三烏膠丸HPLC 指紋圖譜及多指標(biāo)成分定量分析研究

羅才琴，肖素蕓，呂 冬，曲 媛,2,3，崔秀明,2,3**，段嫏環(huán)

(1.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省三七資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；3.國(guó)家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系昆明綜合試驗(yàn)站，云南 昆明 650500)

三烏膠丸又稱“云南黑藥”曾與“云南白藥”齊名，傳統(tǒng)用于治療風(fēng)寒濕邪、中風(fēng)偏癱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性肌炎、骨質(zhì)增生等[1].目前，發(fā)現(xiàn)三烏膠丸治療腦卒中后遺癥有效率達(dá)95%以上[2].三烏膠丸由生草烏、生川烏、何首烏、附片、生白附子等 5 種藥材組成，其中黃草烏、川烏、附片為劇毒[3-5]藥材.三烏膠丸中烏頭堿類二萜生物堿既是活性成分也是毒性成分，其中生黃草烏、生川烏等劇毒藥材經(jīng)過(guò)三烏膠丸的處方工藝蒸煮后，其雙酯型毒性較大的生物堿如烏頭堿[6]、滇烏堿等逐漸向單酯型毒性較小的生物堿轉(zhuǎn)化.因此，本研究選取了轉(zhuǎn)化后含量較高且有指標(biāo)意義的烏頭類二萜生物堿作為三烏膠丸的含量控制指標(biāo)，并且同時(shí)測(cè)定了三烏膠丸中佐藥何首烏的指標(biāo)性成分大黃素.

中藥指紋圖譜技術(shù)可對(duì)中藥進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，是國(guó)際公認(rèn)的質(zhì)控可行模式，是中成藥療效的保證[7].目前，相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)三烏膠丸的質(zhì)量控制研究主要集中在單個(gè)藥材或單個(gè)成分的含量測(cè)定[8-9]，未見(jiàn)三烏膠丸的指紋圖譜及多指標(biāo)成分測(cè)定的報(bào)道，不足以控制三烏膠丸的整體質(zhì)量.此外，未見(jiàn)同時(shí)測(cè)定烏頭類生物堿和蒽醌類成分的報(bào)道.基于此，本研究所開(kāi)發(fā)的三烏膠丸HPLC 指紋圖譜的方法，同時(shí)對(duì)15 個(gè)批次的三烏膠丸中包括烏頭類生物堿和大黃素在內(nèi)的6 個(gè)活性成分進(jìn)行含量測(cè)定，為三烏膠丸的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料

1.1 儀器電子天平（AL-104 型，梅特勒?托利多儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)艾卡科技有限公司，IKA-RV3）；高效液相色譜儀（Agilent1260，安捷倫科技有限公司）；超聲波清洗器（KQ-5200E 型，昆山市超聲儀器有限公司）；優(yōu)普系列超純水器(UPTI-20T 型，成都超純科技有限公司)

1.2 材料苯甲酰烏頭原堿（wkq20041505）、苯甲酰次烏頭原堿（wkq20041702）、苯甲酰新烏頭原堿（wkq20041701）購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司.草烏甲素（Yz042122）、8?去乙酰滇烏堿（Yz0201221）、大黃素甲醚（Yz040122）、大黃素（Yz080920）來(lái)源于南京源植生物科技有限公司.磷酸、乙腈為色譜級(jí)，二乙胺、乙醚、石油醚（沸程在30～60 ℃）、氨水為分析純，水為超純水.

1.3 樣品黃草烏Aconitum vilmorinianumKom.為毛茛科烏頭屬多年生草本植物的干燥塊根（產(chǎn)地：云南，批號(hào)：200301）；川烏為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.的干燥母根（產(chǎn)地：陜西，批號(hào)：171201）；附片（黑順片）為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.的子根的加工品（產(chǎn)地：四川，批號(hào)：191002）；何首烏為為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根（產(chǎn)地：云南，批號(hào)：200601）；白附子為天南星科植物獨(dú)角蓮Typhonium giganteumEngl.的干燥塊莖，此處所用為禹白附（產(chǎn)地：四川，批號(hào)：191101）；三烏膠丸（規(guī)格：5 g ×12 袋），批 號(hào)：190651、190906、190907、190908、200602、200603、200604、200901、200902、200903、200606、200607、200608、200611、200612，編號(hào)依次為S1～S15）均由云南金烏黑藥制藥有限公司提供.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件測(cè)定波長(zhǎng)：245 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；色譜分析柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(?4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.2%二乙胺（磷酸調(diào)節(jié)pH 為4.0）水溶液(A)?乙腈(B)，梯度洗脫（0～15 min，10%～20%B；45～55 min，40%～70%B，70～75 min，70%～100%B，85～100 min，100%B）.

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取苯甲酰新烏頭原堿（BMA）、苯甲酰次烏頭原堿（BHA）、苯甲酰烏頭原堿（BA）、8?去乙酰滇烏堿（8-DYA）、草烏甲素（CCA）、大黃素（ED）的對(duì)照品適量，精密稱定，用酸性甲醇（每100 mL 甲醇里面精確加入鹽酸1 mL）配制成含大黃素2 mg/mL，8?去乙酰滇烏堿1.8 mg/mL，草烏甲素2.1 mg/mL，苯甲酰新烏頭原堿2.8 mg/mL，苯甲酰次烏頭原堿1.9 mg/mL，苯甲酰烏頭原堿2.6 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液，待用.

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取三烏膠丸粉末（過(guò)0.356 mm 篩，50 目）1.0 g，加入石油醚5 mL后低溫超聲(250 W，50 kHz)5 min 后，靜置，40 ℃以下?lián)]干石油醚.三烏膠丸殘?jiān)尤氚比芤? mL，潤(rùn)濕；加入乙醚20 mL，稱定質(zhì)量，低溫超聲60 min后，用乙醚補(bǔ)足失量；再同法處理1 次.合并2 次乙醚液，32 ℃以下減壓濃縮揮干，殘?jiān)尤胨嵝约状? mL 溶解，過(guò)有機(jī)系0.45 μm 濾膜，備用.

2.2.3 單味藥和陰性對(duì)照品溶液的制備 按三烏膠丸的處方工藝分別制備三烏膠丸的黃草烏、川烏、附片（黑順片）、何首烏的單味藥樣品和缺黃草烏、缺川烏附子、缺何首烏的陰性對(duì)照品.按照“2.2.2”下的方法對(duì)單味藥樣品及三烏膠丸的陰性對(duì)照品進(jìn)行提取，制成單味藥樣品溶液和陰性對(duì)照品溶液備用.

2.3 三烏膠丸HPLC 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 按本文所述色譜條件連續(xù)進(jìn)針6 次同一份三烏膠丸（批號(hào)：200903）的供試品溶液10 μL，記錄HPLC 圖.以5 號(hào)峰苯甲酰新烏頭原堿（S）為對(duì)照峰，通過(guò)計(jì)算得到18 個(gè)三烏膠丸共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.42%，18 個(gè)三烏膠丸共有特征峰的相對(duì)峰面積的RSD<2.97%，表明本文方法精密度良好.

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 按照本文所述的方法取同一個(gè)批次的三烏膠丸各1.0 g（批號(hào)：200903）制作相同的6 份三烏膠丸供試品溶液，進(jìn)樣上述三烏膠丸樣品溶液6 份10 μL 測(cè)定，記錄HPLC 圖.以5號(hào)峰苯甲酰新烏頭原堿（S）為對(duì)照峰，通過(guò)計(jì)算得到18 個(gè)三烏膠丸共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.45%，18 個(gè)三烏膠丸共有特征峰的相對(duì)峰面積的RSD<3.68%，方法重復(fù)性良好.

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按本文三烏膠丸的色譜條件分別在0、4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)樣同一份三烏膠丸樣品溶液（批號(hào)：200903）10 μL 檢測(cè)，記錄HPLC 圖.以5 號(hào)峰苯甲酰新烏頭原堿（S）為對(duì)照峰，通過(guò)計(jì)算得到18 個(gè)三烏膠丸共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD<1.09%，18 個(gè)三烏膠丸共有特征峰的相對(duì)峰面積的RSD<2.80%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在24 h 內(nèi)，三烏膠丸樣品溶液穩(wěn)定.

2.4 三烏膠丸指紋圖譜的建立

2.4.1 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià) 按本文的色譜條件制備三烏膠丸樣品溶液，進(jìn)樣15 批次三烏膠丸的供試品溶液10 μL(S1～S15)，記錄HPLC圖.對(duì)15 個(gè)批次的三烏膠丸樣品色譜數(shù)據(jù)采取中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行匹配，以S4號(hào)三烏膠丸樣品色譜圖為參照，采取全譜匹配一共標(biāo)定18 個(gè)三烏膠丸共有特征色譜峰，生成如圖1所示的三烏膠丸共有模式R.經(jīng)軟件分析計(jì)算15批樣品相對(duì)于對(duì)照指紋圖譜R 的相似度分別為0.944、0.978、0.952、0.936、0.967、0.951、0.947、0.935、0.988、0.958、0.980、0.962、0.987、0.978、0.952，均大于0.9，說(shuō)明各樣品之間具有良好的一致性，指紋圖譜疊加圖譜及共有模式見(jiàn)圖1.

圖1 15 批三烏膠丸 HPLC 指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜（R）Fig.1 HPLC fingerprints and reference fingerprint(R)of 15 batches of Sanwujiaowan

2.4.2 色譜峰的指認(rèn)、歸屬 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及單味藥溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行依次進(jìn)樣，色譜如圖2 所示.通過(guò)與混合對(duì)照品進(jìn)行對(duì)比，指認(rèn)出其中的6 個(gè)共有色譜峰，分別為：5 號(hào)峰苯甲酰烏頭原堿，6 號(hào)峰苯甲酰新烏頭原堿，7 號(hào)峰苯甲酰次烏頭原堿，8 號(hào)峰8?去乙酰滇烏堿，11 號(hào)峰為草烏甲素，12 號(hào)峰大黃素；將各單味藥材色譜圖與三烏膠丸樣品色譜圖比對(duì)分析（圖3）得：峰4、8、9、11、14 來(lái)自黃草烏，峰5、6、7、14 來(lái)自于川烏，峰12、13 來(lái)源于何首烏，峰16、17、18 來(lái)源于乳香，峰5、6、7、14 來(lái)源于黑順片.

圖2 混合對(duì)照品、三烏膠丸樣品色譜圖Fig.2 HPLC diagram of mixed reference substance and Sanwjiaowan sample

圖3 三烏膠丸樣品和單味藥色譜圖Fig.3 HPLC diagram of single herbs and Sanwujiaowan sample

2.5 三烏膠丸中6 種成分的含量測(cè)定

2.5.1 專屬性分析 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、三烏膠丸陰性對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分析，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖4.由圖4可知，陰性樣品色譜在與對(duì)照品相應(yīng)保留時(shí)間位置上無(wú)色譜峰，表明對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，方法專屬性良好.

圖4 混合對(duì)照品、三烏膠丸樣品及陰性樣品的HPLC 圖Fig.4 HPLC diagram of mixed reference substance,Sanwujiaowan sample and negative sample

2.5.2 線性關(guān)系的考察 精密吸取用酸性甲醇稀釋至2 倍、4 倍、20 倍、100 倍、200 倍的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，按本研究三烏膠丸指紋圖譜的色譜條件檢測(cè)草烏甲素等6 個(gè)待測(cè)化合物的峰面積.以混合標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，6 個(gè)待測(cè)化合物的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，計(jì)算各個(gè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，求得6 個(gè)待測(cè)化合物的回歸方程及線性范圍.以信噪比S/N的3 倍作為檢出限，S/N的10 倍作為定量限，如表1 所示.

表1 6 個(gè)成分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab.1 The regression equation，correlation coefficients and linear ranges of 6 components

2.5.3 精密度試驗(yàn) 按本文的色譜條件6 次不間斷進(jìn)樣10 μL 上述制得的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，檢測(cè)保留時(shí)間及峰面積.計(jì)算得到6 個(gè)待測(cè)化合物的峰面積的RSD<2.95%，保留時(shí)間的RSD<0.08%，表明本文方法精密度良好.

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一個(gè)批次的三烏膠丸1.0 g（批號(hào)：200903），按照本文所述的方法制作相同的6 份三烏膠丸供試品溶液，取上述6 份三烏膠丸樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣10 μL，記錄三烏膠丸中6 個(gè)待測(cè)化合物的保留時(shí)間和峰面積.計(jì)算得到6 個(gè)待測(cè)化合物的峰面積的RSD<3.05%，保留時(shí)間的RSD<0.24%，表明本文所述的方法的重復(fù)性良好.

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按本研究的三烏膠丸的液相條件分別在0、4、8、12、16、20、24 h 依次進(jìn)樣10 μL 上述制得的三烏膠丸樣品溶液（批號(hào)：200903），測(cè)得保留時(shí)間，測(cè)定峰面積.6 個(gè)化合物的峰面積RSD 分別為大黃素1.01%，苯甲酰次烏頭原堿1.23%，8?去乙酰滇烏堿2.22%，苯甲酰烏頭原堿1.79%，草烏甲素0.57%，苯甲酰新烏頭原堿2.37%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在24 h 內(nèi)，三烏膠丸樣品溶液穩(wěn)定.

2.5.6 加樣回收率 精密稱定6 份已知含量的三烏膠丸（批號(hào)：200903），每份1.0 g，分別置具塞錐型瓶中，每份依次精確加入含量相當(dāng)?shù)拇簏S素、苯甲酰烏頭原堿、8?去乙酰滇烏堿、苯甲酰次烏頭原堿、草烏甲素、苯甲酰新烏頭原堿的標(biāo)準(zhǔn)品溶液.按本文所述得色譜條件制備樣品溶液，依次進(jìn)樣依次進(jìn)樣10 μL 三烏膠丸樣品溶液，計(jì)算6 個(gè)待測(cè)成分的平均加樣回收率，結(jié)果草烏甲素、苯甲酰烏頭原堿、8?去乙酰滇烏堿、苯甲酰次烏頭原堿、大黃素、苯甲酰新烏頭原堿平均加樣回收率依次為100.3%，98.7%，100.2%，99.2%，98.4%，100.2%，RSD 依次為2.35%，1.97%，1.60%，2.06%，1.66%，1.19%.

2.5.7 QAMS 質(zhì)量評(píng)價(jià)模式相對(duì)校正因子的測(cè)定 取上述2.2.1 項(xiàng)下6 個(gè)待測(cè)成分的不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件記錄各成分的峰面積，以苯甲酰新烏頭原堿（BMA）為內(nèi)參物，采用斜率法和多點(diǎn)校正法計(jì)算6 個(gè)待測(cè)成分間的相對(duì)校正因子（RCF）.兩種方法的結(jié)果見(jiàn)表2，相對(duì)誤差（RE）<3.0 %，表明上述2 種計(jì)算相對(duì)校正因子的方法無(wú)明顯差異，本研究采取斜率法用于三烏膠丸一測(cè)多評(píng)法的含量.

表2 6 個(gè)待測(cè)成分的相對(duì)校正因子Tab.2 The relative correction factors（RCF）of 6 components to be tested

2.5.8 6 個(gè)待測(cè)成分色譜峰的定位參數(shù)測(cè)定及重復(fù)性考察 通過(guò)公式 RTRi/s=tRi/tRs，計(jì)算5 個(gè)待測(cè)成分與內(nèi)參物苯甲酰新烏頭原堿（BMA）間的相對(duì)保留值（RTRi/s），其中tRi為待測(cè)成分保留時(shí)間，tRs為內(nèi)參物保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 6 個(gè)待測(cè)成分的相對(duì)保留時(shí)間值（n =6）Tab.3 Relative retention values of six components to be tested（n =6）

2.5.9 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較（表4）取15 批三烏膠丸樣品，再按本研究的色譜條件依次進(jìn)樣10 μL 三烏膠丸供試品溶液，將6 個(gè)待測(cè)化合物的峰面積代入表2 的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算6 個(gè)化合物的含量（外標(biāo)法）.采取斜率法計(jì)算的相對(duì)校正因子，計(jì)算QAMS 中三烏膠丸中6 個(gè)待測(cè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

表4 ESM 與QAMS 測(cè)定三烏膠丸中待測(cè)成分的質(zhì)量比（μg·g?1，n =3）Tab.4 Contents of Sanwujiaowan by external standard method(ESM)and quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS)method(μg·g?1,n =3)

2.6 化學(xué)計(jì)量分析方法參考文獻(xiàn)[10-12].

2.6.1 CA 聚類分析 以15 批三烏膠丸樣品的6 個(gè)待測(cè)化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為變量，運(yùn)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行CA 聚類分析，如圖5 所示.當(dāng)聚類距離為15 時(shí)，15 批三烏膠丸樣品可分為2 類，其中S1～S4 號(hào)樣品被聚為一類，S5～S15 號(hào)樣品被聚為一類，表明各批次的三烏膠丸具有一定的差異性.經(jīng)過(guò)對(duì)比批號(hào)與查閱生產(chǎn)日期發(fā)現(xiàn)，聚類分析結(jié)果表明，三烏膠丸呈現(xiàn)按照生產(chǎn)年限進(jìn)行分類，推測(cè)可能是原料藥的產(chǎn)地及加工過(guò)程中有一定的差異性所造成的.

圖5 15 批三烏膠丸樣品聚類分析圖Fig.5 Clustering analysis of 15 batches of Sanwujiaowan prescription

2.6.2 PCA 主成分分析 將15 批三烏膠丸樣品的6 個(gè)待測(cè)化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)運(yùn)用SPSS 23.0 軟件標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行PCA 主成分分析，三烏膠丸HPLC 指紋圖譜PCA 的特征值、方差貢獻(xiàn)率詳見(jiàn)表5.取三烏膠丸中特征值大于0.99 的前2 個(gè)主成分，其累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)71.535%>70%，可作為三烏膠丸的評(píng)價(jià)指標(biāo).將得到的成分矩陣進(jìn)行最大方差法旋轉(zhuǎn)，得到6 個(gè)指標(biāo)在2 個(gè)主成分中的旋轉(zhuǎn)矩陣，見(jiàn)表6.以6 個(gè)待測(cè)化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后為變量，進(jìn)行向量運(yùn)算，計(jì)算PCA 得分.取上述向量運(yùn)算結(jié)果，繪制主成分得分圖，見(jiàn)圖6.結(jié)果顯示，15 批的三烏膠丸的樣品被分為2 類，其中S1～S4號(hào)樣品聚為第一類，S5～S15 號(hào)樣品被聚為第二類，與聚類分析結(jié)果完全一致.

圖6 15 批三烏膠丸樣品主成分分析得分圖Fig.6 Loading plot of 15 batches of Sanwujiaowan prescription

表5 主成分分析特征值及方差貢獻(xiàn)率Tab.5 The principal component value and contribution rate

表6 三烏膠丸樣品主成分因子旋轉(zhuǎn)載荷矩陣Tab.6 Factor load matrix after rotation transform of Sanwujiaowan

2.6.3 OPLS-DA 偏最小二乘判別分析 以15 批三烏膠丸6 個(gè)待測(cè)化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為變量導(dǎo)入SIMCA 14.0 軟件，進(jìn)行OPLS-DA 建模分析，獲得相應(yīng)的模型，見(jiàn)圖7.15 批三烏膠丸樣品被分為2 類，與主成分分析和聚類結(jié)果一致.采用變量重要性投影（VIP）法篩選導(dǎo)致樣品分類差異較大的標(biāo)志性成分，以VIP>1.0 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出對(duì)三烏膠丸樣品分類貢獻(xiàn)較大的3 個(gè)成分，依次為5 號(hào)色譜峰（苯甲酰新烏頭原堿）、8 號(hào)色譜峰（8?去乙酰滇烏堿）、11 號(hào)色譜峰（草烏甲素），以上3 種物質(zhì)來(lái)自于黃草烏、川烏及黑順片中，導(dǎo)致了不同批次三烏膠丸含量及成分上的差異.

圖7 15 批三烏膠丸樣品的偏最小二乘判別分析得分圖Fig.7 PLS-DA score scatter plot of 15 batches of Sanwu jiaowan

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化本文在研究前期對(duì)流動(dòng)相體系進(jìn)行了考察，考察了乙腈?四氫呋喃（體積比25∶15）（B）?0.1 mol/L 乙酸銨溶液（每1 000 mL 加冰醋酸0.5 mL）（A），乙腈（B）?0.1%的磷酸水溶液（A），甲醇（B）?0.1%的磷酸溶液（A），乙腈（B）?0.1%二乙胺溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH=4.0）（A），乙腈（B）?0.2%二乙胺（磷酸調(diào)節(jié)pH=4.0）（A），乙腈（B）?0.1%三乙胺（磷酸調(diào)節(jié)pH=3.0）（A），對(duì)比各色譜峰的峰型、基線的平穩(wěn)、分離度及拖尾等情況，最終選擇乙腈?0.2%二乙胺（磷酸調(diào)節(jié)pH=4.0）體系.

三烏膠丸中主要活性成分是烏頭類的生物堿，其中黃草烏的主要成分是滇烏堿、草烏甲素等[13-14]，其最佳檢測(cè)波長(zhǎng)是260 nm，而川烏的主要活性成分為烏頭堿等二萜生物堿，其檢測(cè)波長(zhǎng)是235 nm[15-17]，何首烏中大黃素類的檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm[18].故本研究對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其在245 nm 處各峰的分離度很好，峰型最佳，故選擇波長(zhǎng)245 nm 為本文的檢測(cè)波長(zhǎng).

本研究對(duì)流動(dòng)相梯度進(jìn)行了優(yōu)化，在試驗(yàn)了各個(gè)梯度后，最終選擇“2.1”項(xiàng)下的梯度，其峰型較佳，各個(gè)峰之間的分離良好，基線較為平穩(wěn).

3.2 提取溶劑和提取時(shí)間的考察本文前期考察了甲醇、乙醇、異丙醇?乙酸乙酯、乙醚提取對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，最終選擇了乙醚提取法[19].對(duì)提取時(shí)間也進(jìn)行了考察，考察了20、30、40、60 min 時(shí)對(duì)提取效率的影響.選擇提取時(shí)間為60 min，提取方式為低溫超聲提取.

3.3 測(cè)定成分的選擇三烏膠丸的方劑組方遵循了“君、臣、佐、使”的配伍原則，生草烏、生川烏為君藥，附子（黑順片）為臣藥，何首烏為佐藥，冰糖、豬蹄為使藥.生黃草烏、生川烏分別主要含有滇烏堿、烏頭堿等雙酯型烏頭堿，經(jīng)過(guò)三烏膠丸的處方工藝進(jìn)行蒸煮后，主要轉(zhuǎn)換成8?去乙酰滇烏堿、苯甲酰烏頭原堿等單酯型毒性較小的二萜生物堿.本研究根據(jù)三烏膠丸的處方組成及各味藥材的主要功效，考察了君藥黃草烏的指標(biāo)性成分：8?去乙酰滇烏堿、草烏甲素；川烏的指標(biāo)性成分：苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿[20]；佐藥何首烏的指標(biāo)性成分：大黃素的含量.

3.4 三烏膠丸含量測(cè)定結(jié)果分析本文建立了三烏膠丸的指紋圖譜，對(duì)15 個(gè)批次的三烏膠丸的指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果表明其相似度均在0.9 以上，一共確定了18 個(gè)共有峰.以15 批次三烏膠丸的6 個(gè)待測(cè)成分的含量進(jìn)行CA、PCA 和OPLS-DA 化學(xué)計(jì)量分析，均將15 批次的三烏膠丸分為2 類，3 種分析方法結(jié)果保持一致.OPLS-DA分析結(jié)果表明（圖7）苯甲酰新烏頭原堿、8?去乙酰滇烏堿、草烏甲素含量是導(dǎo)致不同批次三烏膠丸差異的主要成分.以上分析結(jié)果均表明S1～S4 號(hào)樣品被聚為第一類，生產(chǎn)于2019 年，S5～S15 號(hào)樣品被聚為第二類，生產(chǎn)于2020 年.表明引起三烏膠丸質(zhì)量差異的原因可能與原藥材的產(chǎn)地、三烏膠丸成品存放的時(shí)間與方式、生產(chǎn)月份的溫度、空氣濕度、天氣情況等都息息相關(guān).本文所建立的方法能較為準(zhǔn)確、科學(xué)、全面地反映三烏膠丸中的化學(xué)成分，不僅為三烏膠丸的質(zhì)量研究提供參考，還可為含有烏頭堿類相似成分如小活絡(luò)丸、木瓜丸、芪藶強(qiáng)心膠囊等質(zhì)量研究提供參考.