吳輝淵

江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006

我國(guó)年新發(fā)肝癌38.9 萬(wàn)例，約為全部新發(fā)癌癥的9.6%［1］。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)約占原發(fā)性肝癌90%，我國(guó)的HCC 主要由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染引起（約占80%）［2］。中藥治療乙型肝炎相關(guān)肝細(xì)胞癌具有獨(dú)特的療效和優(yōu)勢(shì)［3-13］，本研究通過(guò)生物信息學(xué)研究方法，篩選出乙型肝炎相關(guān)肝細(xì)胞癌的關(guān)鍵基因并預(yù)測(cè)相關(guān)治療中藥，運(yùn)用系統(tǒng)評(píng)價(jià)方法進(jìn)一步驗(yàn)證其療效。

1 資料和方法

1.1 獲取基因芯片數(shù)據(jù)

從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載基因芯片數(shù)據(jù)集（GSE121248，GSE47197），其中GSE121248 芯片數(shù)據(jù)采用GPL570 平臺(tái)，包括HBV 相關(guān)HCC 患者的70 個(gè)腫瘤組織，37 個(gè)臨近非腫瘤組織；GSE47197 芯片數(shù)據(jù)采用GPL16699平臺(tái)，包含HBV 相關(guān)HCC 患者的61 個(gè)腫瘤組織，63 個(gè)臨近非腫瘤組織。類型設(shè)置為expression profiling by array，種屬為“homosapiens”。

1.2 數(shù)據(jù)的處理與篩選

應(yīng)用GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）在線工具及EXCEL 軟件，以adj.P＜0.05、|logFC|＞1為標(biāo)準(zhǔn)篩選2 個(gè)芯片HCC 患者腫瘤組織與鄰近非腫瘤組織的差異基因（DEGs），應(yīng)用 Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）得到交集DEGs，并繪制韋恩圖。

1.3 差異基因的功能注釋

通過(guò)Metascape（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）在線工具對(duì)1.2 獲得的交集DEGs 進(jìn)行基因本體（GO）功能、京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，背景基因設(shè)置為“homosapiens”，篩選條件設(shè)為P＜0.05。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析與關(guān)鍵基因的篩選

將1.2 獲得的交集DEGs 導(dǎo)入到STRING（https://cn.string-db.org/）進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析，設(shè)置物種為“homosapiens”，highest confidence ≥0.4。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件進(jìn)行可視化，用CytoHubba 插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析，并根據(jù)degree 進(jìn)行排序，排名前10 的DEGs 作為關(guān)鍵基因。

1.5 關(guān)鍵基因的分析

利 用UCSC Xena（https://xena.ucsc.edu/）分 析關(guān)鍵基因在原發(fā)性肝癌和正常組織的表達(dá)差異；根據(jù)每個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)水平的高低，采用Kaplan-Meier Plotter（http://www.kmplot.com/analysis/）數(shù) 據(jù)庫(kù)作生存曲線，采用Logrank 檢驗(yàn)。

1.6 關(guān)鍵基因的中藥預(yù)測(cè)

將乙型肝炎相關(guān)肝細(xì)胞癌患者關(guān)鍵基因輸入Coremine Medical (https://coremine.com/)檢索框，以P＜0.05 且被《中國(guó)藥典》2020 年版收錄為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潛在治療中藥的篩選。最后預(yù)測(cè)得出與HBV 相關(guān)HCC 關(guān)系較為密切的中藥。

1.7 預(yù)測(cè)中藥的評(píng)價(jià)與驗(yàn)證

對(duì)預(yù)測(cè)中藥的有效性采用Meta 分析進(jìn)行驗(yàn)證，以“肝癌”“中藥”“療效”等為檢索詞，檢索中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）、維普（VIP）、萬(wàn)方等中文數(shù)據(jù)庫(kù)，從各數(shù)據(jù)庫(kù)建庫(kù)到2022 年4 月20 日。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）研究對(duì)象：病理或臨床確診的HCC 患者；（2）干預(yù)方式：對(duì)照組采用單純TACE，觀察組采用中藥+TACE，中藥處方包含3 種及以上預(yù)測(cè)中藥。收集每項(xiàng)研究中第一作者姓名、發(fā)表時(shí)間、研究患者平均年齡、各組病例數(shù)等數(shù)據(jù)。觀察兩組治療后的實(shí)體瘤客觀緩解率（完全緩解+部分緩解）。采用STATA 17 軟件做Meta 分析。對(duì)結(jié)果進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)，若P＞0.10 且I2≤50%則認(rèn)為異質(zhì)性小，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析。如納入研究的文獻(xiàn)數(shù)≥10，采用“漏斗圖”檢查文獻(xiàn)是否存在發(fā)表偏倚。

2 結(jié)果

2.1 差異基因數(shù)據(jù)的獲取

GSE121248 芯片中共包含1 320 個(gè)DEGs，其中下調(diào)基因897 個(gè)，上調(diào)基因423 個(gè)；GSE47197 芯片含有DEGs1 178 個(gè)，其中下調(diào)基因953 個(gè),上調(diào)基因255 個(gè)。繪制了2 個(gè)芯片DEGs 的火山圖（圖1、圖2）。應(yīng)用Venny 軟件作圖（圖3）,得出2 個(gè)芯片的交集DEGs 403 個(gè)，包括上調(diào)基因82 個(gè)；下調(diào)基因321 個(gè)。

圖1 GSE121248 DEGs 火山圖

圖2 GSE47197 DEGs火山圖

圖3 交集DEGs Venn圖

2.2 差異基因的功能注釋

通過(guò)Metascape 在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)403 個(gè)交集DEGs 進(jìn)行功能注釋。GO 富集分析包括三方面：分子功能（MF），生物過(guò)程（BP），細(xì)胞組分（CC），其中MF 主要與氧化還原酶活性、CH-OH 供體組等功能有關(guān)；BP 主要與一元羧酸代謝、小分子分解代謝、烯屬化合物代謝過(guò)程等功能有關(guān)；CC 主要與細(xì)胞外基質(zhì)、血液微粒、膜攻擊復(fù)合物有關(guān)。KEGG 分析表明：視黃醇代謝、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、色氨酸代謝、PPAR 信號(hào)通路、p53 信號(hào)通路等為主要通路。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析與關(guān)鍵基因的篩選

將2.1 得 到 的403 個(gè) 交 集DEGs 導(dǎo) 入String在線數(shù)據(jù)庫(kù)，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，再將其數(shù)據(jù)傳入Cytoscape 3.8.1 軟件進(jìn)行可視化展示。利用CytoHubba 插件根據(jù)degree 進(jìn)行排名，選取排名前10 的基因作為關(guān)鍵基因，具體包括CDK1，CCNB1，AURKA，CCNB2，CDKN3，BIRC5，ESR1，NDC80，TPX2，ASPM。見圖4。

圖4 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 關(guān)鍵基因在肝癌組織與正常組織的表達(dá)差異

利用UCSC Xena 分析核心基因在原發(fā)性肝癌和正常組織的表達(dá)差異，除ESR1 在肝癌組織表達(dá)下降之外，其他9 個(gè)關(guān)鍵基因均在肝癌組織表達(dá)上調(diào)，經(jīng)檢驗(yàn)結(jié)果均為P＜0.001，提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 關(guān)鍵基因生存分析

利用Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)分析上述10個(gè)關(guān)鍵基因生存曲線，經(jīng)Logrank 檢驗(yàn)，P＜0.01，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 作用于關(guān)鍵基因的中藥預(yù)測(cè)

將2.3 篩選得出的 10 個(gè)關(guān)鍵基因輸入到Coremine Medical，共得出與HBV 相關(guān)HCC 有潛在治療作用的43 種中藥，具體見表1。

表1 中藥預(yù)測(cè)

2.7 系統(tǒng)評(píng)價(jià)

按納入標(biāo)準(zhǔn)，共檢索到文獻(xiàn)11 篇，見表2，經(jīng)異質(zhì)性檢驗(yàn)（P=0.99，I2=0.00%），采用固定效應(yīng)模型，結(jié)果顯示［OR=0.55，95%CI：（0.28，0.81）］，合并效應(yīng)檢驗(yàn)Z=4.00，P＜0.001，說(shuō)明觀察組顯著優(yōu)于對(duì)照組，見圖5。運(yùn)用STATA17 軟件進(jìn)行偏倚性檢測(cè)，結(jié)果11 個(gè)納入的研究分布在中心線兩側(cè)，大多位于漏斗圖偏上，均在95%置信區(qū)間內(nèi)，散點(diǎn)分布基本對(duì)稱，發(fā)表偏倚不明顯，見圖6。

表2 納入研究的基本特征

圖5 臨床總有效率Meta分析圖

圖6 偏倚分析圖

3 討論

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮作用，是促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生的主要的基因之一，CDK1 表達(dá)上調(diào)促進(jìn)肝細(xì)胞癌增殖失控，與肝細(xì)胞癌的組織病理學(xué)分級(jí)和進(jìn)展密切相關(guān)。cyclin B1 是細(xì)胞周期蛋白B1（CCNB1）表達(dá)的蛋白，其與CDK1 結(jié)合后，在細(xì)胞G2/M 期發(fā)揮作用，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期時(shí)相轉(zhuǎn)換，是促使細(xì)胞有絲分裂的關(guān)鍵因子。研究發(fā)現(xiàn)：與癌旁組織相較，肝癌組織中CCNB1 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，抑制CCNB1蛋白表達(dá)后肝癌細(xì)胞增殖能力明顯降低［14］，細(xì)胞周期蛋白B2（CCNB2）屬于B 類細(xì)胞周期蛋白家族，CCNB1 和CCNB2 共同完成促發(fā)細(xì)胞進(jìn)入G2/M期中的重要功能。CCNB2 可能通過(guò)增加JAG1 的表達(dá)而加速HCC 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［15］。HCC 的多種細(xì)胞系激光激酶A（AURKA）表達(dá)升高，且與HCC 分級(jí)和分期密切相關(guān)。敲除Aurora-A 可抑制HepG2 細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡［16］。周期素依賴性激酶抑制因子3（CDKN3）基因在肝癌中表達(dá)上調(diào)，引起細(xì)胞周期失去正常調(diào)控，導(dǎo)致肝癌的發(fā)生，并且在肝癌發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用［17］。桿狀病毒凋亡抑制蛋白5（BIRC5）屬于凋亡抑制蛋白家族，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，是目前抗凋亡作用最強(qiáng)的蛋白分子。BIRC5 在肝癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤預(yù)后有相關(guān)性［18］，核分裂周期蛋白80 (NDC80)在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)明顯高于相應(yīng)的臨近組織［19］。爪蟾驅(qū)動(dòng)樣蛋白2 靶向蛋白（TPX2）在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中起了重要作用，TPX2 基因嚴(yán)格調(diào)控極光激酶A（Aurora-A）的活性，精確控制細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程，在肝細(xì)胞癌的增殖凋亡過(guò)程中有重要作用［20］。異常紡錘體樣小頭畸形相關(guān)蛋白（ASPM）基因在肝癌樣本中表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤侵襲性顯著相關(guān)。ASPM 通過(guò)拮抗自噬介導(dǎo)的Dvl2 降解激活Wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展［21］。雌激素受體（ESR）是一類配體活化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，ESR1 基因組學(xué)的變異可能促進(jìn)HBV 相關(guān)HCC 的發(fā)生。ESR1 表達(dá)增加對(duì)總體生存有保護(hù)作用，當(dāng)女性缺乏編碼雌激素受體-α 的ESR1 時(shí),二乙基亞硝胺誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的程度明顯更大［22］。

本研究針對(duì)乙型肝炎相關(guān)肝細(xì)胞癌的預(yù)測(cè)中藥主要可以分為以下幾類：清熱解毒（冬凌草、半枝蓮、蟾酥、白花蛇舌草、苦參、山慈菇等），理氣和中（九香蟲、蠶沙、香櫞等），溫陽(yáng)散寒（吳茱萸、干姜、高良姜、補(bǔ)骨脂、菟絲子等），殺蟲藥（雷丸、使君子等）。紹峰等［23］將原發(fā)性肝癌分為幾個(gè)基本證候：肝膽濕熱、（肝）氣滯血瘀、（腎）陽(yáng)虛水停、（胃腸）陰虛證。由此可見，臨床診療肝癌當(dāng)以清熱解毒，溫陽(yáng)散寒，理氣和中等為主?，F(xiàn)代藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn)清熱解毒主要有抑制腫瘤的增值和侵襲，增強(qiáng)放化療療效，減輕患者癥狀的作用［24］。中醫(yī)認(rèn)為陽(yáng)虛氣化不足，內(nèi)生寒邪，“痰、濕、濁、毒、瘀”互結(jié)，形成腫塊。因此陽(yáng)虛寒凝為肝癌的核心病機(jī)，當(dāng)以扶陽(yáng)為基本治法。溫陽(yáng)散寒為主的中藥如吳茱萸、干姜、仙茅、補(bǔ)骨脂、淫羊藿等，實(shí)驗(yàn)證實(shí)可以直接抑制或破壞肝癌細(xì)胞，抑制血管形成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［25］。臨床運(yùn)用中藥治療肝細(xì)胞癌時(shí)，于寒涼之中加入少量辛溫之品，如淫羊藿、桂枝、干姜等，即可佐制清熱解毒藥的寒涼，又可助陽(yáng)化氣，溫化癌毒，更好發(fā)揮中藥抗癌功效。在肝癌治療過(guò)程中當(dāng)注重健脾理氣，肝脾同治。肝癌病位在肝，涉及脾肺腎，尤其要重視脾胃，在肝癌發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段，都可出現(xiàn)脾虛氣滯，在治療肝癌的中藥處方中，加用九香蟲、蠶沙、香櫞等理氣和中藥物，有助于調(diào)和肝脾，從而減輕患者癥狀，提高臨床療效。

本研究預(yù)測(cè)得到中藥有43 種，大多是臨床常用的藥品，其中少部分中藥如野馬追、木鱉子、土木香、狼毒、救必應(yīng)、使君子、雷丸等臨床極少運(yùn)用。分析原因可能與醫(yī)家用藥習(xí)慣，非藥房常備藥等有關(guān)，同時(shí)這些中藥均有一定的毒性。本研究探討了其治療肝癌的可能機(jī)制，下一步將通過(guò)現(xiàn)代藥理學(xué)和臨床研究，明確其療效與安全性。

本研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎相關(guān)肝細(xì)胞癌發(fā)生關(guān)鍵基因 有CDK1，CCNB1，AURKA，CCNB2，CDKN3，BIRC5，ESR1，NDC80，TPX2，ASPM。除ESR1 在肝癌組織表達(dá)下降之外，其他9 個(gè)關(guān)鍵基因均在肝癌組織表達(dá)上調(diào)，預(yù)測(cè)得到43 味中藥，經(jīng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)分析證實(shí)了其有效性。