朱琳涵，崔 紅

隨著輔助生殖技術及早產(chǎn)兒管理水平的提高，使得早產(chǎn)兒存活率大幅提升，但隨之早產(chǎn)兒腦損傷(BIPI)發(fā)病率也逐年升高[1-3]。BIPI是指因產(chǎn)前、產(chǎn)時和(或)出生后各種病理因素導致早產(chǎn)兒不同程度的腦缺血和(或)出血性損傷[4-6]。BIPI能引起腦灰質(zhì)和白質(zhì)異常，嚴重影響神經(jīng)發(fā)育，導致認知和行為功能障礙，給患兒家庭和社會帶來沉重負擔[7-9]。造成BIPI的原因很多，根本原因為腦組織尚未發(fā)育成熟，發(fā)育中的腦組織對缺氧缺血尤為敏感，各種圍生期因素導致的缺氧缺血為其最主要發(fā)生原因。

微小RNA(miRNA)是一類能對基因表達進行微調(diào)控的非編碼單鏈RNA[10]。研究證實，miRNA通過與mRNA上編碼蛋白質(zhì)的基因3'-非編碼區(qū)(3'-UTR)相結(jié)合，降低目的mRNA的穩(wěn)定性，誘導其降解或抑制翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達[11]。miRNA可以廣泛影響細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達，進而對細胞的生長和分化造成影響。目前，miRNA已被證實在干細胞增生與分化、腫瘤發(fā)生和發(fā)展、細胞凋亡等過程中起重要作用[12]。

我們的前期研究結(jié)果表明，缺氧缺血后腦組織中miR-200b和miR-182表達顯著下調(diào)，靶基因預測表明Wnt信號通路中Rac-1可能在miR-200b和miR-182的下游[13]。Wnt基因是Nusse等從小鼠乳腺癌中克隆的癌基因，其通過自分泌或旁分泌途徑與膜受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)信號通路，調(diào)節(jié)靶基因表達，在細胞增殖、分化、遷移等過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。Rac-1屬Rho家族的小GTP結(jié)合蛋白，其主要功能是調(diào)節(jié)肌動蛋白形成，激活后可參與肌動蛋白應力纖維和黏附斑的形成，促進細胞骨架結(jié)構(gòu)重建，調(diào)節(jié)板足和絲足延伸，影響細胞極化，促進細胞遷移[16-17]。近年發(fā)現(xiàn)Rac-1在神經(jīng)細胞發(fā)育過程中起重要作用[18-19]。

考慮到miR-200b和Rac-1在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和遷移過程中的潛在作用，研究它們在腦缺血缺氧條件下的表達具有重要意義。本文建立新生大鼠缺氧缺血模型并制備全腦片進行培養(yǎng)，用新型納米載體(EntransterTM-R)轉(zhuǎn)染miR-200b，并使用qRT-PCR檢測miR-200b和Rac-1的表達，旨在了解缺氧缺血性腦損傷動物模型miR-200b及Rac-1 mRNA表達，以及轉(zhuǎn)染miR-200b后Rac-1 mRNA表達變化，并探討miR-200b對Rac-1 mRNA可能存在的調(diào)控關系。

1 材料與方法

1.1動物來源 SPF級新生3日齡SD大鼠(雌雄不計，體質(zhì)量8～10 g)由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號[SCXK(京)2012-0001]。本方案經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院動物委員會批準。

1.2腦片的制備與培養(yǎng) 生后3 d SD大鼠用75%乙醇消毒，斷頭后取腦組織。迅速將腦組織置于預冷的解剖緩沖液(64% DMEM、32% Hank's平衡鹽溶液、6.5 g/L D-葡萄糖、2.98 mg/L HEPES、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、2.5 μg/ml兩性霉素)中，冷卻后剝除軟腦膜。在鋪有濾紙的活組織切片機上切取全腦片，厚度為350 μm。6孔培養(yǎng)板各孔內(nèi)加1.2 ml完全培養(yǎng)液(50% DMEM、25% Hank's平衡鹽溶液、25% 馬血清、6.5 g/L D-葡萄糖、2.98 mg/L HEPES、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、2.5 μg/ml兩性霉素)，然后放入插入式微孔濾膜，將完好的腦片分放在各孔內(nèi)濾膜上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)(37 ℃、95% O2+5% CO2及飽和濕度)培養(yǎng)36 h。

1.3新生大鼠全腦片缺氧缺血模型的建立 將腦片均分為4組：空白對照組、缺氧缺糖組、miR-200b轉(zhuǎn)染組、陰性對照轉(zhuǎn)染組。空白對照組在正常培養(yǎng)基(50% DMEM、25% HBSS、25%馬血清、6.5 g/L D-葡萄糖)中培養(yǎng)(37 ℃、95% O2+5% CO2及飽和濕度)，余3組為無糖培養(yǎng)基(50% DMEM、25% HBSS、25%馬血清)，放入含8% O2+92%氮氣的密閉缺氧罐中，將缺氧罐置于37 ℃電熱恒溫水浴箱內(nèi)，進行缺氧缺糖處理60 min后恢復氧糖供應?？瞻讓φ战M繼續(xù)置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，缺氧缺糖組于恢復氧糖供應后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其他組開始轉(zhuǎn)染。選擇5個時間點(12 h、24 h、3 d、5 d和7 d)用qRT-PCR檢測RNA表達。

1.4轉(zhuǎn)染 首先制備miRNA稀釋液：將10 μl FAM標記的20 μmol/L miR-200b陰性對照儲存液(廣州瑞博生物科技有限公司)或20 μmol/L miR-200b儲存液(廣州瑞博生物科技有限公司)與40 μl OPTI-MEM(美國GIBCO公司)充分混合。其次制備EntransterTM-R稀釋液：將10 μl EntransterTM-R(北京英格恩生物科技有限公司)與40 μl OPTI-MEM充分混合，室溫靜置5 min。將EntransterTM-R稀釋液和miRNA稀釋液充分混合，室溫靜置30 min。最后，100 μl轉(zhuǎn)染復合物滴加到有900 μl全培養(yǎng)基的6孔板中(miRNA終濃度為200 nmol/L)，前后移動培養(yǎng)皿，混合均勻后，將6孔板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5成像 轉(zhuǎn)染后24 h留取腦片標本，取冰凍切片(厚度約10 μm)于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。

1.6總RNA提取與鑒定 Trizol法提取總RNA。在液氮中充分研磨收集腦片組織，加入1 ml Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，室溫下靜置5 min。加入200 μl三氯甲烷，劇烈混勻15 s，室溫下靜置2～3 min。然后在4 ℃下，12 000×g離心15 min取上清，置入新的1.5 ml EP管中加入500 μl異丙醇，顛倒混勻。室溫靜置3～5 min。4 ℃下12 000×g離心10 min，棄上清加DEPC水配制的75%乙醇1 ml洗滌沉淀。4 ℃下7500×g離心5 min,棄上清，超凈工作臺干燥15～20 min，最后用30 μl RNase-free H2O溶解沉淀。

為確認總RNA的完整性，取上述提取的總RNA 1 μl稀釋至500 μl，用紫外分光光度計分別測量260及280 nm波長處的吸光度(OD)值；RNA純度以OD260/OD280表示，1.8～2.0視為純度高。取上述抽提的細胞總RNA 3 μl進行快速1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并拍照?？梢?8S、18S、5S 3條亮度依次遞減的清晰條帶，若28S與18S條帶亮度比值約為2︰1說明所提取的總RNA完整無降解。

1.7逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 首先，將1 μl oligo或miR-200b和U6特異性逆轉(zhuǎn)錄引物、3～5 μg總RNA、1 μl dNTP(10 mmol/L)和10 μl RNase-free ddH2O加入無核酸酶的微量離心管中，并70 ℃加熱5 min。然后，將混合物快速冷卻2 min。短暫離心后，加入5×第一鏈合成緩沖液4 μl、DTT(0.1 mol/L)2 μl、RNase核酸酶抑制劑(40 U/μl)1 μl，混勻后37 ℃孵育2 min。加入1 μl(200 U)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，輕輕吹打混勻。如使用隨機引物，則將離心管在25 ℃孵育20 min、37 ℃孵育50 min后，70 ℃加熱15 min以終止反應，獲得cDNA。

1.8PCR檢測mRNA表達 以cDNA為模板進行PCR，以U6和β-actin基因表達作為內(nèi)參照。β-actin序列：正向引物：GCCAACACACAGTGCTGTCT；反向引物：AGGAGCAATGATCTTGATCTT，擴增片段93 bp。Rac-1序列：正向引物：AGGAAGAGAAAATGCCTG；反向引物：AGCAAAGCGTACAAAGGT，擴增片段80 bp。每個樣品的PCR反應總體積為50 μl，包括cDNA(2 μl)、正向引物(1 μl)、反向引物(1 μl)、SYBR Green I混合物(25 μl)和ddH2O(21 μl)。miR-200b和U6 PCR的參數(shù)設置為95 ℃ 15 min，然后95 ℃ 20 s和61 ℃ 40 s，共40個循環(huán)。Rac-1和β-actin PCR的參數(shù)設置為95 ℃ 15 min，然后95 ℃ 20 s和56 ℃ 40 s，共40個循環(huán)。使用ABI 7500 SDS軟件計算mRNA相對表達量。

2 結(jié)果

2.1納米載體轉(zhuǎn)染miRNA 轉(zhuǎn)染后，觀察到FAM標記的miRNA熒光，表明成功轉(zhuǎn)染了miR-200b并在細胞中積累(圖1)。所建立的miRNA納米載體可用于進一步實驗。

圖1 缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織細胞成功轉(zhuǎn)染FAM標記的miRNA陰性對照熒光顯像圖

2.2RNA完整性鑒定 通過從腦組織提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳(圖2A)，分離出5S、18S和28S條帶。定量分析顯示28S與18S的比值約為2(圖2B)，表明RNA相對完整，可用于以下實驗。

圖2 缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織切片RNA瓊脂糖凝膠電泳分析

2.3缺氧缺糖條件下miR-200b表達 空白對照組12 h～3 d miR-200b mRNA表達呈上升趨勢，3～7 d呈下降趨勢。相反，缺氧缺糖組12 h～3 d miR-200b mRNA表達呈下降趨勢，3～7 d呈上升趨勢。在較早期(12 h)，缺氧缺糖組miR-200b mRNA表達高于空白對照組，之后則低于空白對照組；陰性對照轉(zhuǎn)染組與缺氧缺糖組miR-200b mRNA表達無差異(P>0.05)。然而，miR-200b轉(zhuǎn)染組miR-200b mRNA表達明顯高于缺氧缺糖組及空白對照組(P<0.05)。盡管miR-200b轉(zhuǎn)染組miR-200b表達變化趨勢與空白對照組相似，但是最高表達出現(xiàn)在5 d，晚于空白對照組。見圖3。

2.4缺氧缺糖條件下Rac-1 mRNA表達 在缺氧缺糖條件下，空白對照組12 h～3 d Rac-1 mRNA表達呈下降趨勢，3～7 d呈上升趨勢；缺氧缺糖組12 h～5 d Rac-1 mRNA表達呈上升趨勢，5～7 d呈下降趨勢。在較早期(12 h)空白對照組和缺氧缺糖組Rac-1 mRNA表達無顯著差異(P>0.05)。此后，經(jīng)缺氧缺糖處理各組Rac-1 mRNA表達一直高于空白對照組。見圖4。

2.5miR-200b對Rac-1 mRNA表達的影響 缺氧缺糖組與陰性對照轉(zhuǎn)染組雖然在各時間點上miR-200b mRNA的表達量均明顯低于miR-200b轉(zhuǎn)染組(圖3)，但是在各時間點上Rac-1 mRNA的表達量及變化趨勢與miR-200b轉(zhuǎn)染組均無顯著差異(圖4)，提示miR-200b在mRNA水平上不影響Rac-1 mRNA表達。

圖3 缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織切片各時間點miR-200b mRNA表達折線圖

圖4 缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織切片各時間點Rac-1 mRNA表達折線圖

3 討論

本研究采用腦片培養(yǎng)法探討缺氧缺糖環(huán)境對新生大鼠腦組織miR-200b和Rac-1 mRNA表達的影響。WANG等[19]研究了EntransterTM轉(zhuǎn)染基因的膜親和力，且多項研究證實EntransterTM轉(zhuǎn)染載體是角膜基因治療的有效載體[20-22]，以納米聚合物為載體的miRNA轉(zhuǎn)染技術是一種新穎的方法。DNA、RNA、PNA、dsRNA等基因治療分子可被包裹在納米載體的內(nèi)部空間或吸附在納米載體表面。納米顆粒通過細胞的吞噬作用進入細胞，釋放出基因治療分子，發(fā)揮基因治療潛能，具有攜帶能力高、無病毒性和免疫原性的良好生物相容性，并能很好保護內(nèi)分子不被DNase或RNase降解[23]。

本研究缺氧缺糖處理12 h時，缺氧缺糖組miR-200b mRNA表達高于空白對照組，提示缺氧缺糖條件下miR-200b可能在短時間內(nèi)上調(diào)，這可能與缺氧后發(fā)生的一些應激反應有關。在缺氧缺血過程中，鈣超載、氧化應激、炎癥反應等多種分子機制參與了腦損傷的發(fā)生和修復過程。miR-200b作為一種在神經(jīng)系統(tǒng)中含量非常豐富的miRNA，可能通過多種途徑影響腦損傷的修復。LEE等[23]研究顯示，缺血預處理后3 h，包括miR-200b在內(nèi)的8種miRNA表達顯著上調(diào)，推測miR-200b可能通過抑制脯氨酰羥化酶-2表達，從而減少缺氧誘導因子-1(HIF-1)降解，保護腦組織。在本研究中，缺氧缺糖處理24 h后，缺氧缺糖組miR-200b mRNA表達顯著降低，在第3天降至最低。miR-200b mRNA表達逐漸抑制可能與隨后的腦損傷修復有關，但具體原因有待進一步研究。

據(jù)報道，miR-200b在小鼠排卵過程中發(fā)揮重要作用，且對女性生育能力至關重要[24-25]。TANG等[25]研究提示miR-200b表達可能會影響胃癌患者預后。此外，miR-200b被認為是可預測神經(jīng)系統(tǒng)疾病預后的有效因子[26-28]。目前有證據(jù)顯示miR-200b是誘導成人血管生成的“開關”[29]。miR-200b沉默血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血小板衍生生長因子等多種血管生成生長因子[30-31]。缺氧引起內(nèi)皮細胞miR-200b表達下調(diào)有助于損傷后血管生成[32-33]。

本研究在恢復缺氧缺糖環(huán)境后，Rac-1 mRNA表達增加，第5天達高峰，然后下降。在缺氧缺血過程中，Rac-1可通過多種途徑參與腦損傷的修復。一方面，Rac-1能激活缺氧缺糖后的HIF-1，從而正向調(diào)節(jié)VEGF，促進組織血管的生成。同時，Rac-1還可通過Wnt信號通路調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合，參與神經(jīng)細胞損傷后的髓鞘修復[34]。Rac-1通過Wnt/PCP途徑調(diào)控c-Jun活性，從而在細胞骨架重建中發(fā)揮作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)Rac-1 mRNA表達并未隨miR-200b的過表達而發(fā)生明顯改變，在各時間點，缺氧缺糖組與miR-200b轉(zhuǎn)染組Rac-1 mRNA表達量的差異無統(tǒng)計學意義，可能原因為標本量偏?。蝗毖跞毖獣r，腦組織內(nèi)多種基因調(diào)控機制發(fā)生改變；miR-200b能靶向多種mRNA(包括Rac-1)發(fā)揮生物學效應；Rac-1 mRNA表達受多種因素、多種信號通路途徑調(diào)節(jié)；Rac-1主要在蛋白水平對細胞骨架重建、細胞遷移等產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用；qRT-PCR本身有一定局限性，只能翻譯前mRNA水平變化，對于翻譯后蛋白水平的表達仍需借助其他手段。

本實驗對大鼠全腦片氧糖剝奪后miR-200b和Rac-1 mRNA表達做了初步探索，明確了氧糖剝奪對miR-200b及Rac-1 mRNA表達的影響。實驗中僅采用了過表達方法進行分析，后續(xù)可增加miR-200b抑制組，拮抗miR-200b作用后觀察Rac-1表達，即可在兩個層面更加有力證實miR-200b對Rac-1表達的影響；對于氧糖剝奪12 h內(nèi)miR-200b表達量的變化仍有待進一步研究。本研究腦片培養(yǎng)雖然保持了一定的組織完整性，但是與在體實驗是否存在差異，仍需進一步驗證。