禹 霞，陳俊玲，張巖鵬

研究表明，隨著現(xiàn)代急救醫(yī)療體系的完善及心肺復(fù)蘇水平的提高，13%～59%的心搏驟?；颊唠m心肺復(fù)蘇成功[1]，但出院生存率仍低于10%[2]，且高達(dá)50%的幸存者由于腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致不同程度學(xué)習(xí)記憶障礙、情緒改變、抑郁、昏迷等神經(jīng)功能缺損癥狀，給家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[3]。腦水腫是腦缺血再灌注損傷的主要并發(fā)癥，是腦部繼發(fā)性改變的主要類型，血腦屏障破壞是腦水腫發(fā)生的主要原因，有研究認(rèn)為維護(hù)血腦屏障正常結(jié)構(gòu)是改善腦水腫的重要途徑[4]。脫水降顱壓是目前改善腦水腫的常規(guī)治療手段，甘露醇、高滲鹽水、白蛋白、呋塞米等均是常用的脫水藥物，有研究顯示，高滲鹽水在起效時(shí)間、降低顱壓程度、療效維持時(shí)效等方面均優(yōu)于其他藥物，且安全性高[5]。目前高滲鹽水改善腦水腫的作用機(jī)制尚不明了，其是否通過(guò)維護(hù)血腦屏障正常結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)治療作用的呢？基于此，我們進(jìn)行了動(dòng)物研究，利用血腦屏障滲漏、Western blot法觀察高滲鹽水對(duì)腦缺血再灌注損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)SD健康大鼠72只，體質(zhì)量300～450 g，由新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(新)2011-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(23±1)℃，濕度(50±1)%，晝夜12 h/12 h交替，自由攝食。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物：3%氯化鈉溶液(規(guī)格500 ml)和0.9%氯化鈉注射液(規(guī)格10 ml/支)均購(gòu)于江西科達(dá)醫(yī)用藥品公司。

1.1.3試劑與儀器：水合氯醛；閉合蛋白(occludin)、密封蛋白-5(claudin-5)及緊密連接蛋白-1(ZO-1)、β-actin一抗和二抗購(gòu)于CST公司；實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)試劑盒和顯色劑均購(gòu)于武漢博士德有限公司；occludin、claudin-5及ZO-1和GAPDH引物購(gòu)于生工生物工程有限公司；PCR儀、電泳儀等購(gòu)于美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組與模型制備

1.2.1.1分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠均分為4組，即正常對(duì)照組(S組)、模型組(MS組)、高滲鹽水靜脈注射組(HS組)、生理鹽水靜脈注射組(NS組)。HS組與NS組給予等體積藥量注射。

1.2.1.2模型制備：大鼠于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)3 d，自由取食、飲水。術(shù)前12 h不禁水，術(shù)中用300 mg/kg的10%水合氯醛靜脈注射麻醉大鼠。S組僅行氣管插管及動(dòng)靜脈穿刺等手術(shù)操作，但不對(duì)其窒息及心肺復(fù)蘇，以排除手術(shù)操作對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的偏倚；MS組、NS組和HS組均行窒息及心肺復(fù)蘇操作。心肺復(fù)蘇動(dòng)物模型的制備使用改良窒息心搏驟停法[6]，窒息持續(xù)8 min后開(kāi)始心肺復(fù)蘇。

1.2.2干預(yù)方法：S組和MS組大鼠均只抓取，不干預(yù)；HS組在自主循環(huán)恢復(fù)后即刻從右側(cè)股靜脈插管處輸注高滲鹽水(3%氯化鈉溶液，4 ml/kg)，8 min輸完；NS組則輸注同等劑量的0.9%氯化鈉注射液(4 ml/kg)，8 min輸完。

1.2.3檢測(cè)指標(biāo)與方法：每組于缺血再灌注6和24 h麻醉處死大鼠，取損傷側(cè)腦半球進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3.1血腦屏障滲漏檢測(cè)：每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3只大鼠，應(yīng)用伊文氏藍(lán)(EB)滲出法進(jìn)行血腦屏障通透性評(píng)價(jià)。再灌注后立即經(jīng)尾靜脈注射2%EB(Sigma,USA)4 ml/kg，取出缺血再灌注6、24 h后大鼠腦組織拍照稱重，并將其置于400 μl甲酰胺中，10 000 r/min離心30 min后對(duì)腦組織進(jìn)行EB定量。

1.2.3.2腦組織含水率測(cè)定：每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3只大鼠，取視交叉附近的腦組織稱濕重，100 ℃烤箱中烘烤24 h，稱干重。腦含水率(BWC)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.3.3Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)：應(yīng)用Western blot法檢測(cè)腦組織occludin、claudin-5及ZO-1蛋白表達(dá)量。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3只大鼠，收集大鼠損傷側(cè)腦半球組織(100 g)，研磨后加入適量RIPA裂解液，勻漿、裂解，4 ℃下12 000 r/min離心30 min，選擇新的預(yù)冷離心管放置上清。使用BCA法定量蛋白濃度后，于-80 ℃冰箱保存。取50 g蛋白樣品，在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，電壓100 V，轉(zhuǎn)膜50 min，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉轉(zhuǎn)印膜1 h；一抗孵育4 ℃過(guò)夜；二抗孵育室溫1 h，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體孵育，室溫輕搖1 h。TBST緩沖液洗膜10 min后，將顯色液A和B混合，加1 ml至膜上，用成像系統(tǒng)或化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)、拍照，計(jì)算目的蛋白光密度值，并與β-actin比較，計(jì)算其表達(dá)豐度。

1.2.3.4RT-PCR：每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3只大鼠，收集大鼠損傷側(cè)腦半球組織(100 g)，研磨后加入適量的RIPA裂解液，勻漿、裂解，4 ℃下12 000 r/min離心30 min，選擇新的預(yù)冷離心管放置上清，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書嚴(yán)格操作獲得cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再加入occludin、claudin-5、ZO-1及GAPDH的mRNA擴(kuò)增引物序列(表1)，通過(guò)變性、退火、延伸等一系列反應(yīng)后，確認(rèn)實(shí)時(shí)熒光定量的擴(kuò)增曲線和融解曲線，依據(jù)各個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物CT值，根據(jù)ΔΔCt法計(jì)算各組occludin、claudin-5、ZO-1 mRNA表達(dá)情況。

表1 高滲鹽水對(duì)心搏驟停后腦復(fù)蘇大鼠血腦屏障影響實(shí)驗(yàn)的PCR擴(kuò)增引物

2 結(jié)果

2.1各組大鼠腦缺血再灌注腦組織血腦屏障滲漏情況比較 腦缺血再灌注6、24 h時(shí)血腦屏障滲漏情況，MS組、HS組和NS組較S組嚴(yán)重，HS組和NS組較MS組減輕，HS組較NS組減輕(P<0.05)；且腦缺血再灌24 h時(shí)血腦屏障滲漏程度輕于6 h時(shí)(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦缺血再灌注6、24 h后腦組織血腦屏障滲漏情況比較

2.2各組大鼠腦缺血再灌注腦組織BWC比較 腦缺血再灌注6、24 h時(shí)BWC，MS組、HS組和NS組較S組增加，HS組和NS組較MS組降低，HS組較NS組降低(P<0.05)；且腦缺血再灌注24 h時(shí)BWC降低程度大于6 h時(shí)(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腦缺血再灌注6、24 h腦組織腦含水率比較

2.3各組大鼠腦組織相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 與S組比較，MS組、HS組和NS組腦缺血再灌注6、24 h時(shí)腦組織occludin、ZO-1蛋白表達(dá)下調(diào)，而claudin-5蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與MS組比較，HS組和NS組腦組織occludin、ZO-1蛋白表達(dá)上調(diào)，claudin-5蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與NS組比較，HS組腦組織occludin、ZO-1蛋白表達(dá)上調(diào)，claudin-5蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠腦缺血再灌注6、24 h腦組織相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

2.4各組大鼠腦組織mRNA表達(dá)情況比較 與S組比較，MS組、HS組和NS組腦缺血再灌注6、24 h時(shí)腦組織occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)下調(diào)，claudin-5表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與MS組比較，HS組和NS組腦組織occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，claudin-5 mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與NS組比較，HS組腦組織occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，claudin-5 mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。并且隨著腦缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，腦組織occludin、ZO-1及claudin-5 mRNA表達(dá)下調(diào)程度增加(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠腦缺血再灌注6、24 h腦組織相關(guān)mRNA表達(dá)情況比較

3 討論

腦缺血再灌注損傷是心肺復(fù)蘇后常見(jiàn)并發(fā)癥，腦組織缺血一段時(shí)間后恢復(fù)血供反而會(huì)產(chǎn)生新的損傷，蛋白酶激活、鈣離子超載、自由基增多、興奮性氨基酸過(guò)度表達(dá)等均是腦組織再灌注損傷的原因，在上述原因作用下導(dǎo)致腦組織內(nèi)皮細(xì)胞受損，微血管受破壞，影響血腦屏障功能[7-8]。有研究顯示，腦缺血再灌注損傷3 h時(shí)血漿蛋白開(kāi)始出現(xiàn)外滲，此時(shí)血腦屏障逐漸開(kāi)放，再灌注6～12 h血腦屏障通透性進(jìn)一步增加，直至再灌注24 h后血腦屏障通透性達(dá)高峰[9]。本研究通過(guò)測(cè)定各組血腦屏障滲漏情況及腦組織BWC后發(fā)現(xiàn)再灌注24 h時(shí)大鼠血腦屏障滲漏情況、腦組織BWC較再灌注6 h時(shí)減輕或降低，與既往研究[10-11]結(jié)果一致。

高滲鹽水對(duì)于腦外傷、腦卒中、腦腫瘤等諸多原因?qū)е履X水腫均有較好的治療結(jié)果，有研究證實(shí)其可明顯減輕急性腦水腫，降低顱高壓[5]。本研究構(gòu)建心搏驟停后腦復(fù)蘇動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)MS組大鼠腦組織BWC明顯高于S組，說(shuō)明心搏驟停后腦復(fù)蘇大鼠存在一定程度的腦水腫，經(jīng)過(guò)高滲鹽水干預(yù)后大鼠腦組織BWC降低，明顯低于NS組，提示高滲鹽水可明顯減輕心搏驟停后腦復(fù)蘇引起的腦水腫，這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)諸多文獻(xiàn)[12-13]研究結(jié)果一致。

ZO-1是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的緊密連接相關(guān)蛋白，在高級(jí)動(dòng)物中樞系統(tǒng)組織中均有表達(dá)。ZO-1表達(dá)與血腦屏障結(jié)構(gòu)及功能完整性密切相關(guān)，甚至有學(xué)者認(rèn)為ZO-1表達(dá)下降可視為衡量血腦屏障破壞的標(biāo)志[14]。occludin是首個(gè)被完整分離的緊密連接相關(guān)性膜蛋白，在腦組織血管內(nèi)皮中高表達(dá)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)當(dāng)occludin表達(dá)受抑制時(shí)緊密連接蛋白出現(xiàn)崩解，細(xì)胞間縫隙開(kāi)放，血腦屏障完整性受損[15]。claudin-5是緊密連接復(fù)合物中的跨膜蛋白，是構(gòu)成血腦屏障的主要成分，是維持緊密連接選擇性滲透和細(xì)胞極化功能的主要調(diào)節(jié)因子，有學(xué)者在腦水腫模型鼠腦組織中發(fā)現(xiàn)claudin-5存在高表達(dá)現(xiàn)象[16]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)MS組大鼠ZO-1、occludin蛋白及mRNA表達(dá)下降，claudin-5蛋白及mRNA表達(dá)上調(diào)，并隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)上述指標(biāo)mRNA表達(dá)下調(diào)程度增加，說(shuō)明與等滲鹽水相比，高滲鹽水可明顯改善大鼠腦水腫，且可調(diào)節(jié)ZO-1、occludin、claudin-5蛋白及mRNA表達(dá)。

綜上，高滲鹽水可明顯改善心搏驟停后腦復(fù)蘇大鼠腦水腫，作用機(jī)制可能與修復(fù)血腦屏障功能有關(guān)。