陽(yáng)文龍，李錫香，張曉輝，宋江萍，賈會(huì)霞，王海平

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所，北京 100081)

蘿卜(RaphanussativusL.) 是我國(guó)最重要的蔬菜之一。我國(guó)常年蘿卜種植面積約120 萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量超過(guò)4 000萬(wàn)t[1]，可以生食、炒食、煮食、腌漬、制干等，在蔬菜周年供應(yīng)中占有很重要的地位。但是在生產(chǎn)上普遍存在冬春栽培和高寒地區(qū)夏季栽培出現(xiàn)先期抽薹開(kāi)花現(xiàn)象，從而影響蘿卜的產(chǎn)量和品質(zhì)。赤霉素(Gibberellin，GA)途徑是植物六大開(kāi)花調(diào)控途徑之一，對(duì)植物的生殖生長(zhǎng)起著重要作用[2]。許多研究表明，赤霉素的生物合成與代謝是多種酶參與的多步驟酶促反應(yīng)過(guò)程，通過(guò)這些酶的編碼基因的表達(dá)精確調(diào)節(jié)赤霉素合成與代謝速率[3-5]。高等植物中赤霉素是由古巴焦磷酸合成酶 (ent-Copalyldiphosphate synthase，CPS)、內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶 (ent-Kaurene synthase，KS)、內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶 (ent-Kaurene oxidase，KO)、內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶 (ent-Kaurenoic acid oxidise，KAO)、GA 20-氧化酶 (GA 20-oxidase，GA20OX)、GA 3-氧化酶 (GA 3-oxidase，GA3OX)等參與合成的[6]。其中，GA20OX和 GA3OX受活性GA的負(fù)反饋調(diào)節(jié)[7-8]。GA 2-氧化酶 (GA 2-oxidase，GA2OX)是 GA降解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，它可以使植物體內(nèi)具有生物活性的 GAs及其前體和其他中間產(chǎn)物分解失活，進(jìn)而保持植物體內(nèi)具有生物活性的 GAs和中間體之間的平衡[9]。GA20OX和 GA3OX缺失，合成有生物活性 GA的量減少，同樣，過(guò)表達(dá)GA2OX則降解了植物體內(nèi)生物活性的 GA，導(dǎo)致矮化表型[10-11]。到目前為止，CPS、KS、KO、KAO、GA20OX、GA3OX和GA2OX 等基因已在多個(gè)物種中報(bào)道，如擬南芥[12-13]、水稻[4，14]等。植物體內(nèi)GA信號(hào)傳導(dǎo)途徑一般認(rèn)為是基于GA-GID1-DELLA復(fù)合體的形式[15-16]。作為GA的受體，GID1可以與GA結(jié)合后引起構(gòu)象改變，從而與DELLA蛋白發(fā)生互作形成GA-GID1-DELLA復(fù)合體。該復(fù)合體易被E3泛素連接酶SCF復(fù)合體F-box亞基識(shí)別，引導(dǎo)DELLA蛋白被26S蛋白酶體水解，從而解除DELLA蛋白對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用[15-17]。DELLA蛋白是植物特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GRAS家族的一個(gè)亞族，定位于細(xì)胞核內(nèi)[18-19]，是植物細(xì)胞內(nèi)GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子[20-23]。在擬南芥中，基因組共編碼5種不同功能的DELLA蛋白(GAI、RGA、RGL1、RGL2、RGL3)對(duì)植物生長(zhǎng)的不同生物過(guò)程起作用，而它們均對(duì)GA應(yīng)答起抑制作用[21，24-28]。GA受體基因GID1編碼一個(gè)水溶性蛋白，與激素敏感脂酶 (Hormone sensitive lipase)家族具有同源性[29]。活性GA與GID1蛋白結(jié)合后，引起GID1構(gòu)象發(fā)生改變，GA-GID1復(fù)合體上表面便可以與DELLA蛋白的TVHYNP基序結(jié)合，形成GA-GID1-DELLA復(fù)合體[30-33]。在缺乏GA的情況下，DELLA蛋白得到富集并抑制GA應(yīng)答及相關(guān)生物過(guò)程。F-box蛋白是E3泛素連接酶SCF(SKP1、CULLIN、F-box)蛋白復(fù)合體的一個(gè)亞基，能夠催化泛素鏈與靶蛋白結(jié)合，并通過(guò)泛素/26S蛋白酶體途徑降解靶蛋白[34]。酵母雙雜交結(jié)果表明，GA-GID1-DELLA復(fù)合體可以誘導(dǎo)DELLA蛋白的GRAS域發(fā)生構(gòu)象變化，促進(jìn)F-box蛋白SLY1/GID2與DELLA的VHIID和LHRII基序相互識(shí)別[35]。接著SCFSLY1/GID2復(fù)合體便促進(jìn)泛素化，引導(dǎo)DELLA蛋白被26S蛋白酶體水解[36-37]，DELLA蛋白對(duì)植物相關(guān)生物過(guò)程的抑制作用被解除，即GA通過(guò)調(diào)控蛋白酶體水解DELLA蛋白來(lái)調(diào)控植物的株高和生長(zhǎng)發(fā)育。目前，赤霉素代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因在擬南芥和水稻等植物中得到了廣泛深入的研究，但是在蘿卜上還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。

本研究對(duì)蘿卜赤霉素生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因CPS、KS、KO、KAO、GA20OX、GA3OX、GA2OX、GAI、 RGA、RGL、GID1、SKP2等進(jìn)行了鑒定，并檢測(cè)其在蘿卜不同組織器官和發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)特性，以期發(fā)掘調(diào)控蘿卜抽薹開(kāi)花的關(guān)鍵基因，為深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

試驗(yàn)于 2019年8月至2020年5月在北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街(116°20′E，39°56′N(xiāo))中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所農(nóng)場(chǎng)塑料大棚和溫室進(jìn)行，8月15日播種，10月30日移栽到溫室。供試材料為北京心里美蘿卜和野蘿卜，株行距 0.4 m × 0.5 m。選取生長(zhǎng)勢(shì)較為一致的植株，在盛花期分別采集莖、葉、蕾、花、果，用錫箔紙包裹，迅速用液氮冷凍，-80 ℃保存，用于 RNA提取，檢測(cè)基因表達(dá)量。

1.2 蘿卜赤霉素相關(guān)基因的鑒定與表達(dá)分析

1.2.1 蘿卜赤霉素相關(guān)基因的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 從蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(http：//radish-genome.org/)下載基因組DNA、cDNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)。根據(jù)文獻(xiàn)[12-13]獲得擬南芥赤霉素相關(guān)基因的登錄號(hào)，并從 TAIR網(wǎng)站(http：//www.arabidopsis.org/)下載擬南芥赤霉素相關(guān)基因的蛋白序列，用擬南芥中赤霉素相關(guān)基因的蛋白質(zhì)序列在TBtools軟件中通過(guò)Blast Several Sequences to a Big Database搜索蘿卜蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得候選蛋白質(zhì)序列，利用Pfam和 NCBI 2個(gè)在線網(wǎng)站驗(yàn)證這些候選蛋白質(zhì)，最后通過(guò)基因注釋最終確定了46個(gè)蘿卜赤霉素相關(guān)基因，包含CPS 2個(gè)，KS 1個(gè)，KO 2個(gè)，KAO 2個(gè)，GA20OX 9個(gè)，GA3OX 5個(gè)，GA2OX 12個(gè)，GAI，RGA各1個(gè)，RGL 4個(gè)，GID1 3個(gè)，SKP2 4個(gè)。

1.2.2 染色體位置及理化性質(zhì)分析 從蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(http：//radish-genome.org/)下載基因定位和基因注釋信息，獲得候選赤霉素相關(guān)基因的染色體位置，利用ExPASy(http：//web.expasy.org/protparam/)在線軟件分析候選赤霉素相關(guān)基因的理化性質(zhì)。

1.2.3 結(jié)構(gòu)分析及保守結(jié)構(gòu)域分析 從蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(http：//radish-genome.org/)下載蘿卜赤霉素相關(guān)基因的內(nèi)含子和外顯子分布數(shù)據(jù)的 gff3文件，利用TBtools軟件繪制基因結(jié)構(gòu)示意圖。利用 MEME在線軟件(http：//meme-suite.org/)進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析，將保守結(jié)構(gòu)域最大基序數(shù)量設(shè)置為 10個(gè)，其余設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)。

1.2.4 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析 用上述下載得到的擬南芥赤霉素相關(guān)基因的蛋白序列，以及蘿卜赤霉素相關(guān)基因的候選蛋白序列，用 MEGA 7.0軟件對(duì)擬南芥和蘿卜的赤霉素相關(guān)蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)， 選擇參數(shù)“ Poisson model” 、 “ Complete deletion” 、Bootstrap= 1 000次進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 啟動(dòng)子順式作用元件分析及不同組織中的基因表達(dá)分析 用TBtools 軟件從蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取赤霉素相關(guān)基因的啟動(dòng)子序列(基因編碼區(qū)上游1 500 bp)，利用PlantCARE在線軟件對(duì)各基因的啟動(dòng)子元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。從數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//radish-genome.org/)下載蘿卜不同發(fā)育時(shí)期和不同器官的赤霉素相關(guān)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，利用 TBtools軟件作基因表達(dá)熱圖。

1.2.6 早開(kāi)花和晚開(kāi)花蘿卜材料赤霉素相關(guān)基因的表達(dá)分析 利用TRIzol(天根公司)法按試劑說(shuō)明書(shū)提取早開(kāi)花材料心里美蘿卜和晚開(kāi)花材料野蘿卜的莖、葉、蕾、花、果等器官的RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根公司)合成第一鏈cDNA，以該cDNA為模板，利用表1 中的引物對(duì)蘿卜赤霉素相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)，采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 試劑盒(TaKaRa)。PCR 反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 模板 2 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，ddH2O 6.6 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 10 min；然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。每份樣品3次生物學(xué)重復(fù)，2次技術(shù)重復(fù)。以RsGAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，用2-ΔΔCt公式計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用 Microsoft Excel 2007(美國(guó)，微軟公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 蘿卜赤霉素相關(guān)基因的定量PCR引物Tab.1 Quantitative PCR primers for gibberellin related genes in radish

表1(續(xù))

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜赤霉素相關(guān)基因的鑒定和理化性質(zhì)分析

以擬南芥CPS、KS、KO、KAO、GA20OX、GA3OX、GA2OX、GAI、RGA、RGL、GID1、SKP2基因編碼的蛋白序列作為種子，利用TBtools軟件的Blast Several Sequences to a Big Database工具，設(shè)置 E值< 10-20，比對(duì)蘿卜蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)，并去除冗余序列后獲得 46個(gè)候選赤霉素相關(guān)基因(按功能分為12類)，CPS、KS、KO、KAO、GA20OX、GA3OX、GA2OX、GAI、RGA、RGL、GID1、SKP2分別有2，1，2，2，9，5，12，1，1，4，3，4個(gè)。按照它們的染色體定位信息依次命名RsCPS1、RsCPS2、RsKS、RsKO1、RsKO2、RsKAO1、RsKAO2、RsGA20OX1～RsGA20OX9、RsGA3OX1～RsGA3OX5、RsGA2OX1～RsGA2OX12、RsGAI、RsRGA、RsRGL1～RsRGL4、RsGID1-1～RsGID1-3、RsSKP2-1～RsSKP2-4(表 2)。其中有 1個(gè)CPS基因(Rs527850)、1個(gè)KO基因(Rs574920)和1個(gè)RGL基因(Rs541920)未定位到染色體上，分別被命名為RsCPS2、RsKO2和RsRGL4。由表2 和圖1 可知，這12類基因不均勻分布于9條染色體上，2號(hào)染色體上分布最多，有8個(gè)基因；其次是4和9號(hào)染色體，各有7個(gè)基因；3，6和 7號(hào)染色體上分布的基因最少，分別是2，3，3個(gè)。

通過(guò)ExPaSy軟件分析發(fā)現(xiàn)，蘿卜CPS、KS、KO、KAO、GA20OX、GA3OX、GA2OX、GAI、RGA、RGL、GID1、SKP2基因 CDS編碼序列為555(GA2OX8)～3 393(RsKS)bp，編碼184 ～ 1 130個(gè)氨基酸。這46個(gè)蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)的分子質(zhì)量為21.32 ～ 127.80 ku，等電點(diǎn)為4.72 ～ 9.04，大部分蛋白屬于酸性，堿性蛋白僅有9個(gè)(GA2OX、GA3OX、KAO、SKP2分別有5，2，1，1個(gè))。此外，46個(gè)蛋白質(zhì)的親水性值為0.067～-0.495，除SKP2-1、SKP2-3、SKP2-4外，均為親水性蛋白；而且46個(gè)蛋白質(zhì)中有37個(gè)蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)大于40，其中GA20OX、GA2OX和KAO蛋白分別有2，6，1個(gè)蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)小于40。

表2 蘿卜赤霉素相關(guān)基因的理化性質(zhì)Tab.2 Physicochemical properties of gibberellin related genes in radish

表2(續(xù))

圖1 蘿卜赤霉素相關(guān)基因在染色體上的分布Fig.1 Distribution of gibberellin related genes on radish chromosomes

2.2 蘿卜赤霉素相關(guān)基因的基因結(jié)構(gòu)分析

對(duì)蘿卜赤霉素相關(guān)基因進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析(圖 2)，發(fā)現(xiàn)這 46個(gè)赤霉素相關(guān)基因的外顯子數(shù)為1～21個(gè)不等，其中RsGAI、RsRGL2、RsRGL3和RsRGL4僅有 1個(gè)外顯子，沒(méi)有內(nèi)含子，而RsKS、RsCPS1、RsCPS2的外顯子最多，分別具有21，16，15個(gè)外顯子。同類酶的編碼基因其基因結(jié)構(gòu)相似，如9個(gè)RsGA20OX基因均含有 3個(gè)外顯子，5個(gè)RsGA3OX基因都含有 2個(gè)外顯子，12個(gè)RsGA2OX基因的7個(gè)含有 3個(gè)外顯子，5個(gè)含有2個(gè)外顯子，RsGID1-1～RsGID1-3均含有2個(gè)外顯子，而RsSKP2-1～RsSKP2-4均含有4個(gè)外顯子，而且外顯子長(zhǎng)度也比較相似。從基因長(zhǎng)度上來(lái)看，RsCPS1、RsCPS2和RsKS最長(zhǎng)，將近8 kb，其他基因的長(zhǎng)度大多在3 kb 以內(nèi)。

圖2 蘿卜赤霉素相關(guān)基因的基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Gene structure of gibberellin related genes in radish

2.3 蘿卜赤霉素相關(guān)基因編碼蛋白質(zhì)的保守基序分析

根據(jù)蘿卜赤霉素相關(guān)基因的基因結(jié)構(gòu)將這46個(gè)基因分為赤霉素合成上游基因(CPS、KS、KO、KAO)、赤霉素合成下游基因(GA20OX、GA3OX、GA2OX)和赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因(GAI、RGA、RGL、GID1、SKP2)。用 MEME分別對(duì)這3類基因編碼的蛋白序列進(jìn)行保守基序分析，設(shè)置參數(shù)為 10個(gè)保守基序(圖 3)，分別命名為基序 Motif 1～Motif 10(表 3)。在赤霉素合成上游基因中，Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 5是全部基因所共有的，Motif 4和Motif 9為CPS 所特有。在赤霉素合成下游基因中，Motif 4是全部基因所共有的，Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 5、Motif 6、Motif 7為大多數(shù)基因所共有，Motif 9為RsGA20OX1～RsGA20OX7所特有，而Motif 10則是RsGA2OX1、RsGA2OX2、RsGA2OX3、RsGA2OX5、RsGA2OX9、RsGA2OX10所特有。此外，RsGA2OX4、RsGA2OX6、RsGA2OX7、RsGA2OX11具有種類和分布相同的 Motif 1、Motif 2、Motif 4、Motif 5、Motif 7 5個(gè)保守基序。在赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因中，Motif 8是全部基因所共有的，Motif 1、Motif 3是除GID1基因外所共有的，Motif 2、Motif 4、Motif 9、Motif 10為RsGAI、RGA、RGL所特有，而Motif 5、Motif 6、Motif 7是RsSKP2特有的保守基序。

表3 蘿卜赤霉素相關(guān)基因的10個(gè)保守基序Tab.3 Ten conserved motifs of gibberellin related genes in radish

2.4 蘿卜赤霉素相關(guān)基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

利用擬南芥(At)和蘿卜(Rs)的 CPS、KS、KO、KAO、GA20OX、GA3OX、GA2OX、GAI、RGA、RGL、GID1、SKP2蛋白構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖 4)。從圖4可以看出，蘿卜和擬南芥的赤霉素相關(guān)基因有很相似的進(jìn)化關(guān)系，它們的12類基因都幾乎一一對(duì)應(yīng)，只是蘿卜的赤霉素相關(guān)基因成員數(shù)量比擬南芥(共31個(gè))的相對(duì)多一些，如擬南芥中CPS和KO分別只有1個(gè)基因，而在蘿卜中分別有2個(gè)；擬南芥中GA20OX、GA3OX和 GA2OX分別有6(含有1個(gè)假基因)，4，8(含有1個(gè)假基因)個(gè)基因，而在蘿卜中則分別有9，5，12個(gè)；擬南芥中SKP2只有2個(gè)，而蘿卜中有4個(gè)。這可能是因?yàn)樘}卜在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了3次復(fù)制事件，導(dǎo)致基因組增大較多，基因數(shù)也大大增加，從而能更好地適應(yīng)環(huán)境。

2.5 蘿卜赤霉素相關(guān)基因啟動(dòng)子分析

為了進(jìn)一步探究蘿卜赤霉素相關(guān)基因的功能，利用PlantCARE軟件對(duì)這些基因上游的啟動(dòng)子元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)(表 4)。從表中可以看出，在這12類基因中，與光信號(hào)相關(guān)的順式作用元件最多，而且每一個(gè)基因都具有4～ 16個(gè)不等；其次是與厭氧脅迫和ABA相關(guān)的順式作用元件比較多，分別有37，31個(gè)基因含有；與赤霉素、生長(zhǎng)素、茉莉酸甲酯、水楊酸、玉米素等激素相關(guān)的作用元件分別有22，17，25，15，

圖3 蘿卜赤霉素相關(guān)基因編碼蛋白的保守基序Fig.3 Conserved motifs of proteins encoded by gibberellin related genes in radish

12個(gè)基因含有；與干旱、低溫、抗性等相關(guān)的順式作用元件分別有16，14，18個(gè)基因含有；14個(gè)基因的啟動(dòng)子上含有 1～2個(gè)與分生組織相關(guān)的作用元件。雖然46個(gè)基因都與赤霉素代謝或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，但是只有22 個(gè)基因的啟動(dòng)子上含有與赤霉素相關(guān)的作用元件，部分基因還同時(shí)具有與多種激素或逆境脅迫等相關(guān)的作用元件，推測(cè)這些基因可能在多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中起作用，其功能需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

2.6 蘿卜赤霉素相關(guān)基因在不同組織器官中的表達(dá)

為了解赤霉素相關(guān)基因在蘿卜不同發(fā)育時(shí)期和不同組織器官中的表達(dá)情況，從蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了大根白蘿卜 46個(gè)赤霉素相關(guān)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，并作圖分析(圖 5)。從圖5可以看出，46個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量為0～7，不同基因在不同組織器官或不同發(fā)育時(shí)期的葉和根中的表達(dá)量存在較大差異。表達(dá)量最高的是RsGAI，在所有組織器官和不同發(fā)育時(shí)期的葉和根中都是高表達(dá)；其次是RsGA2OX2、RsRGL2、RsRGL3、RsRGL4、RsGID1-1、RsGID1-3在不同組織器官和不同發(fā)育時(shí)期的葉和根中有較高水平的表達(dá)；RsKO1、RsKO2、RsKAO2、RsGA20OX1、RsGA3OX1、RsGA2OX3等基因有相對(duì)較低水平的表達(dá)；而RsGA20OX4、RsGA20OX5、RsGA20OX8、RsGA20OX9、RsGA2OX10、RsRGA、RsRGL1、RsSKP2-1等8 個(gè)基因幾乎檢測(cè)不到表達(dá)。說(shuō)明這46個(gè)赤霉素相關(guān)基因具有不同的時(shí)空表達(dá)特異性。

AT.擬南芥；Rs.蘿卜。AT.Arabidopsis thaliana; Rs.Raphanus sativus.

表4 蘿卜赤霉素相關(guān)基因啟動(dòng)子順式作用元件Tab.4 Promoter cis-elements of gibberellin related genes in radish

表4(續(xù))

進(jìn)一步用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)早開(kāi)花的心里美蘿卜和晚開(kāi)花野蘿卜中赤霉素相關(guān)基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，RsCPS1、RsKS、RsKO1、RsGA20OX1、RsGID1-1等基因在葉中有較高水平的表達(dá)，而RsGA3OX1、RsGA3OX2、RsGAI、RsRGA幾乎檢測(cè)不到表達(dá)；RsGA20OX2、RsGA20OX3、RsGA3OX3、RsGID1-2在心里美蘿卜葉中的表達(dá)水平明顯高于野蘿卜，而RsKS、RsKO1、RsGA20OX1、RsGA20OX4、RsGID1-1在野蘿卜葉中的表達(dá)水平明顯高于心里美蘿卜(圖6-A)。RsKS、RsGA20OX1、RsGA3OX1、RsGID1-1在心里美蘿卜花薹中表達(dá)水平較高，而RsKO1在野蘿卜花薹中表達(dá)水平較高，其他基因在心里美蘿卜和野蘿卜花薹中的表達(dá)水平都很低(圖6-B)。RsKO1、RsGA20OX2、RsGA20OX3、RsGAI在心里美蘿卜花蕾中有較高水平的表達(dá)，RsGA20OX4、RsGA3OX1、RsGID1-1在心里美蘿卜角果中有高水平的表達(dá)，其他基因表達(dá)量都很低(圖6-C)。說(shuō)明赤霉素相關(guān)基因在心里美蘿卜和野蘿卜中的表達(dá)有明顯差異，并具有各自的時(shí)空特異性。另外還檢測(cè)了開(kāi)花相關(guān)基因RsFLC、RsFRI、RsFT的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)開(kāi)花抑制基因RsFLC在晚開(kāi)花的野蘿卜葉和花薹中有高水平的表達(dá)，但在早開(kāi)花的心里美蘿卜花薹、花和角果中的表達(dá)量很低(圖6-D)，而開(kāi)花促進(jìn)基因RsFT只在心里美蘿卜花蕾和花中有高水平的表達(dá)，在野蘿卜的葉和花薹中檢測(cè)不到表達(dá)(圖6-E)，說(shuō)明蘿卜開(kāi)花早晚和RsFLC基因關(guān)系很密切，赤霉素相關(guān)基因跟蘿卜開(kāi)花早晚的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

圖5 蘿卜赤霉素相關(guān)基因在蘿卜不同組織器官和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of gibberellin related genes in different tissues and organs and different developmental stages of radish

3 結(jié)論與討論

赤霉素作為經(jīng)典五大類植物激素之一，是一種高效能的廣譜植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，參與調(diào)控植物的眾多生理過(guò)程。本研究通過(guò)對(duì)蘿卜赤霉素相關(guān)基因CPS、KS、KO、KAO、GA20OX、GA3OX、GA2OX、GAI、RGA、RGL、GID1、SKP2的鑒定與分析，從大根白蘿卜基因組中鑒定出 46個(gè)赤霉素相關(guān)基因，相比同為十字花科植物的擬南芥赤霉素相關(guān)基因(31個(gè))數(shù)量多15個(gè)，這可能與蘿卜在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了基因組三倍化事件有關(guān)[38-39]。蘿卜這46個(gè)赤霉素相關(guān)基因不均勻分布于 9條染色體上，每條染色體上含有2～8個(gè)基因，其中2號(hào)染色體中分布最多，有8個(gè)基因；3號(hào)染色體上分布的基因最少，只有2個(gè)。對(duì)基因結(jié)構(gòu)和保守基序的分析發(fā)現(xiàn)基因進(jìn)化關(guān)系相近的基因結(jié)構(gòu)相似，蘿卜的保守基序在赤霉素合成上游基因中，Motif 4和Motif 9是RsCPS 所特有的；在赤霉素合成下游基因中，Motif 9是RsGA20OX1～RsGA20OX7所特有的，而Motif 10則是RsGA2OX1、RsGA2OX2、RsGA2OX3、RsGA2OX5、RsGA2OX9、RsGA2OX10所特有的；在赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因中， Motif 1、Motif 3是RsGID1基因所特有的，Motif 2、Motif 4、Motif 9、Motif 10是RsGAI、RsRGA、RsRGL所特有的，而Motif 5、Motif 6、Motif 7是RsSKP2特有的保守基序。在擬南芥和水稻等物種中也有相似的有關(guān)保守基序的報(bào)道[3，12]。

啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果顯示，在CPS、KS、KO、KAO、GA20OX、GA3OX、GA2OX、GAI、RGA、RGL、GID1、SKP2 這12 類46 個(gè)基因中，每一個(gè)基因都具有與光信號(hào)相關(guān)的順式作用元件，還有部分基因含有與赤霉素、ABA、生長(zhǎng)素、茉莉酸甲酯、水楊酸、玉米素等激素相關(guān)的作用元件，以及與厭氧脅迫、干旱、低溫、抗性等相關(guān)的順式作用元件，此外有14個(gè)基因的啟動(dòng)子上含有與分生組織相關(guān)的作用元件，說(shuō)明這些基因除受GA調(diào)控外，也受ABA、生長(zhǎng)素、茉莉酸甲酯、水楊酸、玉米素、逆境脅迫等的調(diào)控，與前人研究結(jié)果[40-42]類似。另外，分析發(fā)現(xiàn)，46個(gè)基因中只有22個(gè)基因的啟動(dòng)子上含有1～3個(gè)赤霉素順式作用元件，其余24個(gè)基因的啟動(dòng)子上不含赤霉素相關(guān)作用元件，可能是由于選取的啟動(dòng)子序列長(zhǎng)度(上游 1 500 bp)較短，也可能是通過(guò) GA信號(hào)通路上的其他作用因子調(diào)控其響應(yīng)內(nèi)源 GA含量變化，從而調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的 GA水平[43]，具體原因還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

大根白蘿卜不同組織器官或不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)數(shù)據(jù)分析表明，46個(gè)赤霉素相關(guān)基因在不同組織器官或不同發(fā)育時(shí)期的葉和根中的表達(dá)量存在較大差異。表達(dá)量最高的是RsGAI，其次是RsGA2OX2、RsRGL2、RsRGL3、RsRGL4、RsGID1-1、RsGID1-3、RsKO1、RsKO2、RsKAO2、RsGA20OX1、RsGA3OX1、RsGA2OX3等，而RsGA20OX4、RsGA20OX5、RsGA20OX8、RsGA20OX9、RsGA2OX10、RsRGA、RsRGL1、RsSKP2-1幾乎檢測(cè)不到表達(dá)。這可能與蘿卜不同器官和不同發(fā)育時(shí)期內(nèi)源 GA水平不同有關(guān)[44-46]。為了探究赤霉素相關(guān)基因?qū)μ}卜抽薹開(kāi)花的影響作用，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析了早開(kāi)花材料心里美蘿卜和晚開(kāi)花材料野蘿卜的赤霉素相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些基因在不同開(kāi)花期材料中的表達(dá)有明顯差異，如RsKS、RsGA20OX1、RsGA3OX1、RsGID1-1在心里美蘿卜花薹中表達(dá)水平較高，而RsKO1在野蘿卜花薹中表達(dá)水平較高，其他基因在心里美蘿卜和野蘿卜花薹中的表達(dá)水平都很低。再結(jié)合開(kāi)花抑制基因RsFLC在晚開(kāi)花的野蘿卜葉和花薹中高水平表達(dá)，但在早開(kāi)花心里美蘿卜的花薹和花中表達(dá)量很低，而開(kāi)花促進(jìn)基因RsFT只在心里美蘿卜花蕾和花中高水平表達(dá)的情況，推測(cè)不同開(kāi)花期材料中GA含量可能不一樣，因此，赤霉素相關(guān)基因的表達(dá)水平也不同，蘿卜開(kāi)花早晚可能跟RsFLC基因的關(guān)系更密切[47-51]，這些還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR對(duì)蘿卜赤霉素相關(guān)基因進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定和表達(dá)分析，研究結(jié)果為蘿卜赤霉素生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的克隆和功能研究奠定了基礎(chǔ)。