陳敏娜，李春蘭，劉 靜，*

(1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院乳腺內(nèi)科，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院廣東省乳腺癌診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/長(zhǎng)江學(xué)者實(shí)驗(yàn)室/生理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041)

在人體中，基因表達(dá)的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)倪^程，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是極其重要的一環(huán)，也是分子生物學(xué)研究的重要內(nèi)容。目前雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控研究重要的實(shí)驗(yàn)方法。通過對(duì)啟動(dòng)子序列和活性的分析，驗(yàn)證啟動(dòng)子結(jié)合元件的反式激活能力，進(jìn)而驗(yàn)證基因之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系[1]。

乳腺癌現(xiàn)已超過肺癌，成為全球最常見的惡性腫瘤。而作為體表腫瘤，乳腺癌的轉(zhuǎn)移是患者因癌癥死亡的主要原因[2]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在發(fā)育的乳腺中，催乳素(prolactin，PRL)所介導(dǎo)的PRL-JAK2-STAT5A是較經(jīng)典的調(diào)控分子通路，可以調(diào)控乳腺發(fā)育、增殖、分化、泌乳等重要功能[3-4]。在催乳素的刺激下，持續(xù)表達(dá)活化的STAT5會(huì)抑制乳腺退化并促進(jìn)乳腺腫瘤的形成，多認(rèn)為其是原癌基因[5-6]，但在乳腺癌患者中，STAT5的表達(dá)卻是影響乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素[6-8]。乳腺癌轉(zhuǎn)移進(jìn)展的過程會(huì)伴隨STAT5活化形式的丟失和/或轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)[9-10]。Sultan等[9]發(fā)現(xiàn)催乳素激活STAT5表達(dá)可以抑制遷移侵襲，同時(shí)增加細(xì)胞表面黏連蛋白E-cadherin，但是對(duì)細(xì)胞總的E-cadherin的表達(dá)并無影響。研究表明，STAT5A活化在抑制乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，并預(yù)示患者良好的預(yù)后[9-10]。

構(gòu)建可以有效監(jiān)測(cè)STAT5A啟動(dòng)子活性的平臺(tái)，將有利于研究STAT5A在乳腺癌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。本研究組通過啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)STAT5A啟動(dòng)子部位存在Notch信號(hào)通路的結(jié)合序列，即CSL結(jié)合位點(diǎn)TGGGAA或GTGGGAA。因此，為進(jìn)一步研究Notch信號(hào)通路是否在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控STAT5A的表達(dá)，我們構(gòu)建STAT5A啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，以及僅包含Notch結(jié)合序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，并進(jìn)行雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證構(gòu)建質(zhì)粒的有效性。

1 材料與方法

1.1材料

DNAzol(D104-01)購(gòu)于北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；DNA純化回收試劑盒(#P214-03)、質(zhì)粒小提試劑盒(DP103)、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(DP117)購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；TransStart FastPfu DNA Polymerase購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ、E.coliCompetent Cells DH5α購(gòu)自TaKaRa公司；Thermo T4 DNA Ligase試劑盒(#EL0011)購(gòu)于Thermo公司；載體質(zhì)粒pGL3-Enhancer(圖1)及Dula-Luciferas Reporter Assay system試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.2方法

1.2.1 人乳腺癌MCF7細(xì)胞基因組DNA提取 MCF7細(xì)胞購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，使用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco公司)培養(yǎng)于35 mm培養(yǎng)皿，適時(shí)更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)90%時(shí)，予PBS清洗后，按DNAzol說明書提取MCF7細(xì)胞的基因組DNA，作為擴(kuò)增模板。使用核酸分析儀(Thermo公司)檢測(cè)所提基因組DNA的濃度及純度后，置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存待用。

圖1 pGL3-Enhancer質(zhì)粒圖譜(Promega公司)

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 在NCBI上查找STAT5A基因序列，即NC_000017.11，并將其第一個(gè)外顯子往前2 000 bp的范圍視為啟動(dòng)子區(qū)域，即本研究的目標(biāo)序列。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，同時(shí)加入正向酶切位點(diǎn)KpnⅠ和反向酶切位點(diǎn)HindⅢ以及相應(yīng)的保護(hù)堿基，所采用的引物序列如下：STAT5A-pro正向，5′-GGGGTACCTCTGATCTTCCTGAACCCCCA-3′；反 向，5′-CCAAGCTTAGAAAAGTCCAGGGAGG GACC-3′。STAT5A-pro-Notch正向，5′-CGGGGTAC CTGCCAAATCCATTGCTCA-3′；反 向，5′-CCCAAG CTTTCTTGCCCCTTACTACCTC-3′。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為2 101和287 bp。所設(shè)計(jì)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 目的片段擴(kuò)增 本項(xiàng)目采用可以用于快速PCR擴(kuò)增的高保真DNA聚合酶TransStart FastPfu DNA Polymerase，以MCF7細(xì)胞基因組DNA為模板，分別使用STAT5A-pro及STAT5A-pro-Notch引物擴(kuò)增STAT5A啟動(dòng)子區(qū)的目標(biāo)DNA片段。PCR反應(yīng)體系見表1，引物在使用前已提前測(cè)試并確定最適退火溫度，STAT5A-pro引物的最適退火溫度為66℃，STAT5A-pro-Notch引物的最適退火溫度為54℃，按說明書PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。然后分別使用1%及3%的瓊脂糖凝膠電泳，于紫外燈下觀察并切取正確長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，使用DNA純化回收試劑盒，按說明書步驟回收DNA。后續(xù)可進(jìn)行下一步操作或儲(chǔ)存于-20℃冰箱中。

表1 擴(kuò)增目的DNA片段的PCR反應(yīng)體系(50μL)

1.2.4 報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建 利用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ對(duì)上述PCR產(chǎn)物及載體質(zhì)粒pGL3-Enhancer進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)條件為37℃，酶切1 h；而后轉(zhuǎn)為65℃，維持10 min滅活限制性內(nèi)切酶。酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收目的片段，以除去酶切下的小碎片?；厥盏腄NA片段測(cè)濃度后儲(chǔ)存于-20℃冰箱中待用。

使用T4 DNA Ligase試劑盒，并按說明書步驟將所得到的目的片段和已行酶切的載體進(jìn)行連接，目的片段與已酶切載體的物質(zhì)的量比例為3∶1。連接體系為10×T4 Buffer 2μL，T4 DNA Ligase 0.2μL，目的片段及已酶切載體，最后加無菌水定容至20μL。

1.2.5 報(bào)告基因質(zhì)粒序列的鑒定 連接反應(yīng)完成后取上述連接產(chǎn)物5μL加入50μL感受態(tài)菌液(E.coliCompetent Cells DH5α)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后挑取單克隆菌落，進(jìn)行質(zhì)粒小提提取相應(yīng)的質(zhì)粒，并行雙酶切反應(yīng)和直接測(cè)序法鑒定正確構(gòu)建的質(zhì)粒。選取序列正確的質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒大提，再次行雙酶切反應(yīng)以進(jìn)一步確定質(zhì)粒，確定后將擴(kuò)增獲取的質(zhì)粒存儲(chǔ)于-20℃待用。

直接測(cè)序法由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。所構(gòu)建成功的質(zhì)粒根據(jù)插入序列的不同，分別命名為pGL3-STAT5A-pro-luc-E及pGL3-STAT5Apro-N-luc-E。

圖2 目的質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

1.2.6 報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)選用空載體pGL3-enhance質(zhì)粒作為陰性對(duì)照組，選用能表達(dá)螢火蟲熒光素酶pGL3-Control作為陽性對(duì)照，重組載體pGL3-STAT5A-pro-luc-E及pGL3-STAT5A-pro-Nluc-E作為實(shí)驗(yàn)組，而表達(dá)海腎熒光素酶的pRL-SV40質(zhì)粒作為內(nèi)參，將上述兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，以檢測(cè)兩種熒光素酶的活性。

將MCF7細(xì)胞接種于24孔板中，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下培養(yǎng)，增殖至60%左右時(shí)，應(yīng)用Lipofectamine 3000試劑盒轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒，48 h后按照熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)方法處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過LB9507系統(tǒng)測(cè)定熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。重組載體STAT5A-pro-luc-E/pGL3-STAT5A-pro-N-luc-E與空載體pGL3-Enhancer熒光素酶相對(duì)活性的差異分析采用Student'st檢驗(yàn)。所有P值采用雙側(cè)檢測(cè)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STAT5A啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建成功

通過DNA擴(kuò)增、酶切、連接、篩選等步驟，獲得到pGL3-STAT5A-pro-luc-E及pGL3-STAT5A-pro-Nluc-E兩個(gè)質(zhì)粒。雙酶切反應(yīng)結(jié)果顯示插入目的序列片斷長(zhǎng)度正確，分別為2 101 bp及287 bp(圖2)。進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果顯示，克隆的STAT5A啟動(dòng)子序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中信息完全一致，提示插入片段序列正確，質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 STAT5A啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒具有啟動(dòng)子活性

在MCF7細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pGL3-Enhancer和pRLSV40作為陰性對(duì)照組，重組載體pGL3-STAT5A-proluc-E/pGL3-STAT5A-pro-N-luc-E和pRL-SV40共轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞后，兩者的熒光素酶的相對(duì)活性分別約為陰性對(duì)照pGL3-Enhancer的8倍和6倍(P＜0.01)，而陽性對(duì)照pGL3-Control的熒光素酶活性約為陰性對(duì)照pGL3-Enhancer的199倍(P＜0.01)(圖3)，提示pGL3-STAT5A-pro-luc-E、pGL3-STAT5A-pro-N-luc-E報(bào)告基因質(zhì)粒能表達(dá)螢火蟲熒光素酶，反映構(gòu)建的STAT5A啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄活性。

圖3 STAT 5A報(bào)告基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性

3 討論

癌癥是全球的公共健康問題，癌癥的發(fā)病率和死亡率都在逐年增加，也是醫(yī)學(xué)的一個(gè)難題。2015年中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在中國(guó)乳腺癌占所有女性癌癥的15%，其死亡率也在不斷升高[11]。乳腺癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)是造成患者死亡的重要原因，腫瘤轉(zhuǎn)移是多個(gè)基因共同參與調(diào)控的復(fù)雜過程。因此，闡明乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，可為乳腺癌患者的個(gè)體化治療提供潛在的有效靶點(diǎn)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)預(yù)防乳腺癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，提高乳腺癌患者生存率的目的。而轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的一個(gè)重要組成，目前雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)是研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要實(shí)驗(yàn)方法，通過對(duì)啟動(dòng)子序列的研究，探討其轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合靶點(diǎn)，進(jìn)而在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄作用。

本研究在分析轉(zhuǎn)錄因子STAT5A啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上，利用PCR方法擴(kuò)增STAT5A啟動(dòng)子序列，并成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子STAT5A啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-STAT5A-pro-luc-E及pGL3-STAT5A-pro-Nluc-E。該系統(tǒng)不僅提供了反應(yīng)STAT5A啟動(dòng)子活性的報(bào)告系統(tǒng)，同時(shí)特異性的以致癌因子Notch信號(hào)通路為研究對(duì)象，構(gòu)建Notch特異性結(jié)合的STAT5A啟動(dòng)子活性的報(bào)告系統(tǒng)，為深入研究Notch信號(hào)通路的功能奠定了基礎(chǔ)，并為以Notch為治療靶點(diǎn)的小分子藥物的篩選提供了高通量篩選平臺(tái)。

而在乳腺癌細(xì)胞MCF7中轉(zhuǎn)染了報(bào)告基因質(zhì)粒后對(duì)比陰性對(duì)照，兩種STAT5A啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒表達(dá)的熒光素酶活性均升高數(shù)倍，提示該質(zhì)粒在STAT5A啟動(dòng)子調(diào)控下可以表達(dá)熒光素酶蛋白，具有轉(zhuǎn)錄活性，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定了良好基礎(chǔ)和技術(shù)平臺(tái)。本項(xiàng)目在雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)過程中，以pGL3-Enhancer載體表達(dá)的螢火蟲熒光素酶活性為檢測(cè)指標(biāo)，而pRL-SV40質(zhì)粒表達(dá)海腎熒光素酶活性為內(nèi)參指標(biāo)，為樣品的加樣進(jìn)行了有效的監(jiān)控[12]。

綜上所述，本研究利用分子克隆的技術(shù)，以pGL3-Enhancer質(zhì)粒為載體，成功構(gòu)建了可以反映STAT5A啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的pGL3-STAT5A-pro-luc-E熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，以及具有Notch特異性潛在結(jié)合的pGL3-STAT5A-pro-N-luc-E熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，為STAT5A轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究提供了有效的鑒定平臺(tái)，也為Notch信號(hào)通路的研究提供了篩選手段。