechanism. Methods 40 SD rats were randomly divided into blank group （n=10） and modeling group （n=30）， after successful modeling， the modeling group was randomly divided into model group， haloperidol

group and Jianpi Rougan Xifeng Decoction group， with 10 rats in each group. 7 days after intraperitoneal injection， HE staining was used to observe the morphological structure of each area of cerebral cortex and the morphological changes of neurons， and immunohistochemical staining was used to detect the expression of DARPP-32 and TH. Results Compared with blank group， motor behavior score and rigid behavior score of model group increased， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Compared with model group， motor behavior score and rigid behavior score of Jianpi Rougan Xifeng Decoction group and haloperidol group were decreased， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Compared with blank group， the levels of DARPP-32 and TH in model group， haloperidol group and Jianpi Rogan Xifeng Decoction group decreased （P<0.05）. Compared with model group， the levels of DARPP-32 and TH in haloperidol group and Jianpi Rogan Xifeng Decoction group increased， and their average optical density was significantly different （P<0.05）. And there was no significant difference in the average optical density of DARPP-32 and TH between the haloperidol group and the Jianpi Rougan Xifeng Decoction group （P>0.05）. Conclusion Jianpi Rougan Xifeng Decoction can increase the content of DARPP-32 and TH in brain tissues of rats with tic disorder， thus regulating the functional balance of dopaminergic nervous system and reducing the occurrence of tic symptoms.

〔Keywords〕 children with tic disorder; DARPP-32; tyrosine hydroxyls; Jianpi Rogan Xifeng Decoction; rat

抽動障礙（tic disorder， TD）是一種慢性神經(jīng)精神障礙性疾病，多于兒童時期起病，其特征表現(xiàn)是肌肉收縮，即突然、反復(fù)、快速、不自主的運動或發(fā)聲[1-2]。中醫(yī)學(xué)認為本病病因為陰陽失衡、臟腑受累、五臟虛實不定，當(dāng)平秘陰陽、調(diào)整臟腑[3]。張滌教授在臨床中以“抑木扶土”為治療原則，以《仁齋直指小兒方論》之撮風(fēng)散化裁，研發(fā)了健脾柔肝息風(fēng)湯。

兒童TD的病因及發(fā)病機制尚未明確，可能與遺傳因素、免疫病理損害、神經(jīng)生化因素、精神心理因素、微量元素異常等有關(guān)。研究表明，多種中樞神經(jīng)遞質(zhì)如多巴胺（dopamine， DA）、去甲腎上腺素（noradrenaline， NE）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）等單氨類遞質(zhì)的異常表達在TD的發(fā)病過程中起著重要作用[4]。多巴胺和環(huán)磷酸腺苷調(diào)節(jié)的磷蛋白（dopamine and adenosine 3'5'-monophosphate-regulated phospho-protein， DARPP-32）是DA能神經(jīng)遞質(zhì)功能調(diào)節(jié)過程中的一個關(guān)鍵分子，主要分布于棘狀神經(jīng)元胞質(zhì)如含有DA受體 D1R 和D2R的紋狀體中，以及其他受DA能纖維投射的核團和腦區(qū)。DARPP-32受DA、腺苷和酪氨酸、5-HT、谷氨酸、阿片肽、苯丙胺等多種神經(jīng)調(diào)制物的調(diào)節(jié)，在DA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中處于中心位置，是多種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)動態(tài)信息調(diào)節(jié)與整合的關(guān)鍵節(jié)點，其自身不同位點的磷酸化和去磷酸化形成動態(tài)平衡，從而對各種神經(jīng)遞質(zhì)及受體發(fā)揮雙向調(diào)控作用，以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的電化學(xué)性質(zhì)，參與多種生理和病理過程[5]。酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxyls， TH）是DA合成過程中的第一個酶，同時起到限速和催化的作用[6]。TH主要分布在去甲腎上腺能神經(jīng)軸突的胞質(zhì)中，在輔酶TH和二甲基四氫喋呤啶的參與下，酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴;在輔酶多巴脫羧酶和磷酸吡哆醛參與下，多巴轉(zhuǎn)化為DA。TH作為重要輔酶，其活性和表達直接影響著DA的生物合成[7]。本研究以IDPN腹腔注射誘導(dǎo)的TD模型大鼠為研究對象[8]，從CSTC回路中的神經(jīng)遞質(zhì)入手，以不同藥物處理TD模型大鼠，探究其行為學(xué)改變與皮質(zhì)、紋狀體區(qū)DARPP-32和TH含量變化間的關(guān)系，對比氟哌啶醇作用機制[9-10]，進一步探究中藥組方健脾柔肝息風(fēng)湯治療TD的作用靶點。

1 材料

1.1? 實驗動物

4周齡健康雄性SD大鼠40只，SPF級，體質(zhì)量80～100（89.55±5.547） g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證編號：SYXK（湘2019-0004）。分籠喂養(yǎng)，自由采食，溫度：（24±3） ℃，濕度：40%～60%。實驗全程完成于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新實驗中心，對動物的各種處理均遵照中華人民共和國科技部2006年頒布的有關(guān)動物的使用及倫理學(xué)規(guī)定。

1.2? 實驗試劑

HE染液（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：G1003）;Phospho-DARPP-32抗體（江蘇親科，批號：AF3487）;TH 抗體（武漢三鷹，批號：25859-1-AP）;IDPN（上海麥克林，批號： I829733）;DAB試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：G1211）。

1.3? 實驗藥物

健脾柔肝息風(fēng)湯組成：鉤藤10 g，全蝎6 g，僵蠶10 g，白芍10 g，茯苓10 g，甘草2 g。總生藥量48 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，按《中華人民共和國藥典》要求制備煎煮液，按含生藥0.8 g/mL配制成健脾柔肝息風(fēng)湯藥液冷藏備用，所有藥材均經(jīng)鑒定符合《中華人民共和國藥典》。氟哌啶醇（浙江寧波大紅鷹規(guī)格：2 mg×100 s批號：H33020585）。0.9%生理鹽水（江西科倫規(guī)格：500 mL∶4.5 g）等。

1.4? 主要儀器

Donatello型脫水機（意大利DIAPATH）;JB-P5包埋機（武漢俊杰電子有限公司）;RM2016病理切片機（上海徠卡）;JB-L5凍臺（武漢俊杰電子有限公司）;KD-P組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）;TSY-B型脫色搖床、MX-F型渦旋混合器、D1008E型掌上離心機均由武漢賽維爾生物科技有限公司生產(chǎn);E100顯微鏡、Nikon DS-U3成像系統(tǒng)均由日本Nikon生產(chǎn)。

2 方法

2.1? 模型建立及分組

40只SD大鼠隨機分為空白組（10只）、造模組（30只）。造模組SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始造模：將IDPN溶于0.9%氯化鈉溶液，終濃度為30 mg/mL，參照Diammond方法[11]，每只大鼠腹腔注射IDPN 150 mg/（kg·d），空白組則腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)注射1周。大鼠出現(xiàn)仰頭、鼻嗅、擺頭、軀體旋轉(zhuǎn)等興奮性增高、活動增多的刻板行為，行為學(xué)評分≥1分，標(biāo)志模型誘導(dǎo)成功[12-13]。造模成功后，將造模組30只SD大鼠隨機分為模型組、氟哌啶醇組、健脾柔肝息風(fēng)湯組，每組10只。

2.2? 給藥

造模1周后，氟哌啶醇組灌胃氟哌啶醇混懸液0.8 mg/（kg·d），質(zhì)量濃度為1 mL含0.04 mg藥物;健脾柔肝息風(fēng)湯組按16 g/（kg·d）給藥;空白組、模型組予等量蒸餾水，4組均按照2 mL/kg灌胃給藥，每日1次，連續(xù)灌胃1周。

2.3? 標(biāo)本采集

末次灌胃24 h后斷頭處死各組大鼠（處死前24 h禁食不禁水），在冰盒上快速剝離大鼠全腦及紋狀體并置于蔗糖濃度為250 g/L的0.1 mol/L磷酸低溫緩沖液（pH 7.4）中，4 ℃過夜直至沉底。

2.4? 指標(biāo)測定

2.4.1? 腦組織病理學(xué)觀察? 大鼠腦組織以常規(guī)方法制片，HE染色后顯微鏡鏡檢并拍照，圖像采集分析大鼠腦組織病理改變。

步驟：石蠟切片脫蠟至水，自來水洗后進行蘇木素染色。再進行伊紅染色，最后脫水封片。結(jié)果判讀：細胞核呈藍色，細胞質(zhì)呈紅色。

2.4.2? DARPP-32、TH蛋白表達量測定? 免疫組化實驗嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，按以下步驟制片后顯微鏡鏡檢，使用Image J 1.8軟件進行圖像采集分析，隨機選取4個高倍視野進行蛋白平均光密度值測定，作為蛋白表達量。

步驟：（1）石蠟切片脫蠟至水;（2）抗原修復(fù); （3）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;（4）血清封閉;（5）加一抗、二抗;（6）DAB顯色，陽性為棕黃色;（7）蘇木素復(fù)染細胞核;（8）脫水封片。結(jié)果判讀：蘇木素染細胞核呈藍色，DAB顯出的陽性表達為棕黃色。

2.4.3? 大鼠行為學(xué)評價? 藥物干預(yù)灌胃結(jié)束當(dāng)天進行各組大鼠行為學(xué)觀察。于安靜、避光的環(huán)境中，每只大鼠在觀察籠內(nèi)適應(yīng)環(huán)境5 min，再記錄5 min內(nèi)的活動情況，按照運動、刻版行為進行評分。整個過程采取盲法觀察記錄，由2人同時分別觀察并記錄影像數(shù)據(jù)。

運動行為評估標(biāo)準(zhǔn)參照Kadasah[14]方法評分：0分，安靜或正?；顒?1分，過度興奮;2分，探究行為增加，不連續(xù)吸鼻;3分，不停跑動;4分，不停跑動伴有驚跳。

刻板行為評估標(biāo)準(zhǔn)參照Diamond的方法[11]評分：0分，無刻板運動;1分，軀體旋轉(zhuǎn)行為（順時針或逆時針的旋轉(zhuǎn)行為）;2分，頭和頸部的上下運動過多（頭頸部和地面垂直方向的一種異常運動）;3分，頭頸部的上下運動過多加旋轉(zhuǎn)運動;4分，頭向側(cè)擺，合并頭和頸部的上下運動過多。

2.5? 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布與方差齊性，以“x±s”表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 各組大鼠腦組織HE病理染色結(jié)果

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠腦組織未見明顯病理損傷，大腦皮層神經(jīng)元細胞排列整齊、結(jié)構(gòu)完整，細胞核呈卵圓形，極少數(shù)呈梭形，細胞核染色較淡，細胞無水腫。模型組大鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞見壞死性改變，胞體腫脹，周圍見寬大透亮區(qū)，細胞核呈梭形，且細胞核與細胞質(zhì)界限模糊。氟哌啶醇組、健脾柔肝息風(fēng)湯組的損傷程度介于空白組和模型組之間，且兩組損傷程度無明顯差異。見圖1。

HE染色結(jié)果顯示，空白組大鼠紋狀體神經(jīng)元細胞形態(tài)正常，分布均勻、緊密有序，間質(zhì)清晰;模型組細胞分布疏松、混亂，數(shù)量明顯較少，形態(tài)不規(guī)則。氟哌啶醇組、健脾柔肝息風(fēng)湯組細胞損傷程度明顯減輕，介于空白組與模型組之間。見圖2。

3.2? 大鼠行為學(xué)評分

與空白組比較，模型組運動行為評分、刻板行為評分均上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，健脾柔肝息風(fēng)湯組、氟哌啶醇組運動行為評分、刻板行為評分均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。氟哌啶醇組與健脾柔肝息風(fēng)湯組行為學(xué)評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3.3? 各組大鼠腦組織DARPP-32、TH平均光密度比較

與空白組比較，模型組及治療組的DARPP-32、TH水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，氟哌啶醇組及健脾柔肝息風(fēng)湯組DARPP-32、TH水平不同程度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。氟哌啶醇組與健脾柔肝息風(fēng)湯DARPP-32、TH平均光密度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

4 討論

大腦皮層是控制軀體運動最重要的區(qū)域，由大腦皮層發(fā)出的運動通路在調(diào)節(jié)軀干、四肢和頭面部的運動中發(fā)揮著重要作用[15]。紋狀體是錐體外運動系的主要神經(jīng)結(jié)構(gòu)之一，紋狀體的主要功能包括維持肌肉的正常張力和肌肉運動時保持肌群的協(xié)調(diào)與相對穩(wěn)定[16-17]。紋狀體病變時出現(xiàn)不自主肌肉運動，且不自主動作可在情緒激動時增多增強，在入睡后消失。大腦皮層區(qū)和紋狀體的病變與抽動的發(fā)生有著密切聯(lián)系。

大腦神經(jīng)元上的多巴胺受體分為D1R和D2R兩大類[18-19]。D1R與DA結(jié)合后被激活，可增強腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase， AC）的活性，在興奮性G蛋白的介導(dǎo)下，增加環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine

monophosphate， cAMP）的生成[20]，蛋白激酶（protein kinase， PKA）在cAMP的作用下主導(dǎo)DARPP-32第34位蘇氨酸殘基（Thr34）的磷酸化。D2R可通過抑制AC的活性以減少cAMP的生成，從而降低PKA的活性，主導(dǎo)DARPP-32（Thr34）去磷酸化[21-22]。DARPP-32也被Thr75上的細胞周期蛋白依賴性激酶5磷酸化[23]，而DARPP-32的磷酸化形式抑制了PKA活性[24]，即高水平的磷酸-DARPP-32使PKA處于普遍的抑制狀態(tài)[5]，PKA的抑制狀態(tài)使得神經(jīng)興奮信號不能抵達突出末梢，不能引發(fā)肌細胞收縮，外在表現(xiàn)為抽動行為的減少。

DARPP-32作為腦內(nèi)DA的“第三信使”，可通過其自身不同位點的磷酸化和去磷酸化整合神經(jīng)信息的傳遞，發(fā)揮雙向調(diào)控作用[23]。DARPP-32代謝紊亂通過雙向作用影響DA的分泌與代謝，從而導(dǎo)致運動調(diào)節(jié)環(huán)路CSTC回路的功能異常[25]，形成對運動皮質(zhì)的損傷，表現(xiàn)為臨床抽動癥狀的發(fā)生。

本次研究中，IDPN誘導(dǎo)的TD大鼠模型出現(xiàn)鼻嗅、仰頭、擺頭、軀體旋轉(zhuǎn)等興奮增高、活動增多的刻板行為，類似于TD患兒撅嘴、搐鼻、擺頭等動作[11]，且模型組大鼠DARPP-32、TH水平較空白組明顯降低，證實造模成功。氟哌啶醇組、健脾柔肝息風(fēng)湯組DARPP-32、TH水平較模型組升高（P<0.05），且氟哌啶醇與健脾柔肝息風(fēng)湯的療效，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。大鼠行為學(xué)評分氟哌啶醇組、健脾柔肝息風(fēng)湯組均較模型組下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;氟哌啶醇組與健脾柔肝息風(fēng)湯組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。TD模型大鼠抽動癥狀減少，提示健脾柔肝息風(fēng)湯改善TD模型大鼠抽動癥狀的機制與氟哌啶醇類似[19]，可調(diào)節(jié)DA能神經(jīng)信號傳導(dǎo)從而拮抗DA受體，以減少DA的生成，從而減少抽動癥狀的發(fā)生。

根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，TD的病因有先天稟賦不足、飲食內(nèi)傷、感受外邪、疾病影響、情志失調(diào)，以及學(xué)習(xí)緊張、勞累疲倦、長時間接觸電子產(chǎn)品等多個方面。小兒“肝常有余”，肝屬木，主筋[26]，體陰而用陽，小兒為純陽之體，疾病易從熱化，肝亢化火則引動肝風(fēng)，出現(xiàn)驚惕、抽動等風(fēng)動證候[27]。小兒“脾常不足”，脾屬土，木旺則乘土。肝氣過于亢盛、脾氣偏于虛弱，均可致木與土之間的克化關(guān)系失衡，肝亢生風(fēng)，脾弱生痰，風(fēng)痰交結(jié)，而見脾虛肝旺之候[28]。張滌教授從肝脾論治兒童TD，以健脾化痰、柔肝息風(fēng)為法，擬健脾柔肝息風(fēng)湯[29]，選用撮風(fēng)散中之鉤藤、僵蠶、全蝎，取其息風(fēng)鎮(zhèn)痙之用，去麝香、朱砂，又防質(zhì)重礙胃、耗氣傷陰;加用白芍柔肝養(yǎng)肝、茯苓健脾化痰，二藥合用調(diào)和肝脾;甘草既調(diào)和諸藥，更增茯苓健脾化痰之效。本研究基于DA能信號傳導(dǎo)通路，通過動物實驗，驗證了健脾柔肝息風(fēng)湯可通過調(diào)節(jié)DARPP-32、TH水平以拮抗DA受體，減少DA的生成，從而調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)功能平衡，減少大鼠抽動癥狀的產(chǎn)生，但其具體調(diào)節(jié)機制仍需進一步研究。

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