肖建波 史玉 王亞秋 李天一 李海麗

非霍奇金淋巴瘤(NHL)是具備較強異質(zhì)性的獨立疾病的總稱，是我國臨床治療中較為常見的腫瘤之一，通常臨床上按照細胞來源分為B淋巴細胞、T淋巴細胞(簡稱 T細胞)及自然殺傷(NK)細胞3種類型，臨床上較為常見的是B淋巴細胞型的NHL[1]。NHL患者的臨床表現(xiàn)具有一定的相似性，這是由于其發(fā)病位置均為淋巴結(jié)[2-3]。但按照患者的病理類型、受侵犯的部位及受侵犯的范圍差異，其臨床表現(xiàn)存在差異性，其中局部表現(xiàn)主要是淋巴結(jié)腫大、淋巴結(jié)外器官受侵犯及鼻腔病變等，全身性表現(xiàn)則為發(fā)熱、盜汗、體重減輕、皮膚病變或胃腸道病變等[4]。由于患者個體差異較大，在臨床中需要具有針對性的進行治療，臨床上認為阻斷程序性死亡受體1(PD-1)能夠有效增強機體免疫能力，PD-1作為B7-CD28共刺激受體家族一員，其能夠結(jié)合程序性死亡配體1和2(PD-L1和PD-L2)，抑制T細胞活化，減少相應細胞因子的產(chǎn)生及T細胞的存活；同時，PD-1異常表達對于NHL的診斷也存在意義[5]。本研究對NHL患者的PD-1免疫組化特征進行研究，探究其臨床價值。

對象與方法

1.對象：2018年4月～2020年4月我院收治的NHL患者84例，其中男49例，女35例，年齡15～65歲，平均年齡(47.22±3.55)歲。納入標準：(1)經(jīng)病理學檢查確診為NHL，符合NHL的形態(tài)學及免疫表型診斷標準；(2)未接受過化療或放射性治療，未服用過抗腫瘤藥物；(3)病理資料及實驗室檢查相關資料完整。排除標準：(1)非首次確診且此前已經(jīng)接受過相關治療；(2)跟蹤研究過程中停止治療。按照WHO的NHL病理類型及惡性病變程度[6]，將84例患者分為高侵襲性腫瘤組(32例)、侵襲性腫瘤組(30例)及惰性腫瘤組(22例)。根據(jù)病理檢測結(jié)果將84例患者分為非特殊型間變大細胞淋巴瘤組(18例)、T細胞淋巴瘤組(21例)、血管免疫母細胞淋巴瘤組(17例)、彌漫大B細胞淋巴瘤組(16例)、濾泡性淋巴瘤組(12例)。按Ann Arbor病理分期，84例患者中Ⅰ期23例，Ⅱ期21例，Ⅲ期19例，Ⅳ期21例。將所有患者病理組織切片的平均PD-1陽性表達細胞數(shù)作為臨界值將84例患者分為高PD-1陽性表達組(38組)和低PD-1陽性表達組(46組)。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核通過，所有患者均簽署知情同意書。

2.方法

(1)流式細胞術檢測患者外周血PD-L1、CD4+T細胞、CD8+T細胞的表達水平：所有患者治療前采集其空腹狀態(tài)下的外周靜脈血2 ml，使用同體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋并清洗外周血單核細胞3次，去除上層清液后，采用流式細胞儀檢測患者PD-L1、CD4+和CD8+T細胞表達水平，并計算CD4+/CD8+T細胞比值。

(2)免疫組化檢測患者病理組織中PD-L1、PD-L2的表達：將所有患者病理組織切片進行常規(guī)脫蠟，經(jīng)常規(guī)抗原修復、抗原暴露后以氧化氫處理，然后與1∶100比例稀釋的抗PD-1單克隆抗體、1∶120比例稀釋的PD-L1多克隆抗體及1:150比例稀釋的抗PD-L2多克隆抗體共同孵育一夜。將PBS作為一抗空白對照，生物素化二抗以及HRP均孵育30 min后DAB顯色3 min，之后根據(jù)顯色情況進行蘇木素復染，鹽酸酒精分化處理后使用中性樹膠封片。將5個光鏡下視野區(qū)的PD-1陽性表達細胞平均數(shù)作為該患者陽性表達細胞數(shù)。以PD-L1、PD-L2陽性表達及細胞染色強弱情況共同確定標本是否PD-L1及PD-L2陽性表達(圖1)。陽性細胞表達<10%記1分，陽性細胞表達為10%～50%記2分，陽性細胞表達>50%記3分；細胞染色強弱：無著色記0分，染色為淡黃色記1分，染色為棕黃色記2分，染色為褐黃色記3分。最后將兩項評分相乘，數(shù)值≥3為陽性，<3則為陰性。

注：A：PD-1；B.PD-L1；C.PD-L2

結(jié) 果

1.不同病理類型組患者病理組織中PD-L1及PD-L2的陽性表達比較：高侵襲性腫瘤組PD-L1及PD-L2陽性表達率明顯高于侵襲性腫瘤組及惰性腫瘤組，侵襲性腫瘤組PD-L1及PD-L2陽性表達率明顯高于惰性腫瘤組(P<0.05)。見表1。

表1 不同病理類型患者病理組織中PD-L1及PD-L2的陽性表達比較[例，(%)]

2.不同類型腫瘤組患者外周血PD-L1表達水平比較：非特殊型間變大細胞淋巴瘤組患者外周血PD-L1水平為(378.22±72.56)pg/ml，T細胞淋巴瘤組患者外周血PD-L1水平為(151.26±29.64)pg/ml，血管免疫母細胞淋巴瘤組患者外周血PD-L1水平為(218.65±52.37)pg/ml，彌漫大B細胞淋巴瘤組患者外周血PD-L1水平為(465.37±169.87)pg/ml，濾泡性淋巴瘤組患者外周血PD-L1水平為(81.26±16.52)pg/ml。5組不同類型腫瘤患者外周血PD-L1水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=15.390，P<0.05)。其中非特殊型間變大細胞淋巴瘤組與彌漫大B細胞淋巴瘤組患者外周血PD-L1水平比較差異無統(tǒng)計學意義(t=0.353，P>0.05)，其余類型腫瘤組患者外周血PD-L1水平均低于非特殊型間變大細胞淋巴瘤組(P<0.05)。

3.不同病理分期組患者PD-L1陽性表達比較：Ⅰ～Ⅱ期組(59.69%，26/44)與Ⅲ～Ⅳ期組(67.5%，27/40)患者PD-L1陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.522，P=0.217)。

4.高PD-1陽性表達組和低PD-1陽性表達組患者的免疫功能指標比較：高PD-1陽性表達組患者CD4+T細胞和CD4+/CD8+T細胞比值明顯低于低PD-1陽性表達組(P<0.001)。見表2。

表2 高PD-1陽性表達組和低PD-1陽性表達組患者的免疫功能指標比較

討 論

NHL屬于人體全身都可能發(fā)病的臨床疾病，對患者生活質(zhì)量和生命健康安全造成了較為嚴重的影響，隨著臨床上對NHL研究的不斷深入，相關藥物的研發(fā)和治療也越來越多，目前該病的主要治療方式有全身化療、局部放療、生物免疫學、造血干細胞移植術等。此外，NHL雖然為全身性疾病，不同患者臨床表現(xiàn)存在一定的共同點，但不同患者的病理類型、侵犯位置和范圍還存在差異，臨床上可據(jù)此進行個性化治療[7]。PD-1是一種十分重要的免疫抑制分子，其作用具有雙面性，一方面能抑制免疫系統(tǒng)對人體細胞產(chǎn)生反應，并通過降低T細胞炎性反應加強患者耐受能力，另一方面還會防止免疫系統(tǒng)殺死癌細胞[8-9]。PD-L1是PD-1的受體，其在癌細胞上的表達通過PD-1和效應T細胞相結(jié)合共同抑制腫瘤細胞活性[10]。由于PD-1在腫瘤細胞中的表達具有明顯的特異性，且對免疫機制的調(diào)節(jié)作用明顯，因此臨床上考慮將其作為靶向治療研究的方向，并已在實體瘤治療中取得了良好效果。其治療方式多樣，小分子抑制劑、單克隆抗體、雙特異性抗體、抗體藥物耦聯(lián)物及細胞免疫治療均為其治療的良好方法[11]。

本研究結(jié)果顯示PD-L1陽性表達率與患者病理類型之間存在一定的關系，腫瘤侵襲性越強其表達率越高，與楊紅麗等[12]的研究結(jié)果基本一致。表明PD-1及PD-L1的陽性表達率與腫瘤細胞的病變狀況關系密切，能夠?qū)δ[瘤存在的情況進行較為敏感的反應，能有效判斷患者腫瘤細胞的侵襲強度，對其預后狀況進行判斷，同時還能夠?qū)⑵渥鳛槟[瘤因子存在情況的一項檢測指標對患者臨床分型治療提供一定的借鑒。王平等[13]同樣對腫瘤患者的PD-1和PD-L1水平進行研究，發(fā)現(xiàn)其對腫瘤的診斷效果良好，且與患者預后存在明顯的相關性，與本研究結(jié)果一致，表明PD-1的表達與非小細胞癌患者的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，可能可以作為評價非小細胞癌惡性程度和預后的指標，指出了該指標對腫瘤患者病程進展評價的重要性。但本研究中患者不同病理分期的PD-1陽性表達率差異不顯著，與李婷等[14]的研究結(jié)果相似，可能是由于非小細胞肺癌和NHL具體的致病機制不同。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高PD-1陽性表達組患者免疫功能低于低PD-1陽性表達組。免疫機制是腫瘤患者病程進展過程中的重要影響因素，PD-1作為重要的免疫調(diào)節(jié)因子與PD-L1結(jié)合能夠組織免疫系統(tǒng)殺死腫瘤細胞，且在腫瘤患者癥具有較高水平的存在，這對患者的治療進展造成了嚴重影響，同時也提示臨床對PD-1進行拮抗阻斷能夠有效改善免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的消除作用，提升臨床治療效果。本研究受條件限制，未能納入更大批量的臨床患者展開研究，且缺乏復發(fā)患者再次活檢與免疫組化檢查的結(jié)果，因此可能對研究結(jié)果造成影響，存在一定局限性。

綜上所述，PD-1及其配體PD-L1在NHL患者中的表達具有明顯特征，腫瘤細胞侵襲性越強，表達率越高，對患者腫瘤細胞的侵襲作用具有一定的判斷作用，還能作為患者腫瘤分型的借鑒性指標之一。此外，PD-1與患者免疫功能之間的關系明顯，能夠通過調(diào)節(jié)免疫機制對患者抗腫瘤能力進行改變，因此臨床上可以采用PD-1阻斷藥物調(diào)節(jié)免疫機制，從而降低腫瘤細胞的侵襲性，提升臨床療效。