腦膠質(zhì)瘤中MAGE-D4和CORO1C mRNA表達水平及其臨床意義

張 沅， 張鵬博， 謝 歡， 韋 興， 李 楓， 劉 暢， 沈 寧， 王燕靖， 農(nóng)蔚霞， 張慶梅

腦膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)惡性腫瘤。近年來，盡管手術(shù)輔以放療和化療的傳統(tǒng)治療方法取得了較大進展，但腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后并未得到明顯改善。因此，探究腦膠質(zhì)瘤的病理分子機制，為開展新的腦膠質(zhì)瘤輔助治療奠定基礎(chǔ)尤其重要。黑色素瘤相關(guān)抗原(melanoma-associated antigen,MAGE)是一擁有多個成員的大家族，因其許多成員在多種腫瘤組織中高表達，而在除睪丸和胎盤以外的正常組織中不表達或低表達，故被視為腫瘤分子靶向治療的理想靶點。MAGE-D4是2001年Sasaki等采用基因表達系列分析技術(shù)鑒定出的一個MAGE家族成員，起初命名為MAGE-E1，后來發(fā)現(xiàn)其基因組結(jié)構(gòu)及染色體定位與MAGE-D1非常相似，因此被歸入MAGE-D亞家族，并改名為MAGE-D4。研究顯示，MAGE-D4不表達或極低表達于正常腦組織，但高表達于腦膠質(zhì)瘤，且沉默MAGE-D4表達可抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的惡性生物學(xué)行為，而過表達MAGE-D4則起到促進作用。為進一步了解MAGE-D4對腦膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為的影響及其分子機制，本課題組前期通過RNA-seq高通量測序發(fā)現(xiàn)沉默MAGE-D4表達可抑制肌動蛋白結(jié)合蛋白CORO1C的表達。鑒此，本研究旨在通過基因表達譜交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)數(shù)據(jù)庫、逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)和小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)相結(jié)合的方式進一步探討MAGE-D4與CORO1C的關(guān)聯(lián)性及其臨床意義，為腦膠質(zhì)瘤分子靶向治療的靶點篩選提供參考。

1 資料與方法

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GEPIA數(shù)據(jù)庫資料GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)是一個整合了癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和基因型-組織表達(Genotype-Tissue Expression，GTEx)項目的基因表達譜數(shù)據(jù)的公共數(shù)據(jù)庫。本研究采用單基因分析方法，輸入“MAGE-D4”或“CORO1C”后，選擇低級別腦膠質(zhì)瘤(low-grade glioma，LGG)和膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma，GBM)這兩種腦膠質(zhì)瘤類型，其中LGG 518例，GBM 163例。另選擇正常腦組織樣本數(shù)據(jù)207例作為對照。

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組織標(biāo)本和臨床資料 選擇2008年1月至2018年12月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科經(jīng)手術(shù)切取的組織標(biāo)本73例，其中腦膠質(zhì)瘤62例，正常腦組織11例。腦膠質(zhì)瘤經(jīng)病理檢查確診。患者中男35例，女27例，年齡2～78歲，中位年齡40歲；病理類型包括星形細胞瘤41例，GBM 12例，少突膠質(zhì)細胞瘤5例和室管膜瘤4例；根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)分級方法，Ⅰ～Ⅱ級(LGG)36例，Ⅲ～Ⅳ級(高級別腦膠質(zhì)瘤)26例。所有腦膠質(zhì)瘤患者在手術(shù)前未接受放射和化學(xué)治療。正常腦組織來源于顱腦外傷行內(nèi)減壓手術(shù)患者。標(biāo)本離體后迅速置液氮速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)錂z。以MAGE-D4和CORO1C mRNA表達水平的中位數(shù)將其分為高表達組和低表達組。以上所有組織標(biāo)本的收集均經(jīng)患者知情同意，本研究獲廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(編號：20200040)。

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細胞實驗

1.3.1 細胞培養(yǎng) 人腦膠質(zhì)瘤細胞株U87 MG和U251購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細胞庫。以DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)、10%胎牛血清(Gibco公司)配制完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱(New Brunswick公司)條件設(shè)置為37 ℃，5% CO。

1.3.2 轉(zhuǎn)染 于轉(zhuǎn)染前24 h，將細胞以3×10cells/孔接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到70%左右時，更換新鮮無血清培養(yǎng)基，加入Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)與siRNA的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，孵育6 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞，進行干擾效率確認及后續(xù)檢測實驗。siRNA由吉瑪基因股份有限公司合成，MAGE-D4特異性siRNA(MAGE-D4 siRNA)序列與陰性對照序列(不含MAGE-D4相關(guān)序列)見表1。

表1 siRNA序列

名 稱序列(5'-3')MAGE-D4 siR-NASense:GUGCAAUCGGAAAGCUACATTAntisense:UGUAGCUUUCCGAUUGCACGC陰性對照Sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUTTAntisense:ACGUGACACGUUCGGAGAATT

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RT-qPCR法檢測MAGE-D4和CORO1C mRNA的表達水平 應(yīng)用細胞/組織總RNA提取試劑盒(Vazyme公司)提取組織標(biāo)本和腦膠質(zhì)瘤細胞株的總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。應(yīng)用超微量分光光度計(天根生化科技有限公司)檢測所提RNA的濃度和純度，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。確定RNA無降解后，應(yīng)用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR試劑盒(Vazyme公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用LightCycler480II熒光定量PCR儀(Roche公司)進行RT-qPCR，每個樣品作3個復(fù)孔。反應(yīng)體系：SYBR Green I Master 10 μl，ddHO 7.2 μl，上、下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。參考相關(guān)文獻設(shè)計引物，其序列見表2。以GAPDH為內(nèi)參，采用2法計算MAGE-D4和CORO1C的相對表達量。

表2 RT-qPCR引物序列

基因名上游序列下游序列MAGE-D45'-CCAGAATCAGAACCGAGA-3'5'-CCAAAATCTCCGTCCTCA-3'CORO1C 5'-TCCTCCCTCTGCACAAGACT-3'5'-GGATCTGCCATACCATGACC-3'GAPDH 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'

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統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用成組

t

檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，以SNK檢驗進行組間兩兩比較。計數(shù)資料以例數(shù)(百分率)[

n

(%)]表示，組間比較采用

χ

檢驗。采用Pearson相關(guān)分析探討MAGE-D4與CORO1C mRNA表達水平的相關(guān)性。

P

<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2

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腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-D4和CORO1C mRNA的表達情況 基于GEPIA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示，GBM、LGG組織中MAGE-D4和CORO1C mRNA的表達水平均高于正常腦組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。見圖1。針對臨床樣本的RT-qPCR檢測結(jié)果也顯示，腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-D4和CORO1C mRNA的表達水平高于正常腦組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，其表達水平分別是正常腦組織的3.038倍和3.713倍。見圖2。

經(jīng)單因素方差分析，*P<0.05

圖2 腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織MAGE-D4和CORO1C mRNA表達水平比較圖

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MAGE-D4和CORO1C表達水平與腦膠質(zhì)瘤患者臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 MAGE-D4及CORO1C mRNA的表達水平與患者年齡、性別、WHO分級、病理類型、卡氏評分(Karnofsky performance score,KPS)、腫瘤最長徑，以及Ki-67、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、S-100和波形蛋白(Vimentin)的表達水平均無關(guān)聯(lián)性(

P

>0.05)。見表3，4。

表3 MAGE-D4表達水平與腦膠質(zhì)瘤患者臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果[(%)]

組 別例數(shù)性別年齡(歲)WHO分級病理類型男女<40≥40Ⅰ～Ⅱ級Ⅲ～Ⅳ級星型細胞瘤GBM少突膠質(zhì)細胞瘤室管膜瘤高表達組3117(54.84)14(45.16)16(51.61)15(48.39)22(70.97)9(29.03)25(80.64)4(12.90)1(3.23) 1(3.23)低表達組3118(58.06)13(41.94)15(48.39)16(51.61)15(48.39)16(51.61)16(51.61)8(25.81)4(12.90)3(9.68)χ2-1.550.0653.2845.824P-0.7980.7990.0700.117組 別例數(shù)KPS(分)腫瘤最長徑(cm)Ki-67#(%)GFAP#S-100#Vimentin#<70≥70<5≥5<10≥10低表達高表達低表達高表達低表達高表達高表達組3114(45.16)17(54.84)12(38.71)19(61.29)14(56.00)11(44.00)21(84.00)4(16.00)19(95.00)1(5.00) 18(85.71)3(14.29)低表達組3117(54.84)14(45.16)16(51.61)15(48.39)10(43.48)13(56.52)24(88.89)3(11.11)20(86.96)3(13.04)22(100.00)0(0.00)χ2-0.5811.0420.751---P-0.4460.3070.3860.698*0.610*0.108*

注：部分患者缺失Ki-67、GFAP、S-100、Vimentin指標(biāo)的檢查結(jié)果數(shù)據(jù)，不納入分析；GFAP、S-100和Vimentin以(-)和(+)作為低表達，(++)和(+++)作為高表達；為Fisher′s確切概率法所得值

表4 CORO1C表達水平與腦膠質(zhì)瘤患者臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果[(%)]

組 別例數(shù)性別年齡(歲)WHO分級病理類型男女<40≥40Ⅰ～Ⅱ級Ⅲ～Ⅳ級星型細胞瘤GBM少突膠質(zhì)細胞瘤室管膜瘤高表達組3119(61.29)12(38.71)18(58.06)13(41.94)22(70.97)9(29.03)23(74.20)4(12.90)2(6.45)2(6.45)低表達組3116(51.61)15(48.39)13(41.94)18(58.06)15(48.39)16(51.61)18(58.06)8(25.81)3(9.68)2(6.45)χ2-0.5901.6133.2842.280P-0.4420.2040.0700.527*組 別例數(shù)KPS(分)腫瘤最長徑(cm)Ki-67#(%)GFAP#S-100#Vimentin#<70≥70<5≥5<10≥10低表達高表達低表達高表達低表達高表達高表達組3115(48.39)16(51.61)14(45.16)17(54.84)15(57.69)11(42.31)22(88.00)3(12.00)19(90.48)2(9.52)21(91.30)2(8.70)低表達組3116(51.61)15(48.39)14(45.16)17(54.84)9(40.91)13(59.09)23(85.19)4(14.81)20(90.91)2(9.09)19(95.00)1(5.00)χ2-0.0650.5811.3430.081--P-0.7990.4460.2470.7761.000*1.000*

注：部分患者缺失Ki-67、GFAP、S-100、Vimentin指標(biāo)的檢查結(jié)果數(shù)據(jù)，不納入分析；GFAP、S-100和Vimentin以(-)和(+)作為低表達，(++)和(+++)作為高表達；為Fisher′s確切概率法所得值

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腦膠質(zhì)瘤組織MAGE-D4與CORO1C mRNA表達水平的相關(guān)性分析結(jié)果 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，臨床腦膠質(zhì)瘤樣本組織中MAGE-D4與CORO1C mRNA表達水平呈正相關(guān)(

r

=0.848，

P

=0.000)。

2

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沉默腦膠質(zhì)瘤細胞株MAGE-D4表達對CORO1C表達的影響 細胞實驗結(jié)果顯示，經(jīng)MAGE-D4 siRNA沉默后，U87 MG和U251細胞CORO1C mRNA的表達水平顯著下降(

P

<0.05)。見圖3。

圖3 沉默腦膠質(zhì)瘤細胞株MAGE-D4表達后CORO1C的表達情況圖

3 討論

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目前臨床上對腦膠質(zhì)瘤的治療仍采用手術(shù)輔以放射和化學(xué)治療為主，但由于腦膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，與周圍正常組織無明確邊界，手術(shù)難以完全切除腫瘤。雖然殘余的腫瘤細胞可以通過術(shù)后放療和化療來清除，但由于血-腦屏障的阻隔、治療特異性及耐藥性等問題，其療效不佳。因此，腦膠質(zhì)瘤患者，尤其是惡性程度高的GBM患者預(yù)后較差，復(fù)發(fā)率也較高。腫瘤分子靶向治療是其中一種正在發(fā)展中的新輔助治療方法，但開展腫瘤分子靶向治療需要篩選腫瘤特異性分子。

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MAGE家族是目前研究較深入的一類腫瘤相關(guān)抗原分子，其許多成員被認為是腫瘤生物治療的理想靶抗原。目前其一些成員如MAGE-A1和MAGE-A3已應(yīng)用于臨床試驗，在一些顱外腫瘤輔助治療中顯示出較好的療效。然而，由于腦膠質(zhì)瘤中MAGE-A等的表達率遠低于非神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，這嚴(yán)重制約了MAGE-A等分子在腦膠質(zhì)瘤分子靶向治療中的應(yīng)用。MAGE-D4是從GBM中鑒定出的一個MAGE成員，有研究顯示，MAGE-D4在許多腫瘤中特異性高表達。在本研究中，GEPIA數(shù)據(jù)庫分析及臨床樣本驗證結(jié)果均顯示MAGE-D4在腦膠質(zhì)瘤特異性高表達，這與相關(guān)研究報道結(jié)果相似。此外，關(guān)于MAGE-D4的生物學(xué)功能，有文獻報道顯示，MAGE-D4的表達水平與腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為呈正關(guān)聯(lián)，這提示MAGE-D4屬于腦膠質(zhì)瘤特異性分子，在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，具有成為腦膠質(zhì)瘤分子靶向治療靶點的潛力。

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腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及多分子的參與及相互作用，為了尋找與MAGE-D4相互作用的分子，本研究團隊前期對MAGE-D4沉默的腦膠質(zhì)瘤細胞進行RNA-seq高通量篩選，發(fā)現(xiàn)MAGE-D4沉默后下調(diào)的差異表達基因功能主要與肌動蛋白、微絲和細胞骨架的結(jié)合相關(guān)，且MAGE-D4沉默后，CORO1C表達明顯下調(diào)。目前已知CORO1C是哺乳動物七種冠蛋白中被報道與腫瘤關(guān)系最為密切的一種分子，其可與F-肌動蛋白結(jié)合、交聯(lián)，以直接或間接的方式調(diào)控細胞骨架的動態(tài)重塑，而細胞骨架的重塑與腫瘤細胞的遷移和侵襲等惡性運動行為密切相關(guān)。目前已有文獻證實CORO1C在多種腫瘤中異常高表達，且與腫瘤的惡性表型和進展相關(guān)。本研究結(jié)果顯示CORO1C在腦膠質(zhì)瘤中呈高表達，與Thal等報道的結(jié)果相似。有研究顯示，CORO1C表達與彌漫性腦膠質(zhì)瘤的惡性程度相關(guān)，高級別腦膠質(zhì)瘤中CORO1C呈強陽性表達，而LGG中CORO1C呈弱陽性表達。此外，CORO1C也可通過調(diào)控細胞骨架影響GBM的增殖、遷移、侵襲性偽足形成及基質(zhì)金屬蛋白酶分泌。以上結(jié)果提示CORO1C在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

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本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-D4 mRNA和CORO1C mRNA表達水平呈正相關(guān)，且經(jīng)沉默腦膠質(zhì)瘤細胞株MAGE-D4的表達后，CORO1C表達也隨之下調(diào)，提示MAGE-D4與CORO1C之間存在相互作用，其可能共同影響了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展?？赡苁茄芯坎±龜?shù)較少且臨床資料不夠完善的緣故，本研究未發(fā)現(xiàn)MAGE-D4和CORO1C的表達水平與腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病理特征存在關(guān)聯(lián)。這有待通過加大樣本量進行前瞻性觀察研究以進一步驗證其二者與臨床病理及患者預(yù)后的關(guān)系。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤中MAGE-D4和CORO1C mRNA均呈高表達，且二者表達水平呈正相關(guān)，其可能共同參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展。但具體的分子作用機制仍需進一步探討，從蛋白相互作用和競爭性內(nèi)源RNA分子機制等方面展開研究。