石磊泰 綜述，李玉華，俞永新 審校

中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629

巴斯德所用的病毒是1882年自牛腦分離的一株狂犬病病毒（rabies virus，RV），經(jīng)馴化后潛伏期變短、毒力減弱，該株病毒被命名為Paris Pasteur［3］。Paris Pasteur株經(jīng)后人不同的傳代適應(yīng)演化出幾個(gè)分支［4］，本文僅對(duì)其中一個(gè)分支PV（Pasteur virus）株在人用狂犬病疫苗中的應(yīng)用及研究回顧作一綜述。

1 來(lái)源和歷史

1882年，巴斯德自牛腦分離到1株RV，并將其在家兔腦內(nèi)連續(xù)傳90代。該病毒傳至50代時(shí)的潛伏期已由原來(lái)的15 d縮短為固定的7 d，且毒力也減弱，稱為固定毒。將感染后7 d發(fā)病的兔脊髓取出，在室溫空氣中干燥后，發(fā)現(xiàn)病毒的毒力很快降低，一般干燥15 d后可完全減毒。巴斯德用干燥減毒的脊髓懸液給狗進(jìn)行皮下免疫，由開(kāi)始注射無(wú)毒的病毒懸液至逐步注射有毒的材料，結(jié)果50多頭經(jīng)免疫的狗均能抵抗腦內(nèi)注射RV的感染［2］。

1882年巴斯德分離到的固定毒一直在兔腦內(nèi)連續(xù)傳代，后續(xù)不同的傳代方式出現(xiàn)了幾個(gè)不同的分支，其中PV株出現(xiàn)在大眾視野是在1965年。PV株是1965年從阿根廷的布宜諾斯艾利斯泛美人畜共患病中心獲得的，源于最初的巴斯德病毒，PV株返回法國(guó)巴斯德研究所后又進(jìn)行了兔腦內(nèi)系列傳代，命名為PV-11，PV-11又在胎牛腎細(xì)胞傳33代適應(yīng)，后定名為PV株［4］。但PV株從1882—1965年間如何從法國(guó)到了南美洲的阿根廷以及中間的傳代歷史已無(wú)史料可循［4］，但2021年GOMES［5］公開(kāi)的一篇報(bào)道能提供巴斯德病毒從歐洲到南美洲的一點(diǎn)線索：文中提到，1888年，巴西帝國(guó)的皇帝佩德羅二世支持巴斯德在南美洲的巴西里約熱內(nèi)盧開(kāi)設(shè)巴斯德研究所，最初該研究所只致力于狂犬病疫苗的研發(fā)。此后，巴西的科研人員將RV接種至兔腦內(nèi)，再將發(fā)病的兔子從法國(guó)的巴斯德研究所帶到巴西的巴斯德研究所。這是有文獻(xiàn)可查的巴斯德病毒從法國(guó)運(yùn)到巴西，但后來(lái)如何到阿根廷再無(wú)文獻(xiàn)可佐證。

雖然PV株的傳代歷史中有部分時(shí)期模糊不清，但WHO狂犬病專家委員會(huì)在1972年仍達(dá)成了共識(shí)：自巴斯德時(shí)代的RV傳代歷史可能已無(wú)從考證，但如果近幾年的傳代歷史清楚，也可用于狂犬病疫苗生產(chǎn)［6］。會(huì)上PV株還被納入WHO病毒種子目錄清單［7］。2005年，PV株被WHO生物標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會(huì)納入人用狂犬病疫苗生產(chǎn)用毒種庫(kù)［8］。

2 傳代適應(yīng)

2.1 在胎牛腎細(xì)胞上適應(yīng) 法國(guó)巴斯德研究所的ATANASIU等［9］在1974年的工作報(bào)道中提到，用PV株在胎牛腎細(xì)胞上適應(yīng)并制備了人用狂犬病疫苗，經(jīng)濃縮、純化和滅活后，在法國(guó)和少數(shù)幾個(gè)國(guó)家使用了10多年。

2.2 在BHK21細(xì)胞上適應(yīng) 較早關(guān)于PV株在BHK21細(xì)胞上適應(yīng)傳代的工作報(bào)道是法國(guó)巴斯德研究所的ERMINE等［10］在1977年開(kāi)展的。

1988年，巴西布坦坦研究所的CONSALES等［11］在摸索RV在細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的最佳培養(yǎng)條件時(shí)，使用的就是PV株在BHK21細(xì)胞的適應(yīng)株，該適應(yīng)株為法國(guó)巴斯德研究所的Sureau教授所贈(zèng)。最終，CONSALES等確定用細(xì)胞瓶在BHK21細(xì)胞上培養(yǎng)PV株的最佳培養(yǎng)條件為：感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為0.1～1，感染方式為吸附2 h，病毒最佳培養(yǎng)溫度為33℃，最佳pH為7.4～7.6。感染后4、7、10 d收獲的病毒滴度分別為5.38、5和4.23 lgLD50／0.03 mL。

1998年，同樣是巴西布坦坦研究所，GALLINA等［12］為了提高RV的培養(yǎng)規(guī)模和產(chǎn)量，采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)病毒。將總量為6.8×108的BHK21細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含7.5 g cytodex1微載體的5 L生物反應(yīng)器內(nèi)，36.5℃吸附3 h后，補(bǔ)加L15培養(yǎng)基至3.7 L（牛血清含量8%），繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d后，棄去80%的培養(yǎng)基，以0.1～0.8 MOI接種PV株病毒（來(lái)源于法國(guó)巴斯德研究所），34℃吸附2 h，補(bǔ)加L15培養(yǎng)基至3.7 L（牛血清含量0.3%）。接種病毒后72、96、144、168、240 h，病毒滴度分別為6.98、7.28、6.69、6.18、6.09 lgLD50／mL，一個(gè)培養(yǎng)周期可收獲14 000～14 500 mL病毒液。這種培養(yǎng)方式可實(shí)現(xiàn)較大規(guī)模生產(chǎn)RV，能滿足當(dāng)時(shí)工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

高校的開(kāi)放性管理使校園安全隱患增加了很多社會(huì)因素，尤其是復(fù)雜的周邊環(huán)境，很多周邊消費(fèi)場(chǎng)所安全性差，誘導(dǎo)性消費(fèi)因素較多，加之學(xué)生在校外受到的約束較少，很可能出現(xiàn)惡劣事件。與此同時(shí)，校園周邊社會(huì)人士較多，進(jìn)出校園不受限制，很可能威脅到學(xué)生的人身和財(cái)產(chǎn)安全；并且很多高校交通不夠便利，很難確保乘坐周邊出租車的安全；這些社會(huì)人員又存在流動(dòng)性，給管制工作帶來(lái)了難度。

2.3 在Vero細(xì)胞上適應(yīng)1983年，PV株在法國(guó)巴斯德研究所完成兔腦內(nèi)傳代2 061次后，又在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳14代進(jìn)行適應(yīng)，適應(yīng)株命名為L(zhǎng) Pasteur 2061／Vero 15 pass，簡(jiǎn)稱PV2061［1］。

2001年，巴西布坦坦研究所的FRAZZATIGALLINA等［13］在生物反應(yīng)器內(nèi)用Vero細(xì)胞成功培養(yǎng)RV PV株。所用的Vero細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American Type Culture Collection，ATCC），PV株來(lái)源于法國(guó)巴斯德研究所。Vero細(xì)胞培養(yǎng)至1.6×106個(gè)／mL時(shí)轉(zhuǎn)移至5 L生物反應(yīng)器，工作體積為3.7 L，內(nèi)含10 g cytodex3微載體，細(xì)胞培養(yǎng)階段用含1%牛血清的培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)3～4 d后按MOI 0.015加入PV株，培養(yǎng)病毒階段用無(wú)血清培養(yǎng)基，感染病毒3 d后開(kāi)始收獲病毒液，連續(xù)收獲4 d，共收獲12 L病毒液，在未濃縮的情況下病毒滴度可達(dá)5.4～5.66 lgFFD50／mL。

2002年6月，遼寧成大生物股份有限公司（簡(jiǎn)稱遼寧成大）從國(guó)外引進(jìn)微載體生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，在大容量生物反應(yīng)器內(nèi)用Vero細(xì)胞成功培養(yǎng)制備RV PV2061株疫苗，商品名為“Speeda”［14-15］。Vero細(xì)胞來(lái)源于ATCC，PV2061株來(lái)源于美國(guó)CDC。Vero細(xì)胞連續(xù)傳代，密度達(dá)（1.0～1.2）×106個(gè)／mL時(shí)轉(zhuǎn)移至含25 g／L微載體的30 L生物反應(yīng)器內(nèi)，灌流培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，密度達(dá)（1.2～1.5）×107個(gè)／mL時(shí)接種PV株，更換含1%小牛血清的維持液，將反應(yīng)器溫度調(diào)至33～35℃繼續(xù)灌流培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后開(kāi)始收獲病毒液，可連續(xù)收獲18～22 d。收獲液最高病毒滴度可達(dá)8.5lgLD50／mL，平均滴度為7.6lgLD50／mL。

在印度，有兩家機(jī)構(gòu)開(kāi)展了PV株在Vero細(xì)胞上適應(yīng)的研究工作。其中印度的巴斯德研究所使用的毒株是PV-11，KUMAR等［16］在2005年的工作報(bào)道中使用PV-11株在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)狂犬病疫苗，開(kāi)展柱層析和區(qū)帶離心純化等工藝驗(yàn)證的比較研究；另一家機(jī)構(gòu)是印度的人用生物制品研究所（Human Biologicals Institute），使用的毒株是PV2061，SAMPATH等［17］2005年報(bào)道，在印度用PV2061在Vero細(xì)胞上制備出人用狂犬病疫苗，商品名為“Abhayrab”。

3 基因特性

早在1986—1988年，法國(guó)巴斯德研究所的TORDO等［18-20］即對(duì)PV株進(jìn)行了測(cè)序，所用毒株為PV株在BHK21細(xì)胞的適應(yīng)株。測(cè)得PV株的基因全長(zhǎng)為11 932個(gè)核苷酸，GenBank登錄號(hào)為M13215［21］。PV株由3'至5'端依次排列N、M1、M2、G、L5個(gè)結(jié)構(gòu)基因，每個(gè)基因由3'至5'端的非編碼區(qū)及編碼區(qū)構(gòu)成。其中在N基因的3'端之前有一段先導(dǎo)序列長(zhǎng)58個(gè)核苷酸，N基因的位置為59～1 482 bp，編碼區(qū)為71～1 423 bp，編碼450個(gè)氨基酸；M1基因的位置為1 485～2 475 bp，編碼區(qū)為1 514～2 407 bp，編碼297個(gè)氨基酸；M2基因的位置為2 481～3 285 bp，編碼區(qū)為2 496～3 104 bp，編碼202個(gè)氨基酸；G基因的位置為3 291～4 964 bp，編碼區(qū)為3 318～4 892 bp，編碼524個(gè)氨基酸；L基因的位置為5 388～11 863 bp，編碼區(qū)為5 418～11 846 bp，編碼2 142個(gè)氨基酸。N～M1、M1～M2、M2～G、G～L基因間隔分別為2、5、5和423個(gè)核苷酸。其中M1基因即為大家熟知的P基因，M2基因即為M基因。

2015年，江蘇先聲衛(wèi)科生物制藥有限公司的科研人員開(kāi)展了對(duì)PV2061株的測(cè)序工作［22］，與TORDO等的工作不同的是該P(yáng)V2061株來(lái)源于美國(guó)CDC，為Vero細(xì)胞適應(yīng)株，所測(cè)PV2061株的基因全長(zhǎng)為11 932個(gè)核苷酸，GenBank登錄號(hào)為JX276550［23］。與TORDO等所測(cè)的PV株相比，兩個(gè)PV株的全長(zhǎng)基因同源性為99.8%，兩株病毒的基因位置和編碼區(qū)位置均相同。

4 免疫保護(hù)

4.1 暴露前免疫保護(hù)2005年，印度的SAMPATH等［17］用Abhayrab肌肉注射60名健康志愿者，免疫程序?yàn)?、7、21 d各免疫1次，每次0.5 mL，注射部位為三角肌。免疫后14、35、365 d采血檢測(cè)中和抗體，14、35、365 d的GMT分別為12.69、18.19和12.26 IU／mL，且接種不良反應(yīng)輕微。

2010年，菲律賓的MAGPANTAY等［24］對(duì)從印度引進(jìn)的Abhayrab進(jìn)行安全性和免疫原性研究，與SAMPATH等不同之處在于MAGPANTAY等采用皮內(nèi)注射的方式進(jìn)行免疫，免疫程序?yàn)?、7、28 d各免疫1次，每次0.1 mL，注射部位為三角肌區(qū)域。免后14、28 d采血檢測(cè)中和抗體，第14和28天后，60名受試者的GMT分別為3.30和4.37 IU／mL。期間僅觀察到少數(shù)輕度不良事件，無(wú)中度或重度事件發(fā)生。由 此，SAMPATH等 和MAGPANTAY等 認(rèn) 為，Abhayrab具有較好的免疫原性和安全性。

2006年，國(guó)內(nèi)的查力等［25］報(bào)告了遼寧成大Speeda狂犬病疫苗的安全性和免疫原性，實(shí)驗(yàn)組502人用Speeda免疫，對(duì)照組100人用法國(guó)維爾博疫苗免疫，免疫程序均為0、3、7、14、28 d各免疫1針，觀察不良反應(yīng)和免疫效果。首劑免疫后14 d，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率均為100%，GMT分別為5.2和5.6 IU／mL；第45天，實(shí)驗(yàn)組GMT為9.5 IU／mL，對(duì)照組GMT為9.8 IU／mL。所有接種對(duì)象均未出現(xiàn)局部和全身強(qiáng)不良反應(yīng)。與法國(guó)的維爾博疫苗相比，查力等認(rèn)為Speeda疫苗具有良好的安全性和免疫原性。

2007年，巴西的COSTA等［26］報(bào)道了用Vero細(xì)胞生產(chǎn)的PV株人用狂犬病疫苗的免疫原性和安全性。該疫苗由巴西布坦坦研究所用無(wú)血清培養(yǎng)基生產(chǎn)［27］，該項(xiàng)研究從2002年開(kāi)始?xì)v時(shí)4年完成，296名志愿者分為兩組：實(shí)驗(yàn)組192人接種該疫苗，對(duì)照組104人接種賽諾菲巴斯德公司生產(chǎn)的Vero細(xì)胞疫苗。免疫程序?yàn)?、3、7、14和28 d肌肉注射各免疫1次。免后第0、14、38、90天采血檢測(cè)RV中和抗體，結(jié)果顯示，第14、38和90天，兩組的GMT均遠(yuǎn)高于0.5 IU／mL，且實(shí)驗(yàn)組GMT高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。最常見(jiàn)的不良反應(yīng)為注射部位疼痛，且實(shí)驗(yàn)組發(fā)生次數(shù)比對(duì)照組多（P＜0.001），但所有不良反應(yīng)均有良好轉(zhuǎn)歸，未見(jiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生。COSTA等認(rèn)為，該疫苗安全性和免疫原性良好。

4.2 暴露后免疫保護(hù)2005年，印度的SAMPATH等［17］關(guān)于Abhayrab的研究中涉及了暴露后免疫評(píng)價(jià)。按WHO關(guān)于狂犬病診療方案，Ⅱ級(jí)暴露受試者75人，Ⅲ級(jí)暴露67人，兩組受試者免疫程序相同，均為0、3、7、14、30、90 d各免疫1次，每次0.5 mL，注射部位為三角肌，兩組受試者均不使用狂犬病免疫球蛋白。免后14、35、90和365 d采血檢測(cè)中和抗體，Ⅱ級(jí)暴露組4 d的GMT分別為13.53、15.03、7.04、4.15 IU／mL，Ⅲ級(jí)暴露組4 d的GMT分別為15.78、8.04、9.47、7.82 IU／mL。觀察期內(nèi)受試者的不良反應(yīng)分級(jí)為輕微到小，在2年的隨訪期內(nèi)，這兩組受試者無(wú)死于狂犬病的病例報(bào)告。

2017年，有研究對(duì)暴露后受試者采用兩種接種程序：“2-1-1”程序和五針?lè)?，接種遼寧成大Speeda狂犬病疫苗以比較兩種免疫程序的安全性和免疫持久性［28］。接種疫苗前采集暴露后受試者血清樣本，接種疫苗后第7、14、42、180、365天分別采集暴露后受試者血清樣本。在整個(gè)研究中記錄每次接種疫苗后7 d內(nèi)出現(xiàn)的征集不良反應(yīng)和非征集不良事件，結(jié)果顯示，研究期間無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)報(bào)告。雖然“2-1-1”程序在首次接種的不良反應(yīng)發(fā)生率略高于五針?lè)ǖ?和第2次注射，但隨后針次的不良反應(yīng)發(fā)生率在兩種程序中基本相似。在第42天，兩種免疫程序的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率均為100%，抗體滴度均超過(guò)0.5 IU／mL。在第180和365天，兩組受試者的抗體血清濃度急劇下降，但仍有部分人具有保護(hù)性抗體（分別為75%和50%）。1年后，無(wú)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)的瘋?cè)聜茉囌甙l(fā)病，他們?cè)诘?4和42天陽(yáng)轉(zhuǎn)率均為100%。Speeda狂犬病疫苗對(duì)暴露后受試者無(wú)論按“2-1-1”程序或五針?lè)A(yù)防接種后，均有較好的安全性、免疫原性和免疫持久性。

2019年，國(guó)內(nèi)有機(jī)構(gòu)評(píng)價(jià)暴露后使用遼寧成大Speeda“2-1-1”程序肌肉接種狂犬病疫苗的免疫持久性及2劑加強(qiáng)（入組當(dāng)天和第3天各加強(qiáng)免疫1次）免疫效果［29］。選擇曾暴露后按“2-1-1”程序全程接種Speeda狂犬病疫苗后1、2和3年的研究對(duì)象314人，進(jìn)行2針加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫前、后14 d分別采血檢測(cè)IgG抗體，分析使用“2-1-1”程序后1、2、3年及經(jīng)2劑加強(qiáng)免疫后的抗體幾何平均濃度（geometric mean concentration，GMC）和抗體陽(yáng)性率。結(jié)果暴露后的303人按“2-1-1”程序接種Speeda狂犬病疫苗后1、2和3年的抗體GMC分別為1.33、1.04和0.72 IU／mL，抗體陽(yáng)性率分別為77.78%、66.67%和55.56%。暴露后的282人經(jīng)2劑加強(qiáng)免疫后，1、2和3年組的抗體GMC分別為16.83、19.37和21.05 IU／mL，加強(qiáng)免疫后抗體GMC均高于加強(qiáng)免疫前（t分別為16.54、13.85和16.02，P均＜0.001）；抗體陽(yáng)性率分別為100.00%、99.00%和100.00%。狂犬病暴露后使用“2-1-1”程序接種Speeda狂犬病疫苗具有良好的免疫持久性，3年內(nèi)2劑次加強(qiáng)免疫后具有較好的免疫應(yīng)答。

5 結(jié)語(yǔ)

狂犬病是一種傳統(tǒng)的人獸共患病，除南極洲外，所有大陸均有發(fā)生，分布在150多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。全球范圍內(nèi)，每年約有2 900多萬(wàn)人需接受狂犬病暴露后處置和疫苗接種，由狂犬病造成的經(jīng)濟(jì)損失估計(jì)為每年86億美元［30］。

但狂犬病是可防可控的，接種疫苗是人類預(yù)防狂犬病最有效的策略。PV株自面世以來(lái)，在法國(guó)本土［9］、塞爾維亞［31］、伊朗［32］、突尼斯［33］、巴西［26］、印度［17］和中國(guó)［14-15］等國(guó)家用來(lái)生產(chǎn)人用狂犬病疫苗以防控狂犬病疫情，其中遼寧成大Speeda人用狂犬病疫苗年產(chǎn)能可達(dá)1 000萬(wàn)人份，除在國(guó)內(nèi)使用，還出口到泰國(guó)、菲律賓和埃及等一帶一路國(guó)家［34］。由此可認(rèn)為，PV株在狂犬病防控方面發(fā)揮了一定的作用。但目前狂犬病疫情仍不容樂(lè)觀，與WHO 2030年實(shí)現(xiàn)狂犬病清零目標(biāo)仍有一定差距［35］，為了實(shí)現(xiàn)消除狂犬病，需要團(tuán)結(jié)協(xié)作、共同努力。