桑白皮炒制前后HPLC 指紋圖譜比較研究*

趙子楠，閆立文，趙 凱，3△

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2 河北凱盛醫(yī)藥科技有限公司；3 江西歐氏藥業(yè)有限責(zé)任公司

桑白皮又名桑根白皮、白桑皮，為桑科植物桑Morus albaL. 的干燥根皮。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。桑白皮性寒味甘，歸肺經(jīng)，具瀉肺平喘、利水消腫功效，主治肺熱喘咳，水腫，尿少等證［1-2］?，F(xiàn)代研究表明，桑白皮的化學(xué)成分豐富，主要含有黃酮類、酚酸類、生物堿類等化合物［3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明桑白皮及其活性成分具有抗癌、抗病毒、降血糖、鎮(zhèn)痛抗炎、祛痰等多種藥理活性［4］。

國(guó)家中醫(yī)藥管理局在2018 年4 月公布了《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》（以下簡(jiǎn)稱《目錄》），瀉白散為《目錄》中第40 個(gè)處方，處方組成中以桑白皮為君藥，其炮制程度被描述為“細(xì)銼炒黃”。炒桑白皮為遵古炮制，與我國(guó)現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）中收載的飲片類型桑白皮和蜜桑白皮不同。炒桑白皮的炮制方式最早出現(xiàn)在宋代《博濟(jì)方》，曰“剉炒”，后被歷代沿用。對(duì)于其炮制程度，明代《證治準(zhǔn)繩》、清代《小兒藥證直訣》聚珍本及現(xiàn)行《 中藥炮制經(jīng)驗(yàn)集成》中均提到為“炒黃”［5-7］。

炮制工藝不同往往帶來藥效以及化學(xué)成分的差異［8-10］。桑白皮化學(xué)成分豐富，很難用一種或幾種化學(xué)成分反映其藥材質(zhì)量，指紋圖譜是國(guó)內(nèi)外廣泛認(rèn)可的一種中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式。桑白皮的HPLC 指紋圖譜多集中于成方制劑以及蜜炙前后的指紋圖譜研究，有關(guān)炒桑白皮的指紋圖譜研究尚未見報(bào)道。目前，指紋圖譜結(jié)合模式識(shí)別方法已廣泛應(yīng)用于中藥材的質(zhì)量控制、來源分析及差異標(biāo)志物篩選等方面，可有效對(duì)中藥材炮制前后的生品及制品進(jìn)行判別分析和質(zhì)量評(píng)價(jià)［11-13］。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)桑白皮和炒桑白皮指紋圖譜進(jìn)行了比較研究，結(jié)合主成分分析PCA 和線性判斷分析LDA兩種降維分類方法，對(duì)其共有的化學(xué)組分進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，嘗試探索其化學(xué)組分的變化規(guī)律［14-16］，以期為桑白皮及炒桑白皮質(zhì)量控制提供參考，給經(jīng)典名方的研發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器L-3000 型高效液相色譜儀（北京普源精電科技有限公司）；YMC Hydrosphere C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；CP225D 型電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；電子調(diào)溫電熱套（天津泰斯特儀器有限公司）；Anke TDL-16G 型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；GR200B型高速粉碎機(jī)（合肥榮事達(dá)小家電有限公司）。

1.2 試藥桑皮苷A 對(duì)照品（成都德思特生物科技有限公司，批號(hào)：DST190408-068，純度≥98%）；桑根酮C 對(duì)照品（成都德思特生物科技有限公司，批號(hào)：DST180626-168，純度≥98%）；綠原酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-201415，純度≥96.2%）；桑辛素對(duì)照品（成都德思特生物科技有限公司，批號(hào)：DST180729-069,純度≥98%）；乙腈為色譜醇(RCIlabscan,批號(hào)：19050134）；三氟乙酸為分析純（天津科密歐化學(xué)試劑有限責(zé)任公司，批號(hào)：20190817）；水為哇哈哈純凈水。10 批桑白皮藥材經(jīng)河北科技大學(xué)李建晨副教授鑒定為桑科植物桑的干燥根皮，樣品信息見表1。

表1 桑白皮樣品來源

1.3 方法

1.3.1 炮制品的制備 取桑白皮飲片（編號(hào)S1～S10），微火炒至表面微黃色或微具焦斑時(shí)，取出放涼，得炒桑白皮飲片（編號(hào)C1～C10）。分別取桑白皮和炒桑白皮飲片，粉碎，過一號(hào)篩，備用。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取桑皮苷A 對(duì)照品約20 mg，綠原酸對(duì)照品約20 mg，桑根酮C 對(duì)照品約10 mg，桑辛素對(duì)照品20 mg，置于50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。各分別精密量取桑皮苷A 對(duì)照品儲(chǔ)備液、桑辛素對(duì)照品儲(chǔ)備液及綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，桑根酮C 對(duì)照儲(chǔ)備液2 mL 置10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照溶液，冷藏備用。

1.3.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取S1～S10，C1～C10 粉末各1.2 g（一號(hào)篩），置50 mL 錐形瓶中，精密加入80% 甲醇（體積比）30 mL，水浴回流60 min。過濾，濾液經(jīng)離心半徑4 cm，3000 r/min離心5 min，取上清液過0.4 μm微孔濾膜即得相應(yīng)的供試品溶液。

1.3.4 色譜條件 色譜柱：YMC Hydrosphere C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；體積流量：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：20 μL；流動(dòng)相：乙腈-水（0.5% 三氟乙酸），梯度洗脫，信號(hào)采集時(shí)間：105 min。見表2。

表2 流動(dòng)相梯度變化

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批炒桑白皮樣品（C3），按“1.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，按“1.3.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各色譜圖的相似度不低于0.995；選擇峰面積較大，分離度良好的以7號(hào)峰桑根酮C作為參照峰（S），計(jì)算各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果其RSD 分別小于0.3% 和小于1.5%，符合指紋圖譜技術(shù)要求，表明儀器精密度良好。

1.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批炒桑白皮樣品（C3）6 份，按“1.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，按“1.3.4”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)指紋圖譜。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各色譜圖的相似度不低于0.995；以7 號(hào)峰桑根酮C 為參照峰（S），計(jì)算各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果其RSD 分別小于0.6%和1.2%，符合指紋圖譜技術(shù)要求，表明該方法重復(fù)性良好。

1.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批炒桑白皮供試品溶液（C3），于制備后的0、4、10、18、22、34、60 h 進(jìn)樣檢測(cè)，按“1.3.4”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)指紋圖譜。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示，各色譜圖的相似度不低于0.995；以7 號(hào)峰桑根酮C 為參照峰（S），分別計(jì)算各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果其RSD 分別小于0.7% 和小于1.5%，表明供試品溶液在60 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.5 數(shù)據(jù)分析采用國(guó)家藥典委員會(huì)編制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）軟件、SPSS 22.0 軟件及PAST 3 軟件對(duì)桑白皮及炒桑白皮HPLC的共有峰進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)、PCA及LDA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜的建立將20 批桑白皮、炒桑白皮樣品，分別按照“2.3”項(xiàng)下方法制備各供試品溶液，按照“1.3.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行HPLC 測(cè)定與分析，采集105 min色譜圖，導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版），分別以C4 和S4的圖譜為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法，對(duì)其共有峰進(jìn)行特征峰匹配，生成各自的對(duì)照?qǐng)D譜，均有8 個(gè)共有峰。通過與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出其中兩個(gè)成分，7號(hào)峰為桑根酮C，8號(hào)峰為桑辛素，選擇分離度良好，峰面積較大，保留時(shí)間適宜的7 號(hào)峰作為參照峰，分別計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間。見圖1—3和表3—4。

表3 炒桑白皮共有峰相對(duì)保留時(shí)間 min

圖1 混合對(duì)照品溶液HPLC圖

圖2 炒桑白皮HPLC指紋圖譜

圖3 桑白皮HPLC指紋圖譜

表4 桑白皮共有峰相對(duì)保留時(shí)間 min

2.2 相似度評(píng)價(jià)采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）對(duì)S1～10、C1～10樣品指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，可知桑白皮相似度為0.814～0.972，炒桑白皮相似度為0.819～0.972，從相似度波動(dòng)情況看，炒桑白皮略小于桑白皮，特別是產(chǎn)地為安徽的4 批桑白皮，炒制后相似度差異小于炒制前。說明桑白皮炒制后化學(xué)成分發(fā)生了一定的變化，經(jīng)炒制后整體品質(zhì)趨于穩(wěn)定和統(tǒng)一。見表5。

表5 桑白皮和炒桑白皮相似度

2.3 主成分分析（PCA）將S1～10、C1～10 樣品的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件，根據(jù)共有峰匹配數(shù)據(jù)得到一個(gè)8×20的共有峰峰面積矩陣，對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，得到主成分的特征值及載荷矩陣。見表6—8。

表6 桑白皮和炒桑白皮共有峰峰面積 mV

表7 桑白皮和炒桑白皮的PCA特征值

表8 桑白皮和炒桑白皮的因子載荷矩陣

選取前兩個(gè)特征值＞1 的成分為主成分，其方差累計(jì)貢獻(xiàn)值為76.186%，說明前4個(gè)因子在反映桑白皮炒制前后與8 個(gè)共有成分的相互關(guān)系中起主導(dǎo)作用，能夠評(píng)價(jià)桑白皮生品與炒制品的品質(zhì)。其中，第1 主成分的獨(dú)立貢獻(xiàn)率為48.469%，主要代表第2、3、4、5共有峰的信息，主成分2主要代表第1、6、7、8 共有峰的信息。表明通過PCA 分析降維處理后所提取的主成分能夠代表桑白皮指紋圖譜中8 個(gè)共有峰的主要信息。對(duì)前2 個(gè)主成分計(jì)算得到桑白皮及其炒制品的主成分得分，以主成分1 和主成分2 的得分分別作為X軸和Y軸，得到桑白皮及其炒制品的PCA 投影?？梢娚０灼づc炒桑白皮未完全分開，存在一定的交叉。S1 和C1，S2和C2，S4和C4，S5和C5的距離較近，說明這幾批藥材炒制前后變化較小，而其余批次的生品與炒制品距離較遠(yuǎn)，炒制前后產(chǎn)生的變化較大。把桑白皮和炒桑白皮分別做了凸多邊形處理，桑白皮所圍成的區(qū)域面積略大于炒桑白皮所圍成的面積，說明桑白皮批次間的差異略大于炒桑白皮批次間差異。見圖4。

圖4 桑白皮和炒桑白皮的PCA得分投影圖

2.4 線性判別分析（LDA）

2.4.1 桑白皮與炒桑白皮炒制前后線性判別 將表6中共有峰數(shù)據(jù)分為兩組，組1（炒桑白皮），組2（桑白皮），進(jìn)行線性判別分析，所得模型的準(zhǔn)確率為90%，內(nèi)部交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率為45%。

2.4.2 不同產(chǎn)地桑白皮和炒桑白皮的線性判別 將S1～10、C1～10 樣品按產(chǎn)地分為5 組進(jìn)行LDA 分析，所得模型的分類結(jié)果準(zhǔn)確率為95%，內(nèi)部交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率為55%。共得到4 個(gè)判別式函數(shù)，前兩個(gè)函數(shù)的方差貢獻(xiàn)率累積92.2%，計(jì)算桑白皮及其炒制品每一批次在函數(shù)1 和函數(shù)2 的判別得分，以函數(shù)1 為X 軸，函數(shù)2 的得分為Y 軸，得到LDA投影圖，見圖5。

圖5 桑白皮和炒桑白皮的LDA分析

可見主成分-線性判別模型對(duì)于炒制前后的桑白皮的預(yù)測(cè)區(qū)別精確度低。無法通過主成分-線性判別分析法對(duì)二者進(jìn)行有效區(qū)分。

3 討論

本試驗(yàn)比較了4 個(gè)流動(dòng)相體系：乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.5%醋酸水、乙腈-0.5%三氟乙酸水。結(jié)果表明，乙腈-0.5% 三氟乙酸水系統(tǒng)為流動(dòng)相時(shí)，各色譜峰分離效果較好，峰型對(duì)稱且穩(wěn)定，因此選擇乙腈-0.5% 三氟乙酸水系統(tǒng)為流動(dòng)相。

相似度、PCA及LDA模型三者均可用于桑白皮質(zhì)量評(píng)價(jià)分析。桑白皮和炒桑白皮相似度均大于0.80，說明各自組內(nèi)具有較高的相似性；PCA 和LDA 投影圖可見桑白皮和炒桑白皮互相交錯(cuò)的情況，嘗試建立的LDA 模型準(zhǔn)確率較小，說明這些樣品在多個(gè)維度上具有較高的相似性，不易找到合適的區(qū)分方法，這可能與樣品的處理方法有關(guān)，目前正在采用冷提取的方式進(jìn)行研究。

通過本研究結(jié)果可知，桑白皮和炒桑白皮二者的指紋圖譜保留時(shí)間變化不大，峰的個(gè)數(shù)無明顯差異，共有峰的峰面積在炒制前后有所改變，經(jīng)炒制后整體品質(zhì)趨向于統(tǒng)一，說明炒制對(duì)桑白皮有一定作用，但無明顯的趨勢(shì)呈現(xiàn)，這與李群等［17］對(duì)于桑白皮蜜炙前后的指紋圖譜研究結(jié)果高度相似。桑白皮中發(fā)揮止咳平喘作用的關(guān)鍵化合物是東莨菪內(nèi)酯，徐小飛等［18］發(fā)現(xiàn)蜜炙后東莨菪內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有增加，而李群等［17］的研究得出相反結(jié)論，發(fā)現(xiàn)蜜炙后東莨菪內(nèi)酯呈下降趨勢(shì)，提示應(yīng)結(jié)合含量測(cè)定對(duì)炒桑白皮炮制工藝作進(jìn)一步深入研究。有文獻(xiàn)顯示，桑白皮炒制性寒偏平，降氣平喘力勝，多用于水飲停肺。蜜炙藥味甘，性寒偏潤(rùn)，潤(rùn)肺清熱，止咳平喘力強(qiáng)，多用于肺熱咳喘［18-19］。提示需通過藥理作用來探究經(jīng)典名方瀉白散中使用“蜜桑白皮”和“炒桑白皮”的合理性。

本試驗(yàn)以安徽產(chǎn)桑白皮為主要采集品種，同時(shí)收集了四川、河南、河北、安徽等地共10 批樣品，涵蓋了主產(chǎn)區(qū)和道地產(chǎn)區(qū)，在產(chǎn)地和質(zhì)量方面具有代表性。本試驗(yàn)建立了桑白皮及炒桑白皮二者的指紋圖譜，并同時(shí)進(jìn)行PCA及LDA分析。探索桑白皮炒制前后的質(zhì)量變化規(guī)律。雖然目前發(fā)現(xiàn)二者在化學(xué)成分上有較大一致性。但指紋圖譜專屬性較強(qiáng)，測(cè)定方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，重復(fù)性較好，對(duì)探索瀉白散的桑白皮炒制炮制方式仍有一定的參考意義。而確定炒桑白皮炮制的具體工藝條件對(duì)規(guī)范炮制方法、提高經(jīng)典名方瀉白散質(zhì)量非常重要，本課題將進(jìn)一步深入研究。