寧菲菲,羅 玲,吳 燕,王 婭,馬愛群,,,王亭忠,,(西安交通大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,西安 7006;教育部環(huán)境與基因相關疾病重點實驗室;陜西省心臟病學重點實驗室;通訊作者,E-mail:tingzhong.wang@xjtu.edu.cn)

伏立康唑(voriconazole)是一種三唑類抗真菌藥物,通過抑制14α-甾醇去甲基化,抑制真菌細胞膜的合成,具有抗菌譜廣、抗菌效力強、口服生物利用度高等特點。伏立康唑主要用于治療免疫功能低下所致的嚴重侵襲性真菌感染,是治療肺曲霉菌感染的一線用藥[1]。近年來,由于造血干細胞移植、實體器官移植在臨床工作中廣泛開展,免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑在移植術后患者、風濕性疾病及腎臟疾病患者中大量使用,導致侵襲性曲霉菌、念珠菌等真菌感染風險提高,伏立康唑在臨床中的應用逐漸增加[2]。隨著用藥人群的增加及用藥療程的延長,關于伏立康唑不良反應的報道不斷增加[3-5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)伏立康唑可導致QT間期延長、尖端扭轉(zhuǎn)性室速、竇性心動過緩、心房顫動、房室傳導阻滯等多種類型的心律失常,其發(fā)生機制尚不明確,也缺乏針對性的預防及治療措施[6,7]。因此,了解伏立康唑?qū)е滦穆墒С０l(fā)生的可能分子機制,有助于為預防和治療伏立康唑相關心律失常提供可能的干預靶點。

多種遺傳性或獲得性因素均可能通過影響心肌細胞的離子流而延長動作電位時程(action potential duration,APD),表現(xiàn)為體表心電圖上的QT間期延長,進而導致尖端扭轉(zhuǎn)性室速等嚴重心律失常。既往研究發(fā)現(xiàn),多種藥物可以通過抑制心臟快速延遲整流鉀通道(human ether-a-go-go-related gene,hERG,KCNH2編碼)介導的快速延遲整流鉀電流(the rapidly activating delayed rectifier potassium channel current,IKr)延長動作電位平臺期,從而導致APD及QT間期延長[8,9]。心臟電壓門控鈉通道(Nav1.5,SCN5A基因編碼)介導的鈉電流(INa)是心肌細胞動作電位0期的主要內(nèi)向電流,在心臟動作電位的形成和傳導過程中發(fā)揮著關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)鈉通道介導的晚鈉電流(late sodium current,INa-L)也可延長QT間期,進而誘發(fā)心律失常[10,11]。伏立康唑?qū)π呐K離子通道的影響尚不明確。為探討伏立康唑?qū)е滦呐KQT間期延長及心律失常發(fā)生的離子機制,本研究利用Western blot和全細胞膜片鉗技術,觀察了伏立康唑?qū)υ贖EK-293細胞中表達的hERG通道及Nav1.5通道表達和功能的影響,為臨床工作中伏立康唑誘發(fā)的心律失常的防治提供基礎實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.2 主要溶液配制

電極外液:NaCl 137 mmol/L,葡萄糖10 mmol/L,KCl 4 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,MgCl21 mmol/L,CaCl21.8 mmol/L;配好后,用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4,0.22 μm微孔濾膜過濾后置于4 ℃冰箱保存。鈉通道檢測電極內(nèi)液:NaCl 10 mmol/L,CsCl 130 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,EGTA 10 mmol/L;鉀通道檢測電極內(nèi)液:KCl 130 mmol/L,MgCl21 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,EGTA 10 mmol/L,MgATP 5 mmol/L;電極內(nèi)液用CsOH調(diào)節(jié)pH值至7.2,0.22 μm微孔濾膜過濾,分裝于5 ml EP,-20 ℃冰箱保存。RIPA蛋白裂解液:NaCl 137 mmol/L,EDTA 2 mmol/L,Tris-HCl 20 mmol/L,Triton X-100 1%,甘油10%。TBS-T溶液:Tris-HCl 50 mmol/L,NaCl 37.5 mmol/L,吐溫1‰。PBS緩沖液:NaCl 137 mmol/L,KCl 2.7 mmol/L,Na2HPO48 mmol/L,KH2PO41.5 mmol/L。

1.3 細胞株及質(zhì)粒

人胚腎上皮細胞(human embryonic kidney cell line,HEK293細胞)是一種常用的表達研究外源基因的細胞株,購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。SCN5A cDNA由英國曼徹斯特大學(University of Manchester, UK)張艷敏教授惠贈;hERG cDNA由美國威斯康星大學(University of Wisconsin-Madison,USA)Gail Robertson教授惠贈。

1.4 細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

1.5 伏立康唑?qū)ERG及Nav1.5蛋白表達的影響

選取穩(wěn)定表達hERG的HEK293細胞,以適當密度接種于細胞培養(yǎng)皿中;培養(yǎng)24 h棄去原培養(yǎng)基,更換為伏立康唑濃度分別為0,2.5,5,10,50 μmol/L的含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,分別干預細胞24 h,Western blot檢測hERG蛋白表達。以0 μmol/L伏立康唑為對照組,比較不同濃度伏立康唑?qū)ERG蛋白表達的影響。

選取穩(wěn)定表達Nav1.5的HEK293細胞,以適當密度接種于細胞培養(yǎng)皿中;培養(yǎng)24 h棄去原培養(yǎng)基,更換為伏立康唑濃度分別為0,2.5,5,10,50 μmol/L的含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,分別干預細胞24 h,Western blot檢測Nav1.5蛋白表達。以0 μmol/L伏立康唑為對照組,比較不同濃度伏立康唑?qū)av1.5蛋白表達的影響。

選取穩(wěn)定表達Nav1.5的HEK293細胞,培養(yǎng)24 h棄去原培養(yǎng)基,更換為5 μmol/L的伏立康唑處理細胞,分別培養(yǎng)0,2,4,8,16,24 h,用Western blot檢測Nav1.5蛋白表達。

藥物干預后棄去DMEM培養(yǎng)液,使用預冷的PBS緩沖液沖洗培養(yǎng)皿2次,每35 mm小培養(yǎng)皿加入RIPA蛋白裂解液200 μl,收集細胞于1.5 ml EP管中后于冰上靜置30 min,每10 min強烈震蕩1次,12 000g,離心30 min(4 ℃),收集上清液,使用BCA法定量蛋白。每個膠孔中加入30 μg變性蛋白,SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PVDF膜用含有5% TBS-T的脫脂奶粉室溫下封閉2 h,TBS-T溶液洗膜3次,加入5 ml按1 ∶1 000稀釋的相應一抗(兔抗小鼠Nav1.5、兔抗人hERG抗體及兔抗小鼠β-actin)中,4 ℃孵育過夜,TBS-T溶液漂洗3次后,相應二抗室溫孵育2 h;TBS-T溶液漂洗后用ECL試劑盒發(fā)光顯像。所得蛋白表達條帶用ImageJ軟件進行灰度分析,以肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參,分析蛋白的相對表達水平。

1.6 伏立康唑?qū)ERG通道及SCN5A通道功能的影響

分別選取對數(shù)期的穩(wěn)定表達hERG的HEK293細胞和穩(wěn)定表達Nav1.5的HEK293細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中;培養(yǎng)24 h棄去原培養(yǎng)基,更換為伏立康唑濃度分別為0,5,10 μmol/L的含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,處理細胞24 h,用全細胞膜片鉗技術檢測IKr、INa、INa-L電流密度及hERG通道、Nav1.5通道功能。以0 μmol/L伏立康唑為對照組,比較不同濃度伏立康唑?qū)ERG及Nav1.5通道功能的影響。測定電流前,胰酶消化處理細胞,轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中待用。電極外液沖洗細胞槽后,取適量細胞滴于細胞槽中,靜置10 min,使其沉降并貼壁。使用尖端直徑為1～3 μm的電極,填充灌電極內(nèi)液后電阻為2～5 MΩ。高阻封接形成后,輕柔給予負壓吸破細胞膜,進行串聯(lián)電阻和電容電流補償,開始全細胞記錄模型。分別調(diào)用不同程序記錄細胞IKr、INa、INa-L電流:①hERG通道激活程序:維持電位-80 mV,給予一系列維持時間為4 500 ms的去極化刺激,刺激電壓從-70 mV到70 mV,以10 mV增幅逐漸增加,此后給予維持時間為4 500 ms,電壓為-50 mV的刺激誘發(fā)尾電流。②Nav1.5通道激活程序:維持電位固定在-140 mV,給予一系列維持時間為20 ms的去極化刺激,刺激電壓從-80 mV起,以5 mV增幅逐漸增大到60 mV,此后電壓恢復到-140 mV。③Nav1.5通道穩(wěn)態(tài)失活程序:采用雙脈沖刺激程序記錄鈉電流的失活特性。將維持電位固定在-140 mV,其指令電位依次從-140 mV至-20 mV,步長10 mV,鉗制時間為500 ms。此條件脈沖鉗制時間足夠長,允許鈉通道充分失活即達到穩(wěn)態(tài)滅活。在每次條件脈沖后,都緊跟一個固定的測試脈沖,用以測定沒有被滅活部分鈉通道的活性,鉗制時間為20 ms,指令電位為-10 mV,然后回到維持電位-140 mV,刺激間隔為5 s。④晚鈉電流記錄程序:維持電位固定在-140 mV,100 ms后給予維持時間為1 000 ms的去極化刺激,刺激電壓為-10 mV。去極化刺激后200 ms的鈉電流作為晚鈉電流水平。程序記錄結(jié)束后更換新的細胞。記錄過程中如果電極脫落,則更換電極和細胞后重新記錄。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 伏立康唑濃度改變不影響HEK-293細胞中hERG蛋白的表達水平

Western blot結(jié)果顯示,與0 μmol/L伏立康唑相比,2.5,5,10,50 μmol/L的伏立康唑處理穩(wěn)定表達hERG的HEK293細胞24 h,hERG蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖1)。

2.2 伏立康唑濃度改變不影響IKr電流密度

分別用0,5,10 μmol/L的伏立康唑干預穩(wěn)定表達hERG通道的HEK-293細胞24 h,使用全細胞膜片鉗技術,調(diào)用hREG通道激活程序檢測IKr電流密度。以電壓為橫坐標,相應電流值為縱坐標,分別得出0,5,10 μmol/L的伏立康唑處理24 h對hERG通道的電流-電壓曲線的影響。結(jié)果顯示隨著伏立康唑濃度的增加,鉀通道的峰值電流及尾電流的電流密度不受影響,與對照組相比,電流-電壓曲線(I-V曲線)變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖2)。

圖1 Western blot技術檢測伏立康唑?qū)EK-293細胞hERG蛋白表達影響 (n=3)Figure 1 Effect of voriconazole on the expression of hERG detected by Western blot (n=3)

圖2 全細胞膜片鉗技術檢測伏立康唑?qū)EK-293細胞IKr電流的影響 (n=10)Figure 2 Effect of voriconazole on the current of IKr detected by whole cell patch (n=10)

2.3 伏立康唑濃度及時間依賴性增加Nav1.5蛋白表達

Western blot結(jié)果顯示,分別用含有0,2.5,5,10,50 μmol/L伏立康唑的高糖DMEM培養(yǎng)基處理穩(wěn)定表達Nav1.5的HEK293細胞24 h,與0 μmol/L相比,2.5,5,10,50 μmol/L伏立康唑隨濃度升高可增加Nav1.5表達(見圖3A)。用含5 μmol/L伏立康唑的高糖DMEM培養(yǎng)基處理0,2,4,8,16,24 h檢測Nav1.5蛋白,結(jié)果表明隨著處理時間的延長,Nav1.5表達增加(見圖3B)。

圖3 Western blot技術檢測伏立康唑?qū)EK-293細胞Nav1.5蛋白表達影響 (n=3)Figure 3 Effect of voriconazole on the expression of Nav1.5 detected by Western blot (n=3)

2.4 伏立康唑濃度依賴性增加鈉電流密度

分別用0,5,10μmol/L的伏立康唑處理穩(wěn)定表達Nav1.5通道的HEK-293細胞24 h,全細胞膜片鉗技術調(diào)用Nav1.5通道激活程序檢測峰值鈉電流INa電流密度。以電壓為橫坐標,相應電流值為縱坐標,分別得出0,5,10 μmol/L的伏立康唑干預24 h對鈉通道的電流-電壓曲線的影響。結(jié)果顯示隨著伏立康唑濃度的增加,INa電流密度增加,與0 μmol/L相比,5 μmol/L及10 μmol/L伏立康唑干預24 h電流-電壓曲線組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖4)。

2.5 伏立康唑影響鈉通道激活及失活功能

通過電流-電壓曲線,根據(jù)I-V曲線的線性部分獲得曲線的反轉(zhuǎn)電壓(reversal voltage,Vreserve)。通過測量所得的電流值(I)、膜電壓(Vm)水平及計算所得的Vreserve,根據(jù)公式g=I/(Vm-Vreverse)分別計算每個細胞的電導值;標準化電導值后,以標準化的電導值(g/gmax)為縱坐標,以Vm為橫坐標,通過Origin 8.0軟件,將所得數(shù)據(jù)用Boltzmann函數(shù)擬合,得出鈉通道的穩(wěn)態(tài)激活曲線(見圖5A)。

結(jié)果顯示伏立康唑處理24 h,鈉通道的電壓依賴性激活曲線稍左移(見圖5A),濃度為0,5,10 μmol/L的伏立康唑處理后,Nav1.5通道的半數(shù)激活電壓分別為(-46.6±0.6)mV,(-50.9±1.0)mV,(-51.2±1.2)mV,5,10 μmol/L的伏立康唑處理組與0 μmol/L組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),5 μmol/L及10 μmol/L組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);0,5,10 μmol/L的伏立康唑處理24 h鈉通道的激活斜率(k)分別為(8.2±0.3)mV,(-7.4±0.4)mV,(4.5±0.3)mV,三組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

分別用0,5,10 μmol/L的伏立康唑處理穩(wěn)定表達Nav1.5通道的HEK-293細胞24 h,全細胞膜片鉗技術調(diào)用Nav1.5穩(wěn)態(tài)失活程序記錄鈉電流的失活特性。以電壓為橫坐標,標準化的鈉電流為縱坐標,分別得出0,5,10 μmol/L伏立康唑處理24 h的鈉通道電壓依賴性失活曲線。結(jié)果顯示不同濃度伏立康唑不影響鈉通道的電壓依賴性失活特性(見圖5B)。0,5,10 μmol/L伏立康唑處理24 h,鈉通道的半數(shù)失活電壓分別為(-64.5±0.2)mV,(-65.6±0.3)mV,(-62.3±0.3)mV,與對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);0,5,10 μmol/L伏立康唑處理24 h鈉通道的失活斜率(k)分別為(7.8±0.2)mV,(-8.4±0.3)mV,(8.2±0.2)mV,與0 μmol/L組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01圖4 全細胞膜片鉗技術檢測伏立康唑?qū)EK-293細胞峰值鈉電流的影響 (n=13)Figure 4 The effect of voriconazole on the current of INa detected by whole cell patch (n=13)

圖5 全細胞膜片鉗技術檢測伏立康唑?qū)EK-293細胞鈉通道激活及失活特性的影響 (n=13)Figure 5 Effect of voriconazole on the activation and inactivation properties detected by whole cell patch (n=13)

2.6 伏立康唑增加細胞晚鈉電流水平

分別用0,5,10 μmol/L的伏立康唑處理穩(wěn)定表達Nav1.5通道的HEK-293細胞24 h,全細胞膜片鉗技術調(diào)用晚鈉電流記錄程序檢測INa電流水平。去極化刺激后200 ms的鈉電流作為晚鈉電流水平,所得電流水平用峰值鈉電流標準化后比較各組間晚鈉電流的差異。0,5,10 μmol/L的伏立康唑處理穩(wěn)定表達Nav1.5通道的HEK-293細胞24 h,晚鈉電流水平分別為(-10.8±0.3)mA,(-26.3±1.7)mA,(-68.0±7.8)mA,用峰值鈉電流標準化后三組間晚鈉電流水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖6)。

圖6 全細胞膜片鉗技術檢測伏立康唑?qū)EK-293細胞晚鈉電流的影響 (n=11)Figure 6 Effect of voriconazole on the late sodium current detected by whole cell patch (n=11)

3 討論

伏立康唑是一種臨床中廣泛應用的三唑類抗真菌藥物,近年來已有多例伏立康唑?qū)е翾T間期延長、誘發(fā)或加重心律失常的報道,但其導致心律失常的機制尚不明確[7,12-16]?？焖傺舆t整流鉀電流及晚鈉電流均可以顯著影響心肌細胞的動作電位,進而導致QT間期的延長或縮短,誘發(fā)室性心動過速等多種類型的心律失常[17]。隨著對藥物所致心律失常機制認識的不斷深入,現(xiàn)階段新藥研發(fā),需常規(guī)檢測其對IKr的阻滯作用,以評估其導致QT間期延長和心律失常發(fā)生的可能性。伏立康唑是氟康唑的衍生物,兩者具有相似的化學結(jié)構。既往研究發(fā)現(xiàn),氟康唑可以濃度依賴性地抑制心臟IKr電流,導致心肌細胞QT間期延長,從而增加氟康唑誘發(fā)心律失常的風險[18,19]。Frommeyer等[20]分別用伏立康唑和氟康唑處理家兔心臟,發(fā)現(xiàn)兩者均可導致QT間期延長及早后除極、多形性室速等心律失常;進一步降低灌流液鉀離子濃度,可以增加氟康唑處理組而非伏立康唑處理組的心律失常發(fā)生率。血清鉀離子濃度降低影響hERG通道的功能及細胞膜的穩(wěn)定性,但不影響電壓門控鈉通道。研究提示伏立康唑可能不是通過影響hERG通道導致心肌細胞QT間期延長的。本實驗利用穩(wěn)定表達通道蛋白的HEK-293細胞,通過Western blot及全細胞膜片鉗技術,發(fā)現(xiàn)伏立康唑?qū)ERG通道的表達和功能均無顯著影響。

近期研究顯示晚鈉電流的升高也可能導致QT間期延長,進而誘發(fā)心律失常[21]。晚鈉電流是部分鈉通道延遲失活或不完全失活而形成的持續(xù)性內(nèi)向鈉電流,參與維持動作電位的平臺期。在生理狀態(tài)下,晚鈉電流強度小于峰鈉電流的1%,對動作電位無明顯影響。但在病理或者藥物干預的條件下,晚鈉電流可能出現(xiàn)不同程度的增強。異常增強的晚鈉電流可誘發(fā)早發(fā)后除極,進而導致心律失常發(fā)生[22]。在心力衰竭、心肌梗死等病理情況下,異常增強的晚鈉電流是誘發(fā)嚴重心律失常重要原因[23]。本研究發(fā)現(xiàn)伏立康唑濃度依賴性的增加Nav1.5的表達,增加峰值鈉電流水平,升高晚鈉電流水平。濃度依賴性地增加晚鈉電流水平可能是伏立康唑?qū)е翾T間期延長的原因之一。

臨床應用伏立康唑的有效血藥濃度范圍為1.0～5.5 mg/L[24],相當于4.29～15.73 μmol/L。5 μmol/L伏立康唑接近臨床使用該藥物的最低有效血藥濃度。本研究發(fā)現(xiàn)在HEK293細胞中,5 μmol/L的伏立康唑即可時間依賴性增加Nav1.5表達并升高晚鈉電流水平。臨床用藥過程中伏立康唑可能影響晚鈉電流水平,從而增加心律失常發(fā)生的風險。在伏立康唑治療中如合并使用其他致心律失常藥物、基線QT間期延長、低鉀等條件,則更容易誘發(fā)心律失常[12]。臨床工作中使用伏立康唑,建議嚴密心電監(jiān)護,糾正低鉀等其他可能誘發(fā)心律失常的因素,謹防QT間期延長及心律失常的發(fā)生。

綜上所述,本研究伏立康唑分別干預穩(wěn)定表達hERG通道蛋白及Nav1.5通道蛋白的HEK-293細胞,結(jié)果顯示伏立康唑干預可以濃度及時間依賴性增加電壓門控鈉通道的表達水平,增加峰值鈉電流及晚鈉電流水平,但不影響hERG通道的表達及快速延遲整流鉀電流水平;提示晚鈉電流增強可能是伏立康唑?qū)е翾T間期延長的原因之一,為臨床工作中伏立康唑誘發(fā)心律失常的防治提供基礎實驗依據(jù)。