松油烯-4-醇對熒光假單胞菌抑菌能力及作用機理

耿一鳴，李婷婷*，勵建榮,*，謝 晶，林 洪，王 轟，申照華，郭曉華，勞敏軍，周小敏，于建洋

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600；3.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；4.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100；5.蓬萊京魯漁業(yè)有限公司，山東 煙臺 265600；6.山東美佳集團有限公司，山東 日照 276800；7.浙江興業(yè)集團有限公司，浙江 舟山 316120；8.泰祥集團榮城泰祥食品股份有限公司，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部冷凍調(diào)理海洋食品加工重點實驗室，山東 威海 264309）

微生物是導(dǎo)致食品腐敗的主要因素。微生物在生長的過程中，會分解破壞食品中的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等營養(yǎng)成分，并產(chǎn)生對人體有害的物質(zhì)[1]。嗜冷菌是一類菌的總稱，其具有獨特的嗜冷機制，能在極寒的條件下生存繁殖。熒光假單胞菌為假單胞菌屬嗜冷革蘭氏陰性菌，是最常見的嗜冷菌之一[2-3]。在冷藏及有氧的條件下，熒光假單胞菌會產(chǎn)生蛋白酶、脂酶等，破壞食品中的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致食品腐敗[4]。熒光假單胞菌是水產(chǎn)品、蔬菜、肉制品、乳制品的優(yōu)勢腐敗菌[5-6]。

目前，化學(xué)防腐劑已廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，其可以高效地防止食品被污染，進而延長其保質(zhì)期。然而，長期使用化學(xué)防腐劑會增加細菌的抗藥性，導(dǎo)致一些潛在的副作用[7]。天然防腐劑具有無毒無害、抗菌能力強、抗菌譜廣、能夠提升風(fēng)味等特點，因此，尋找替代化學(xué)防腐劑的天然防腐劑現(xiàn)已成為近年來研究熱點[8]。

精油是一類從具有芳香味植物原料中提取的芳香油性液體，由于其具有廣譜抗菌性，被認(rèn)為是天然安全的防腐劑和抗菌劑[9]。茶樹精油是從互葉白千層的枝葉中提取出來的一種具有薄荷醇氣味的無色至淡黃色液體，具有良好的殺菌、殺蟲、防腐等特性，在香料、食品工業(yè)、化妝品中廣為應(yīng)用[10-14]。松油烯-4-醇又名4-松油烯醇、4-松油醇、萜品烯，是茶樹精油的主要有效成分之一，也是多數(shù)植物精油所含的單萜類成分，具有抗炎、抗腫瘤等作用，含有胡椒香、陳腐木材的香氣，是用于配制香辛類香精的食品用香料[15-16]。近年來，消費者愈來愈重視食品的品質(zhì)，在運輸及貯藏過程中，使用天然防腐劑取代人工合成的化學(xué)防腐劑已成重點研究方向。前人對松油烯-4-醇的研究多集中于抗腫瘤抗疾病，對抑菌活性及機理報道尚少[17]。基于此，本實驗通過測定最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）并繪制抑菌生長曲線，評價松油烯-4-醇對食品中常見的致腐菌-熒光假單胞菌的抑菌能力；并通過測定電導(dǎo)率評價了其對細胞膜通透性的影響；同時，利用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、二乙酸熒光素（di-O-acetylfluorescein，F(xiàn)DA）染色實驗評價了其對細胞膜完整性的影響；此外，測定胞外總蛋白含量、DNA含量、胞內(nèi)ATP酶活性、堿性磷酸酶活性，以進一步闡明其抑菌機理。旨在為松油烯-4-醇在食品保鮮領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）由遼寧省渤海大學(xué)食品安全重點實驗室保藏，于28 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)。

松油烯-4-醇（純度98%） 上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；LB肉湯培養(yǎng)基、LB營養(yǎng)瓊脂 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；卡那霉素 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉 天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司；鋅片上海邁砷化工有限公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒DNA Maker、瓊脂糖 上海生工生物工程股份有限公司；50×TAE緩沖液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 北京索萊寶生物科技有限公司；超微量ATP酶（Na+、K+）測試盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）測試盒、總蛋白定量測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇景集團蘇州安泰技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；MS105UD電子分析天平、FE30電導(dǎo)率儀 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；PE Victor X3多功能酶標(biāo)儀美國PerkinElmer公司；Biofuge Stratos冷凍高速離心機、Sorvall Legend Micro21R臺式微量離心機 美國Thermo Fisher公司；SS-4800場發(fā)射SEM、F7000熒光分光光度計、E-1045鍍金儀 日本日立公司；GelDoc XR+全自動凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；SCIENTZ-IID超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 松油烯-4-醇對熒光假單胞菌MIC的確定及抑菌曲線繪制

參考Yang等[18]的方法略作修改，測定松油烯-4-醇的最小抑菌劑量（minimum inhibitory concentration，MIC）。吸取75 μL培養(yǎng)至對數(shù)生長期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌菌液于96 孔細胞培養(yǎng)板中。再將溶于無菌去離子水的松油烯-4-醇加入到上述孔中，使松油烯-4-醇的終劑量分別為4、2、1、0.5、0.25 μL/mL。以75 μL質(zhì)量濃度為50 μg/mL的卡那霉素為陽性對照，以等體積的無菌去離子水為陰性對照。將96 孔細胞培養(yǎng)板放置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，使用酶標(biāo)儀測定OD595nm。將測定的結(jié)果進行比較，選擇與陽性對照無明顯差異的濃度作為松油烯-4-醇對熒光假單胞菌的MIC，每個樣品進行3 次平行實驗。

吸取200 μL培養(yǎng)至對數(shù)生長期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌菌液于10 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，加入松油烯-4-醇使其終劑量分別為1、2、4 MIC，以無菌去離子水作為空白對照。在28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h用酶標(biāo)儀測定OD595nm。

1.3.2 堿性磷酸酶活力的測定

參考舒慧珍等[19]的方法并略作修改。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌菌液于4 ℃下8 000 r/min離心10 min，棄上清，菌體重懸于無菌PBS（pH 7.0）中，重復(fù)離心洗滌3 次，最終重懸于等體積PBS中。加入松油烯-4-醇使其終劑量分別為1、2、4 MIC，并以無菌去離子水作空白對照，于搖床中培養(yǎng)4 h。離心棄上清液收集沉淀菌體，加入PBS重懸，用超聲破碎儀在300 W冰水浴中破碎菌體，每次超聲時間為5 s，間隔10 s，重復(fù)4 次。采用堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒測定細胞內(nèi)的堿性磷酸酶活力。

1.3.3 熒光假單胞菌胞內(nèi)電導(dǎo)率的測定

取培養(yǎng)至對數(shù)生長期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌液，于8 000 r/min離心10 min，吸出上清液，留菌體，用PBS重懸菌體后，以8 000 r/min離心10 min，重復(fù)兩次，最終重懸于PBS。加入溶于無菌去離子水的松油烯-4-醇，使其終劑量分別為1、2 MIC，以無菌去離子水作空白對照。于搖床中培養(yǎng)12 h，每2 h取樣測其電導(dǎo)率。

1.3.4 熒光假單胞菌細胞膜通透性的測定

根據(jù)舒慧珍等[8]的FDA染色方法并略作修改。取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的熒光假單胞菌菌液（107CFU/mL），離心去上清液并用PBS重懸菌體，加入松油烯-4-醇使其終劑量為1、2、4 MIC，以無菌去離子水作空白對照，于搖床培養(yǎng)。分別取培養(yǎng)2、5、8 h的菌懸液6 mL于8 000 r/min離心10 min，吸出上清液，所得到的菌體用PBS重懸3 次，離心后吸出上清液，加入250 μL溶于丙酮的FDA（2 mg/mL），在常溫下靜置20 min，PBS重懸洗滌3 次，離心棄上清液重懸于6 mL的PBS。使用熒光分光光度計測定平均熒光強度。熒光分光光度計激發(fā)波長297 nm，發(fā)射波長527 nm，激發(fā)狹縫與發(fā)射狹縫5 nm。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察松油烯-4-醇處理后熒光假單胞菌形態(tài)

取培養(yǎng)至對數(shù)生長期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌菌液，加入終劑量為1/2、1、2、4 MIC的松油烯-4-醇，以無菌去離子水做空白對照，于搖床中培養(yǎng)6 h。將培養(yǎng)好的菌液放置于離心管中以8 000 r/min離心10 min，吸出上清液，所得到的菌體用PBS重懸洗滌3 次后，每次再以8 000 r/min離心10 min。加入體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛，將5 mm×5 mm×1 mm無菌鋅片放入固定3 h，最后依次用30%、50%、70%、100%的無水乙醇溶液對硅片梯度洗脫，每次30 min。鋅片表面噴金后用掃描電鏡觀察表面熒光假單胞菌細胞的形態(tài)。

1.3.6 熒光假單胞菌細胞內(nèi)DNA含量的測定

將熒光假單胞菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期（107CFU/mL），離心吸出上清液，重懸于PBS中，重復(fù)離心重懸洗滌3 次。加入松油烯-4-醇，使其終劑量為0.5、1、2、3、4 MIC，并以無菌去離子水作空白對照，于28 ℃搖床培養(yǎng)3 h。采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取熒光假單胞菌的基因組DNA，進行DNA瓊脂糖凝膠電泳。電壓為90 V，電流為110 mA，電泳時長為30 min，電泳完成后，將凝膠放置于全自動凝膠成像裝置，拍照并分析結(jié)果。

1.3.7 熒光假單胞菌細胞內(nèi)總蛋白質(zhì)量濃度的測定

將熒光假單胞菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期（107CFU/mL），棄上清液留下層菌體，加入0.85%無菌生理鹽水重復(fù)離心重懸洗滌兩次，再加入松油烯-4-醇使其終劑量為1、2 MIC，以無菌去離子水作空白對照，于搖床中培養(yǎng)。分別取0、3、6、9、12 h的菌懸液離心去上清液留菌體，加入生理鹽水，用超聲破碎儀在300 W冰水浴中破碎菌體，每次超聲時間為5 s，間隔10 s，重復(fù)4 次并于4 ℃保存。采用總蛋白定量測定試劑盒得到各組樣品的蛋白質(zhì)量濃度，根據(jù)結(jié)果分析松油烯-4-醇對熒光假單胞菌細胞內(nèi)總蛋白質(zhì)量濃度的影響。

1.3.8 熒光假單胞菌細胞內(nèi)超微量Na+、K+-ATP酶活力的測定

取培養(yǎng)至對數(shù)生長期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌菌液，棄上清液并于菌體中加入生理鹽水，重懸兩次后置于生理鹽水中，加入終劑量為1、2 MIC的松油烯-4-醇，以無菌去離子水作空白對照，與搖床中培養(yǎng)。取0、3、6、9、12 h菌懸液離心加入生理鹽水重懸3 次，用超聲破碎儀破碎細胞。采用超微量Na+、K+-ATP酶試劑盒測定熒光假單胞菌細胞內(nèi)Na+、K+-ATP酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析，運用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 松油烯-4-醇的MIC及其對熒光假單胞菌時間抑菌曲線

如圖1所知，不同終劑量的松油烯-4-醇對熒光假單胞菌均有抑制作用，終劑量為0.25、0.5、1 μL/mL的松油烯-4-醇對熒光假單胞菌具有輕微的抑制生長作用。在培養(yǎng)至對數(shù)生長期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌中加入終劑量為2 μL/mL的松油烯-4-醇培養(yǎng)12 h后，其菌液密度低于等體積終質(zhì)量濃度為50 μg/mL卡那霉素的陽性對照，表明松油烯-4-醇對熒光假單胞菌的MIC為2 μL/mL。與Kang Shimo等[20]研究的抑菌劑乳糖醛酸相比，松油烯-4-醇對熒光假單胞菌具有較好的抑菌效果。

圖1 不同劑量的松油烯-4-醇對熒光假單胞菌抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of terpinene-4-ol at different concentrations on Pseudomonas fluorescens

由圖2可知，加入1、2、4 MIC的松油烯-4-醇在培養(yǎng)2 h后對熒光假單胞菌的生長產(chǎn)生了明顯的抑制作用，與空白對照相比差異較大。隨著培養(yǎng)時間的延長，松油烯-4-醇對熒光假單胞菌的抑菌能力沒有變化，表明松油烯-4-醇有較強的抑菌能力，并具有良好的抑菌穩(wěn)定性。

圖2 不同劑量的松油烯-4-醇對熒光假單胞菌的時間抑菌曲線Fig.2 Time-inhibition curves of terpinene-4-ol at different concentrations on Pseudomonas fluorescens

2.2 松油烯-4-醇對熒光假單胞菌細胞壁的影響

AKP是一種大量存在于微生物中的磷酸水解酶，其在磷酸鹽的代謝中起著無可替代的作用[21]。AKP存在于細胞壁與細胞膜之間，當(dāng)細胞壁或細胞膜的完整性遭到損傷，AKP便會泄露到菌液中，使菌體內(nèi)AKP活力降低。本實驗通過測定松油烯-4-醇對AKP活力的影響，以反映其對熒光假單胞菌細胞壁的損傷情況。如圖3所示，經(jīng)4 h松油烯-4-醇培養(yǎng)后，空白對照組AKP活力明顯增加；1、2、4 MIC處理組AKP活力下降明顯。結(jié)果表明，0～4 h培養(yǎng)后的空白對照組菌體生長，使其胞內(nèi)AKP活力增加；處理組AKP活力隨松油烯-4-醇劑量的增加及培養(yǎng)時間的延長而降低，表明松油烯-4-醇能有效地破壞熒光假單胞菌的細胞壁并且可能改變細胞膜的通透性，使胞內(nèi)AKP活性降低。這與柏梅[22]研究發(fā)現(xiàn)山蒼子精油能夠破壞金黃色葡萄球菌菌體的細胞壁及細胞膜，使胞內(nèi)AKP活力被抑制的實驗結(jié)果相同。

圖3 松油烯-4-醇對AKP活力的影響Fig.3 Effect of terpinene-4-ol on AKP activity

2.3 松油烯-4-醇對熒光假單胞菌內(nèi)電導(dǎo)率的影響

當(dāng)抑菌劑作用于菌體后，會使菌體細胞膜的通透性增加，導(dǎo)致胞內(nèi)的鉀離子、鈣離子、氫離子等小離子從膜內(nèi)外泄，這些離子會平衡細胞的能量狀態(tài)，使菌體進行正常運動，還具有代謝控制、溶質(zhì)轉(zhuǎn)運等作用[23]；因此，測定電導(dǎo)率以表征松油烯-4-醇對熒光假單胞菌細胞膜的滲透性變化。如圖4所示，在加入松油烯-4-醇后0～6 h，1 MIC與2 MIC處理的熒光假單胞菌電導(dǎo)率迅速增加，明顯高于空白對照組，且2 MIC樣品的電導(dǎo)率大于1 MIC。表明隨著松油烯-4-醇的劑量增加，其電導(dǎo)率增大，松油烯-4-醇破壞了熒光假單胞菌的細胞通透性，進而導(dǎo)致細胞內(nèi)離子外滲；6～12 h，兩種劑量的松油烯-4-醇處理組增長都趨于平緩，表明松油烯-4-醇能有效改變熒光假單胞菌細胞膜的通透性，使膜內(nèi)外電導(dǎo)率增加。此結(jié)果與測定AKP活力得到的結(jié)果都表明松油烯-4-醇能破壞熒光假單胞菌的細胞壁且改變細胞膜的通透性。Zhang Yunbin等[24]研究了肉桂精油對大腸桿菌的抗菌機制，也發(fā)現(xiàn)加入肉桂精油會使菌液電導(dǎo)率升高，對細胞膜通透性造成影響，與本實驗結(jié)果相同。

圖4 不同劑量的松油烯-4-醇對熒光假單胞菌電導(dǎo)率的影響Fig.4 Effect of terpinene-4-ol at different concentrations on the electrical conductivity of Pseudomonas fluorescens

2.4 松油烯-4-醇對熒光假單胞菌細胞膜通透性的影響

FDA是一種本身不發(fā)熒光且不帶電荷的物質(zhì)，因其是脂質(zhì)性小分子，更易透過細胞膜進入細胞，在胞內(nèi)被非特異性脂酶催化，F(xiàn)DA會產(chǎn)生黃綠色的熒光素。當(dāng)細胞膜完整，F(xiàn)DA會在激發(fā)和發(fā)射波長分別為488 nm和530 nm處被檢測出；當(dāng)細胞膜遭到破壞，F(xiàn)DA很快流出細胞，不能被檢測到。通過測定FDA熒光強度的大小，可反映出細胞膜的通透性與完整性[25]。如圖5所示，經(jīng)松油烯-4-醇對熒光假單胞菌處理2 h后，1、2、4 MIC處理組與空白對照組測定的熒光強度差異不大，表明經(jīng)松油烯-4-醇處理的熒光假單胞菌的細胞膜完整性較好，僅細胞膜通透性有所降低；經(jīng)松油烯-4-醇處理5 h和8 h，1、2、4 MIC處理組熒光強度隨劑量增加及時間的延長而降低，表明從培養(yǎng)5 h起，松油烯-4-醇能大幅增強熒光假單胞菌細胞膜的通透性，并可能對細胞膜產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致FDA外滲，熒光強度降低。隨著松油烯-4-醇劑量的增加及培養(yǎng)時間的延長，對熒光假單胞菌的損傷程度也越大。

圖5 松油烯-4-醇對熒光假單胞菌FDA熒光強度的影響Fig.5 Effect of terpinene-4-ol on fluorescence intensity of Pseudomonas fluorescens cells stained with FDA

2.5 松油烯-4-醇對熒光假單胞菌超微結(jié)構(gòu)的影響

SEM可以更直觀、更清晰地觀察到松油烯-4-醇對熒光假單胞菌菌體損傷情況。圖6A是正常的熒光假單胞菌（為空白對照組），其菌體飽滿、完整、且表面光滑的短桿狀形態(tài)；經(jīng)1 MIC與2 MIC的松油烯-4-醇處理后（圖6B、C），菌體表面變得粗糙，細胞膜均有破裂，2 MIC處理組菌體皺縮塌陷，與1 MIC處理組相比，其細胞膜破壞程度更為嚴(yán)重；圖6D為4 MIC松油烯-4-醇處理組，其菌體破碎、部分菌體被溶解、細胞膜幾乎完全破裂。上述結(jié)果表明1、2、4 MIC的松油烯-4-醇處理組能對熒光假單胞菌細胞壁和細胞膜產(chǎn)生不可逆的損壞，且破壞程度隨著松油烯-4-醇劑量增大而增強，細胞壁及細胞膜的破壞導(dǎo)致細胞內(nèi)容物外泄，菌體干癟并產(chǎn)生皺縮，從而抑制熒光假單胞菌的生長。植物精油類抗菌物質(zhì)，因其疏水性更易作用于細胞膜，使細胞膜破損，并增強了細胞膜的通透性[26]。此結(jié)果與抑菌曲線結(jié)論一致，松油烯-4-醇能夠抑制熒光假單胞菌的生長。Zhao Yi等[27]用SEM觀察發(fā)現(xiàn)沒食子酸能改變金黃色葡萄球菌的疏水性，對細胞膜造成破壞，導(dǎo)致細胞內(nèi)成分泄露，與本研究結(jié)果相同。

圖6 不同劑量松油烯-4-醇處理對熒光假單胞菌的SEM圖Fig.6 SEM images of Pseudomonas fluorescens treated with different concentrations of terpinene-4-ol

2.6 松油烯-4-醇對熒光假單胞菌DNA含量的影響

DNA中含有合成RNA和蛋白質(zhì)所必需的遺傳信息，是生物發(fā)育和正常運轉(zhuǎn)所不可或缺的大分子物質(zhì)。DNA含量的減少和損傷導(dǎo)致基因無法正常表達，使胞內(nèi)的酶與受體合成受阻，最終導(dǎo)致其衰亡[28]。瓊脂糖凝膠阻滯電泳中的DNA條帶亮度與DNA分子大小成正比，條帶亮度能夠反映DNA含量。如圖7可知，經(jīng)3 h的松油烯-4-醇培養(yǎng)后，空白對照組的DNA條帶明亮清晰，0.5、1、2、3 MIC處理組的DNA條帶亮度依次隨著松油烯-4-醇的劑量增大而降低，4 MIC處理組檢測不出熒光假單胞菌的DNA。以上結(jié)果表明松油烯-4-醇能破壞熒光假單胞菌的細胞膜，使胞內(nèi)DNA泄露，且隨著松油烯-4-醇的劑量增大，對熒光假單胞菌細胞膜的破壞也越強，胞內(nèi)剩余的DNA含量越少。此結(jié)果與上文中SEM、電導(dǎo)率、FDA實驗結(jié)果相印證，松油烯-4-醇能夠有效破壞熒光假單胞菌細胞膜，不僅導(dǎo)致小分子外泄，大分子的DNA也會隨之泄露出來。Shen Suxia等[28]研究發(fā)現(xiàn)肉桂醛對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑菌作用時菌體細胞壁和細胞膜破裂，內(nèi)部空化，核酸大分子物質(zhì)外滲。

圖7 松油烯-4-醇對熒光假單胞菌DNA的影響Fig.7 Effect of terpinen-4-ol on DNA of Pseudomonas fluorescens

2.7 松油烯-4-醇對熒光假單胞菌總蛋白質(zhì)量濃度的影響

蛋白質(zhì)是生命物質(zhì)的基礎(chǔ)，是構(gòu)成細胞最重要的成分，具有維持細胞內(nèi)滲透壓、酸堿度、運輸代謝物等重要作用，蛋白質(zhì)的降低會直接影響細胞的活力[29]。由圖8可知，空白對照組中隨著培養(yǎng)時間的延長，熒光假單胞菌代謝繁殖，其胞內(nèi)蛋白質(zhì)量呈現(xiàn)上升趨勢；經(jīng)1 MIC和2 MIC松油烯-4-醇處理0～3 h的菌體，胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度迅速降低，此時松油烯-4-醇對菌體細胞膜破壞嚴(yán)重，蛋白質(zhì)大量外滲；3～12 h兩處理組的蛋白質(zhì)量濃度均緩慢下降，可能是0～3 h松油烯-4-醇對細胞膜破壞較嚴(yán)重，蛋白質(zhì)已較多泄露所致。測定結(jié)果表明松油烯-4-醇能大幅度且迅速破壞熒光假單胞菌的細胞膜，使其通透性增強，導(dǎo)致大分子蛋白質(zhì)泄露，并且隨著松油烯-4-醇的劑量增加，對細胞內(nèi)蛋白的含量影響越大，此結(jié)果與SEM、核酸電泳結(jié)果相印證。松油烯-4-醇也可能會破壞細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，從而影響細胞的生長與代謝。Yin Lizi等[29]研究了肉桂醛對嗜水氣單胞菌的抑菌機制，表明肉桂醛可以降低細胞中的蛋白含量，干擾細胞代謝，影響了細胞膜的通透性。

圖8 松油烯-4-醇對熒光假單胞菌總蛋白質(zhì)量濃度的影響Fig.8 Effect of terpinen-4-ol on total protein concentration of Pseudomonas fluorescens

2.8 松油烯-4-醇對熒光假單胞菌細胞內(nèi)Na+、K+-ATP酶活力的影響

Na+、K+-ATP酶是一種處于細胞質(zhì)膜磷脂雙分子層中的蛋白酶，能催化ATP水解為細胞直接提供能量，在物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)膜電位及傳遞信息方面具有重要作用，細胞膜的損傷和重要離子的泄露會對細胞膜相關(guān)的能量轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)生影響[30]。如圖9所示，空白對照組0～6 h因熒光假單胞菌的增殖，胞內(nèi)Na+、K+-ATP酶活力增強；1、2 MIC處理組在0～6 h培養(yǎng)后，Na+、K+-ATP酶活力與空白對照組相比明顯降低，且2 MIC松油烯-4-醇對熒光假單胞菌Na+、K+-ATP酶抑制能力更為出色。對測定結(jié)果分析可知，松油烯-4-醇可能對熒光假單胞菌細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)有明顯抑制作用，從而阻礙了胞內(nèi)酶的合成，Na+、K+-ATP酶也遭到破壞導(dǎo)致胞內(nèi)ATP不能正常供給能量，最終細胞凋亡。此結(jié)果與松油烯-4-醇對胞內(nèi)總蛋白、電導(dǎo)率、核酸電泳的影響結(jié)果相印證，表明松油烯-4-醇能有效破壞熒光假單胞菌細胞膜的完整性，增加離子的通透性及細胞內(nèi)Na+、K+-ATP酶的外滲。Sharma等[31]研究表明大蒜精油會顯著降低蠟狀芽孢桿菌胞內(nèi)ATP的釋放。

圖9 松油烯-4-醇對熒光假單胞菌Na＋ 、K＋-ATP酶活力的影響Fig.9 Effect of terpinen-4-ol on Na+, K+-ATPase activity in Pseudomonas fluorescens

3 結(jié) 論

天然植物精油類物質(zhì)具有安全無毒、抗菌光譜性強、原料來源廣泛等特點，作為食品防腐劑日益受到眾多學(xué)者們的關(guān)注[32]。松油烯-4-醇是茶樹精油的主要有效成分之一，也是多種天然植物精油所含的單萜類成分，具有抗腫瘤、抗炎等作用，但對其抑菌能力報道尚少。

本研究從細胞機制方面探討了松油烯-4-醇對熒光假單胞菌的抑制作用。本實驗首先確定了松油烯-4-醇對熒光假單胞菌具有良好的抑菌效果，且明確其MIC為2 μL/mL；由時間抑菌曲線進一步看出松油烯-4-醇可較為迅速地抑制熒光假單胞菌的生長；AKP活性實驗表明加入松油烯-4-醇能有效破壞菌體細胞壁，使細胞膜暴露出來；電導(dǎo)率測定結(jié)果證明松油烯-4-醇可以改變細胞膜的通透性，使胞內(nèi)離子外泄；胞內(nèi)熒光強度測定結(jié)果證實松油烯-4-醇能大幅增強細胞膜的通透性，并可能對細胞膜產(chǎn)生破壞作用；SEM觀察到松油烯-4-醇對細胞膜造成了不可逆的損傷，大分子的DNA與蛋白質(zhì)會從細胞內(nèi)泄露，胞內(nèi)的Na+、K+-ATP酶含量也會降低，導(dǎo)致ATP無法正常提供細胞能量，直接造成細胞凋亡。