王鑫鑫 李茜茜 呂 毅 馬文鋒 武曉紅 趙芙蓉

(河南科技大學動物科技學院，洛陽 471023)

豆粕是動物飼糧中蛋白質的主要來源。我國是蛋白質資源相對短缺的國家，豆粕的對外依存度也隨著畜牧業(yè)的發(fā)展大大增加，2017年我國大豆進口量高達9 554萬t。同時，我國肉雞養(yǎng)殖主要是以玉米-豆粕型飼糧為代表的高蛋白質飼糧，這雖然保證了肉仔雞快速生長，但也造成了氮的過量排放和蛋白質資源的浪費。因此，如何合理利用蛋白質、減少資源浪費成為研究的熱點[1]。在畜禽養(yǎng)殖中，動物自身不能完全消化飼糧中的蛋白質，而未消化的蛋白質會作為單胃動物腸道微生物的發(fā)酵底物導致動物消化紊亂[2]。研究表明，蛋白酶作為飼料添加劑可以有效地提高飼糧蛋白質的利用效率，從而改善動物采食[3]。外源蛋白酶可以補充幼齡動物內源酶分泌的不足，提高蛋白質的消化吸收，降低腸道吸收蛋白質的壓力[4]。蛋白質水平對雞的采食行為有著重要的影響[5]。研究還表明，蛋白酶對雞的血液生化指標存在顯著影響[6-7]。除此之外，侯振平等[8]研究表明，蛋白酶對動物的腸道健康存在積極影響，可以改善雞的腸道形態(tài)。由此可見，蛋白酶可以提高動物對蛋白質的消化吸收，提高蛋白質利用率，對肉雞福利起到積極作用的同時避免蛋白質資源浪費。為了進一步驗證組合蛋白酶在肉雞飼糧中的添加效果，本試驗以愛拔益加(AA)肉仔雞作為研究對象，探討組合蛋白酶對肉仔雞采食偏好性、血清生化指標和腸道組織形態(tài)的影響，從而為組合蛋白酶的合理利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用組合蛋白酶從市場上購得，為堿性蛋白酶，呈粉狀固體，酶活性為251 852 U/g。試驗采用玉米-豆粕型基礎飼糧，參照《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

1.2 試驗設計

1.2.1 試驗1

選擇1日齡體況相近、健康的AA肉仔雞40只，隨機分為4個處理，每個處理10只雞，每個處理的肉雞單獨飼養(yǎng)于同一籠中。采用自由選擇試驗法，同時為4個處理的肉雞飼喂基礎飼糧(飼糧Ⅰ)以及在基礎飼糧中分別添加4(飼糧Ⅱ)、8(飼糧Ⅲ)和12 U/g(飼糧Ⅳ)組合蛋白酶的飼糧。試驗雞自由采食和飲水，試驗期42 d。

1.2.2 試驗2

采用單因素完全隨機試驗設計，選擇1日齡體況相近、健康的AA肉仔雞240只，隨機分為4個組，每組6個重復，每個重復10只雞。對照組(Ⅰ組)飼喂基礎飼糧，試驗組(Ⅱ～Ⅳ組)分別飼喂在基礎飼糧中添加4、8和12 U/g組合蛋白酶的飼糧。試驗雞自由采食和飲水，試驗期42 d。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在河南科技大學牧場進行，肉仔雞均飼養(yǎng)在規(guī)格相同的籠內，飼養(yǎng)密度為10 只/m2。人工控制舍內溫度，仔雞1～3日齡時，舍內溫度控制不低于35 ℃；4～7日齡時舍內溫度控制在32～33 ℃；自第2周開始，每周降低3 ℃左右，直至保持在22～24 ℃為止。同時，保證舍內相對濕度維持在50%左右。雞舍采用16 h光照和8 h黑暗的光照制度，自然通風與機械通風相結合，定期打掃雞舍衛(wèi)生[9]。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 采食偏好性

試驗1中，試驗雞于每周的最后1天測定飼糧的耗料量，同時使用小蟻智能攝像機(夜視版)對其進行24 h連續(xù)拍攝記錄，試驗錄像在計算機上轉換后使用The Observer XT 12行為分析軟件(Noldus，荷蘭)進行連續(xù)采樣和瞬時采樣分析。采用連續(xù)采樣法分析肉仔雞對4種飼糧的采食行為發(fā)生的總采食時間、每頓采食時間以及采食次數(shù)；采用瞬時采樣法，每隔30 min進行1次采樣，分析每種飼糧的采食雞只數(shù)，計算4種飼糧的采食百分比。

1.4.2 血清生化指標

試驗2中，于21和42日齡時，每個重復隨機選取2只雞，采用翅下靜脈采血法進行采血，每只雞采5 mL，分離血清，采用全自動生化分析儀(東芝TBA-2000FR，日本)測定血清中葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)和甲狀腺素(T4)含量以及谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)活性。

1.4.3 腸道組織形態(tài)

于試驗第42天09:00開始，從試驗2每個重復隨機選取2只試驗雞進行屠宰，打開腹腔，分離出十二指腸、空腸和回腸，每段腸段取2 cm，用生理鹽水沖掉內容物，浸入4%的多聚甲醛溶液中常溫保存，以制備石蠟切片。腸道組織經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片和蘇木精-伊紅染色后，在顯微鏡下觀察拍照，使用Case Viewer軟件分析測量小腸絨毛高度和隱窩深度并計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)值。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

試驗數(shù)據(jù)通過Excel 2016初步統(tǒng)計后，使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結 果

2.1 組合蛋白酶對肉仔雞采食偏好性的影響

由表2可知，1～21日齡，各處理肉仔雞對不同飼糧的耗料量之間無顯著差異(P>0.05)；與飼糧Ⅰ相比，肉仔雞對飼糧Ⅱ、飼糧Ⅲ和飼糧Ⅳ的采食次數(shù)、總采食時間和每頓采食時間也均無顯著差異(P>0.05)。22～42日齡，雖然耗料量隨著肉仔雞的生長而增加，各處理肉仔雞對不同飼糧的耗料量之間仍無顯著差異(P>0.05)；且與飼糧Ⅰ相比，肉仔雞對飼糧Ⅱ、飼糧Ⅲ和飼糧Ⅳ的采食次數(shù)、總采食時間和每頓采食時間也均無顯著差異(P>0.05)。

表2 組合蛋白酶對肉仔雞采食偏好性的影響Table 2 Effects of combinatorial protease on feed intake preference of broilers

續(xù)表2項目 Items飼糧 DietsⅠⅡⅢⅣ總采食時間 Total feed intake time/[min/(只·d)]105.56±12.48115.78±14.42105.72±18.07106.89±13.1322～42日齡 22 to 42 days of age耗料量 Feed consumption/[g/(只·d)]192.22±41.01202.22±36.50213.89±41.21207.22±37.68采食次數(shù) Feed intake times/[次/(只·d)]8.67±0.978.33±0.978.44±0.988.28±0.89每頓采食時間 Feed intake time per meal/[min/(只·d)]18.87±2.8019.67±2.6619.42±2.7919.79±2.26總采食時間 Total feed intake time/[min/(只·d)]110.17±16.39116.06±15.67107.78±15.48112.39±12.83

由圖1可知，1～21日齡，各處理肉仔雞對4種飼糧的采食百分比分別為23.4%、23.4%、25.3%和27.9%，各處理間無顯著差異(P>0.05)。22～42日齡，各處理肉仔雞對4種飼糧的采食百分比分別為22.6%、32.1%、23.3%和22.0%，其中處理Ⅱ的采食百分比顯著高于其他3個處理(P<0.05)。1～42日齡，各處理肉仔雞對4種飼糧的采食百分比之間雖無顯著差異(P>0.05)，但處理Ⅱ達到27.8%，比處理Ⅰ、處理Ⅲ和處理Ⅳ更高(分別為23.0%、24.3%和24.9%)。

數(shù)據(jù)柱標注無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。Data columns with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.圖1 組合蛋白酶對肉仔雞采食百分比的影響Fig.1 Effects of combinatorial protease on feed intake percentage of broilers

2.2 組合蛋白酶對肉仔雞血清生化指標的影響

由表3可知，21日齡時，各組肉仔雞血清ALB、T3和T4含量以及ALT、AST和ALP活性之間均無顯著差異(P>0.05)；Ⅳ組血清TP、GLB、TC、HDL-C和LDL-C含量最高，其中血清TP、GLB和HDL-C含量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，血清TC和LDL-C顯著高于其他各組(P<0.05)；Ⅰ組血清GLU含量最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。

表3 組合蛋白酶對21日齡肉仔雞血清生化指標的影響Table 3 Effects of combinatorial protease on serum biochemical indices of broilers at 21 days of age

由表4可知，42日齡時，各組肉仔雞血清GLU、ALB、TC、TG、HDL-C、LDL-C和T3含量以及ALT、AST和ALP活性之間均無顯著差異(P>0.05)；Ⅲ組血清TP和GLB含量最高，顯著高于其他各組(P<0.05)；Ⅲ組血清T4含量最低，顯著低于Ⅰ組(P<0.05)。

表4 組合蛋白酶對42日齡肉仔雞血清生化指標的影響Table 4 Effects of combinatorial protease on serum biochemical indices of broilers at 42 days of age

2.3 組合蛋白酶對肉仔雞腸道組織形態(tài)的影響

由表5可知，Ⅱ組和Ⅲ組肉仔雞回腸絨毛高度顯著低于Ⅰ組(P<0.05)；Ⅲ組回腸隱窩深度最低，顯著低于Ⅰ組(P<0.05)；各組回腸V/C值無顯著差異(P>0.05)。Ⅲ組和Ⅳ組肉仔雞空腸隱窩深度顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，空腸V/C值也顯著低于Ⅰ組(P<0.05)。Ⅱ組肉仔雞十二指腸隱窩深度最低，但與Ⅰ組相比差異不顯著(P>0.05)；Ⅱ組十二指腸V/C值最高，顯著高于Ⅰ組和Ⅲ組(P<0.05)。

表5 組合蛋白酶對肉仔雞腸道組織形態(tài)的影響Table 5 Effects of combinatorial protease on intestinal tissue morphology of broilers

3 討 論

3.1 組合蛋白酶對肉仔雞采食偏好性的影響

食物偏好是指有多種食物可選擇時，動物更多地選擇某一種食物，如虎、獅等在捕獲獵物后，大都先獵食動物的內臟。動物對各種飼糧的選擇和采食行為反映著動物的食物偏好，即采食偏好。研究表明，飼糧蛋白質水平會對肉仔雞采食行為產生影響，隨著飼糧蛋白質水平的提高，肉仔雞采食行為占比顯著降低，趴臥行為占比顯著提高[5，10]。蛋白酶具有提高蛋白質利用率的作用，然而本研究中各處理肉仔雞對不同飼糧在耗料量、采食次數(shù)、每頓采食時間及總采食時間上均未表現(xiàn)出顯著差異，這與其他研究結果不同。產生這種不同的原因可能是本試驗為肉仔雞提供了高蛋白質飼糧，無法體現(xiàn)出動物在缺乏蛋白質狀態(tài)下的表現(xiàn)。而本研究中，肉仔雞生長后期(22～42日齡)采食添加4 U/g組合蛋白酶飼糧的采食百分比顯著高于其他飼糧，明顯表現(xiàn)出對該飼糧的偏好，產生這種差別的原因可能是肉仔雞不同生長時期對飼糧的偏好不同，具體原因有待進一步試驗研究。

3.2 組合蛋白酶對肉仔雞血清生化指標的影響

動物機體血液生化指標的變化是反映動物代謝的直觀表現(xiàn)[11-12]。血液中的GLU、TP和ALB是反映機體蛋白質利用率的重要指標，GLB是反映機體免疫的重要指標，TC和TG是機體脂類代謝的重要指標；ALT和AST參與脂類和蛋白質代謝，是反映肝臟和心臟功能的重要指標[13-16]。侯振平等[17]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加蛋白酶對21日齡肉仔雞血清GLU、TP、ALB、GLB、TC和TG含量均無顯著影響。本研究中，飼糧添加組合蛋白酶對21日齡肉仔雞血清ALB含量無顯著影響，這與上述研究結果一致；但飼糧添加組合蛋白酶對21日齡肉仔雞血清GLU、TP、GLB、TC和TG均表現(xiàn)出顯著影響，其中Ⅳ組血清TP、GLB和TC含量顯著高于Ⅰ組，原因可能是高劑量的組合蛋白酶更有利于水解蛋白質，從而提高蛋白質利用率。42日齡時，試驗組肉仔雞血清GLU、ALB、TC和TG含量等與對照相相比均無顯著差異，可能是由于隨著肉仔雞的生長發(fā)育，組合蛋白酶對其吸收營養(yǎng)物質的影響逐漸降低。李東東[7]研究發(fā)現(xiàn)，不同蛋白質水平飼糧添加外源蛋白酶對肉仔雞血清ALT和AST活性無顯著影響，本研究與之結果一致。T3和T4統(tǒng)稱為甲狀腺激素，可以有效反映機體的代謝變化和應激程度，以此反映動物福利狀況[18]。本試驗中，21日齡時，飼糧添加組合蛋白酶對肉仔雞血清T3和T4含量無顯著影響；42日齡時，與對照組相比，Ⅲ組血清T4含量雖然顯著降低，但血清T3含量無顯著差異，而T4在外周血液中，只有轉化成T3才能發(fā)揮其生物學效應，因此組合蛋白酶對肉仔雞機體代謝和應激并未產生顯著影響。

3.3 組合蛋白酶對肉仔雞腸道組織形態(tài)的影響

腸道是吸收各種營養(yǎng)物質的主要器官之一，小腸絨毛是吸收各種營養(yǎng)物質的主要場所。小腸結構和功能的完整性影響著營養(yǎng)物質的消化、吸收和轉運，其中小腸絨毛高度和隱窩深度與腸道生理相關，也是衡量腸道功能的重要指標[19]。小腸絨毛高度與吸收效率有關，絨毛高度增加會增加腸黏膜與食糜接觸的表面積，有利于營養(yǎng)物質的吸收；隱窩深度反映了細胞增殖的速率，隱窩深度變淺表明腸道上皮細胞成熟率上升，腸黏膜上皮絨毛吸收能力增強[20]；而V/C值可以用來反映腸道吸收效率，V/C值升高則腸道吸收營養(yǎng)物質的速率加快，反之則降低。

研究表明，適量酶制劑能提高肉仔雞小腸絨毛高度，過量反而不利于肉仔雞腸道發(fā)育[21-23]。本研究中，Ⅱ組肉仔雞空腸和十二指腸隱窩深度顯著低于Ⅲ組，空腸和十二指腸V/C值顯著高于Ⅲ組；Ⅳ組空腸隱窩深度顯著高于Ⅰ組，空腸V/C值顯著低于Ⅰ組。以上結果表明，在飼糧中添加適量的組合蛋白酶有利于改善肉仔雞腸道組織形態(tài)，過量的蛋白酶反而不利于腸道發(fā)育，這與周梁[22]的研究結果一致。由此可見，在飼糧中添加適量的組合蛋白酶有利于改善肉仔雞腸道組織形態(tài)。不過，本研究中，Ⅰ組肉仔雞回腸絨毛高度顯著高于Ⅱ組和Ⅲ組，組合蛋白酶反而抑制了回腸絨毛高度，這可能與蛋白酶到達回腸時活性降低有關。關于組合蛋白酶的最適添加量及其影響機制仍需進一步試驗研究。

4 結 論

① 肉仔雞僅在其生長后期(22～42日齡)對添加4 U/g組合蛋白酶的飼糧表現(xiàn)出采食偏好性。

② 飼糧添加12 U/g組合蛋白酶顯著提高了21日齡肉仔雞血清TP、GLB、TC、HDL-C和LDL-C含量，改善了機體脂類合成，增強了肉仔雞免疫力；飼糧添加8 U/g組合蛋白酶顯著提高了42日齡肉仔雞血清TP和GLB含量。

③ 飼糧添加4 U/g組合蛋白酶可以提高或維持肉仔雞十二指腸和空腸V/C值，改善肉仔雞腸道組織形態(tài)。

④ 綜合考量，本試驗中組合蛋白酶的適宜添加量為8 U/g。